Aby skutecznie badać funkcje populacji komórek odpornościowych, często konieczna jest ich puryfikacja. Usuwanie dopełniacza jest szybką i niedrogą techniką izolacji populacji komórek odpornościowych o wysokiej czystości.
Artykuł metodologiczny
Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oczyszczanie populacji komórek odpornościowych jest często niezbędne w celu zbadania ich unikalnych funkcji. W szczególności podejścia molekularne, takie jak real-time PCR i analiza mikromacierzy, wymagają izolacji populacji komórek o wysokiej czystości. Powszechnie stosowane strategie oczyszczania obejmują fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), separację za pomocą kulek magnetycznych oraz usuwanie dopełniacza. Spośród tych trzech strategii usuwanie dopełniacza oferuje zalety w postaci szybkości, niskich kosztów, łagodnego traktowania komórek oraz wysokiej wydajności uzyskiwania komórek. Układ dopełniacza składa się z dużej liczby białek osocza, które po aktywacji inicjują kaskadę proteolityczną, kończącą się powstaniem kompleksu atakującego błonę, który tworzy por na powierzchni komórki, prowadząc do jej śmierci.1Droga klasyczna jest aktywowana przez przeciwciała IgM i IgG i została po raz pierwszy opisana jako mechanizm zabijania bakterii. Dzięki opracowaniu przeciwciał monoklonalnych (mAb), kaskada dopełniacza może być wykorzystana do lizy dowolnej populacji komórek w sposób specyficzny dla antygenu. Deplecja komórek za pomocą kaskady dopełniacza odbywa się poprzez dodanie do wyjściowej populacji komórek przeciwciał specyficznych dla antygenu, wiążących dopełniacz, oraz dopełniacza króliczego. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, a zlizowane komórki są następnie usuwane w dwóch cyklach płukania. Przeciwciała monoklonalne o wysokiej wydajności wiązania dopełniacza zazwyczaj usuwają 95-100% docelowej populacji komórek. W zależności od strategii oczyszczania docelowej populacji komórek, deplecja dopełniaczem może być stosowana do oczyszczania komórek lub do wzbogacania populacji komórek, które mogą być następnie oczyszczane za pomocą kolejnej metody.
Protokół
A. Dopełniacz królika
- Zapasowy dopełniacz króliczy należy rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie rozdzielić na aliquoty o objętości 0,5 i/lub 1 ml i zamrozić w temperaturze -20-80 °C do długotrwałego przechowywania.
- Każdą partię dopełniacza należy poddać miareczkowaniu w celu określenia optymalnego stężenia roboczego. Zazwyczaj optymalne jest rozcieńczenie 1:10-1:20.
- Dopełniacz króliczy nie zawsze jest wysterylizowany przed sprzedażą; w zależności od końcowego zastosowania komórek, dopełniacz powinien zostać wysterylizowany przez filtrację podczas rozdzielania na aliquoty i zamrażania lub przed dodaniem do komórek.
B. Wybór przeciwciał
- Nie wszystkie przeciwciała są skuteczne w aktywacji dopełniacza, dlatego w pierwszej kolejności należy przetestować ich aktywność.
- Zarówno mysie, jak i szczurze przeciwciała mAb są skuteczne w aktywacji dopełniacza.
- Przeciwciała IgM są zazwyczaj najwydajniejsze w indukowanej dopełniaczem lizie komórek, a następnie przeciwciała IgG. Izotypy IgG najlepiej aktywujące dopełniacz różnią się w zależności od gatunku.
- Każde przeciwciało należy miareczkować w celu optymalnego zastosowania przy gęstości komórek 107 komórek/ml.
C. Protokół podstawowy
- Dostosuj początkową populację komórek do stężenia 5 x 107 komórek/ml w pożywce zawierającej inaktywowaną termicznie FCS. Końcowa objętość komórek będzie dwukrotnością objętości początkowej. Należy pamiętać o odłożeniu części komórek w celu ilościowego określenia stopnia ich usunięcia.
- Każde przeciwciało należy dodać do zawiesiny komórkowej w odpowiednim, wcześniej ustalonym stężeniu lub rozcieńczeniu. Dobrze wymieszaj komórki poprzez odwracanie probówki.
- Oblicz wymaganą ilość dopełniacza. Rozmroź zapas dopełniacza w temperaturze pokojowej. Jeśli dopełniacz nie jest sterylny, wysterylizuj go za pomocą filtra strzykawkowego o niskim wiązaniu białek. Przed dodaniem dopełniacza do strzykawki dodaj kilka ml pożywki, a następnie przefiltruj zawartość bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i przeciwciało.
- Dostosuj końcową objętość w probówce tak, aby stężenie komórek wynosiło 1 x 107 komórek/ml.
- Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, mieszając co 15 minut.
- Odwiruj komórki i odlej nadsącz.
- Przemyj komórki dwukrotnie pożywką. Pozostałości komórkowe będą przylegać do ścianek probówek polistyrenowych. Martwe komórki i debris można usunąć za pomocą sitka komórkowego lub poprzez wirowanie w gradiencie gęstości.
- Sprawdź czystość komórek, porównując populację komórek docelowych przed i po usunięciu. Cytometria przepływowa oraz immunohistochemia to dwie skuteczne metody określania czystości komórek.
Reprezentatywne wyniki
Przy zastosowaniu przeciwciała mAb o wysokiej wydajności aktywacji dopełniacza, deplecja komórek po jednej rundzie przekracza 95%. Przedstawiono to na Rysunku 1, gdzie rozpoczęto od splenocytów mysich składających się w 32,2% z limfocytów T αβ, co wykryto poprzez ekspresję TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) metodą cytometrii przepływowej. Przeprowadzono deplecję limfocytów T przy użyciu przeciwciała mAb specyficznego dla Thy1, białka eksprymowanego przez wszystkie limfocyty T, ale nie przez inne leukocyty. Zastosowano przeciwciało Y-19, będące rat IgG2c2. Zgodnie z opisaną procedurą, populacja TCRβ została zredukowana do 1,56%, co stanowi redukcję o ponad 95%.
Rysunek 1. Deplecja limfocytów T śledziony thy1+ poprzez aktywację dopełniacza. Całkowitą populację splenocytów mysich uzyskano poprzez homogenizację śledziony i lizę RBC. Przeciwciała anty-thy1 oraz dopełniacz z krwi królika w określonych stężeniach dodano do zawiesiny pojedynczych komórek splenocytów w taki sposób, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1 x 107 cells/ml. Po inkubacji przez 1 hour w 37 °C komórki przemyto dwukrotnie i oceniono żywotność za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu. Efektywność deplecji oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, porównując odsetek komórek TCRβ+ przed deplecją (panel lewy) i po deplecji (panel prawy). Pozioma belka wskazuje na barwienie pozytywne, a liczba nad belką oznacza procent komórek pozytywnych.
Dyskusja
Oczyszczanie populacji komórek jest powszechną procedurą niezbędną do badania ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy szybką i skuteczną metodę usuwania określonych populacji komórek z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla antygenu oraz deplecji dopełniaczem. Usunięcie dowolnej populacji komórek jest możliwe, jeśli dostępny jest przeciwciało aktywujące dopełniacz, specyficzne dla markera danej linii komórkowej. Wykazaliśmy tutaj usunięcie limfocytów T przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (mAb) specyficznego dla Thy1, białka ekspresyowanego przez niemal wszystkie populacje limfocytów T. Usunęliśmy ponad 95% limfocytów T αβ, a odsetek pozostałych splenocytów wzrósł z 68% do 98%. Taki poziom czystości komórek jest porównywalny z innymi strategiami oczyszczania, w tym FACS i separacją za pomocą kulek magnetycznych. Deplecja dopełniaczem jest szybką techniką, którą można przeprowadzić w ciągu 1,5 godziny po uzyskaniu początkowej populacji komórek. Inną zaletą deplecji dopełniaczem jest to, że technika ta może być wykonana w każdym laboratorium, ponieważ nie wymaga ona drogiego sprzętu i odczynników. Jedynymi niezbędnymi urządzeniami są łaźnia wodna i wirówka. Dopełniacz króliczy można nabyć od wielu dostawców w przystępnej cenie (patrz tabela odczynników), a wiele przeciwciał mAb można kupić w ATTC i hodować lokalnie w celu ograniczenia kosztów. W przeciwieństwie do tego, FACS wymaga cytometru przepływowego z funkcją sortowania komórek, którego koszt sięga setek tysięcy dolarów, oraz drogich przeciwciał mAb znakowanych fluorescencyjnie. Separacja za pomocą kulek magnetycznych jest umiarkowanie cenna, ale wymaga zakupu magnesu i kulek magnetycznych, co może być kosztowne. Ponadto niektóre strategie separacji magnetycznej wymagają również zakupu kolumn.
Główną przeszkodą w wykorzystaniu układu dopełniacza do deplekcji komórek jest dostępność przeciwciał monoklonalnych (mAb) aktywujących dopełniacz o wymaganej swoistości antygenowej. Chociaż przeciwciała ludzkie, mysie i szczurze posiadają zdolność do wiązania dopełniacza, niektóre izotypy są skuteczniejsze od innych. Mimo że IgM ze wszystkich trzech gatunków wykazuje wysoką skuteczność w wiązaniu dopełniacza, izotypy IgG różnią się między sobą. W związku z tym każde przeciwciało mAb musi zostać najpierw przebadane w badaniu pilotażowym w celu określenia jego efektywności. W przypadku przeciwciał o niskiej wydajności można przeprowadzić dwie rundy deplekcji dopełniaczem bez wpływu na żywotność pozostałych populacji komórek. W celu ograniczenia kosztów należy przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał w celu uzyskania optymalnej skuteczności. Ponadto stosowane przeciwciała nie muszą być oczyszczone. Nadnadczynki hybridoma oraz płyn z brzucha są równie skuteczne, co jest szczególnie wygodne w przypadku przeciwciał IgM, które są trudne do oczyszczenia. Podobnie jak w przypadku przeciwciał, niezbędne jest przeprowadzenie miareczkowania dopełniacza w badaniu pilotażowym. Zbyt wysokie stężenie doprowadzi do utraty żywotności populacji komórek niecelowych. Ważne jest również, aby czas inkubacji nie przekraczał 60 minut.
W naszym protokole inkubujemy przeciwciało i dopełniacz wspólnie. Komórki można jednak znakować przeciwciałem przez 15-30 minut i przemyć przed dodaniem dopełniacza. Stosując tę strategię, należy przeprowadzać inkubacje z przeciwciałami w lodzie, aby zapobiec utracie antygenu z powierzchni komórki, co w przypadku niektórych białek zachodzi poprzez procesy patchingu, cappingu lub internalizacji receptorów. Choć metoda ta jest wysoce wydajna, główną wadą deplekcji dopełniaczem w porównaniu z innymi metodami jest to, że nie może być ona stosowana do selekcji pozytywnej. Utrudnia to zatem uzyskanie subpopulacji komórek. Na przykład trudno byłoby oddzielić komórki B strefy marginalnej od komórek B pęchechowych, co najlepiej wykonać za pomocą FACS. W takiej sytuacji aktywację dopełniacza można wykorzystać do deplekcji limfocytów T, aby zmniejszyć liczbę sortowanych komórek. Strategia ta skróciłaby czas sortowania, co pozwoliłoby zaoszczędzić środki i byłoby mniej obciążające dla komórek.
Ponieważ oczyszczanie specyficznych populacji komórek jest powszechnie stosowanym wymogiem, opracowano szereg strategii. Głównymi zaletami strategii usuwania dopełniacza są jej przystępność cenowa, prostota techniczna oraz oszczędność czasu.
Podziękowania
Chciałbym podziękować Sreemanti Basu za dostarczenie danych do Ryciny 1. Praca ta była częściowo finansowana z grantu NIH AI069358 oraz przez BloodCenter Research Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| dopełniacz z krwi królików w wieku 3-4 tygodni | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | |
| Kąpiel wodna | Różne | różne | Można również użyć inkubatora ustawionego na 37 °C. |
Bibliografia
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
Przedruki i uprawnienia
