Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek z jamy otrzewnej myszy

146.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1488

⸱

28 stycznia 2010

 , 
1BloodCenter of Wisconsin, Blood Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Jama otrzewnowa u ssaków zawiera różne populacje komórek odpornościowych, które są kluczowe dla wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. Do biochemicznych i funkcjonalnych analiz tych komórek niezbędna jest wydajna metoda izolacji. W niniejszej pracy przedstawiamy kompleksową metodę izolacji komórek jamy otrzewnowej u myszy.

Streszczenie

Jama otrzewna to wyścielona błoną i wypełniona płynem jama brzuszna ssaków, w której znajdują się wątroba, śledziona, większość przewodu pokarmowego oraz inne narządy wewnętrzne. Zamieszkuje ona szereg komórek odpornościowych, w tym makrofagi, limfocyty B i limfocyty T. Obecność dużej liczby naiwnych makrofagów w jamie otrzewnej sprawia, że jest ona preferowanym miejscem pozyskiwania naiwnych makrofagów tkankowych (1). Jama otrzewna jest również istotna dla badań nad limfocytami B ze względu na obecność unikalnej subpopulacji limfocytów B rezydujących w jamie otrzewnej, znanych jako komórki B1, oprócz konwencjonalnych komórek B2. Komórki B1 dzielą się na komórki B1a i B1b, które można rozróżnić na podstawie ekspresji powierzchniowej CD11b i CD5. Komórki B1 są ważnym źródłem naturalnych IgM, zapewniającym wczesną ochronę przed różnymi patogenami (2-4). Komórki te są z natury autoreaktywne (5), jednak mechanizmy ich kontroli zapobiegające autoimmunizacji nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Przeciwnie, CD5+Komórki B1a posiadają pewne właściwości regulacyjne dzięki swojej zdolności do produkcji IL-10 (6). W związku z tym limfocyty B1 z jamy otrzewnej stanowią interesującą populację komórek do badań ze względu na ich zróżnicowaną funkcję oraz wiele nierozwiązanych kwestii związanych z ich rozwojem i regulacją. Izolacja komórek odpornościowych rezydujących w jamie otrzewnej jest trudna z powodu braku zdefiniowanej struktury wewnątrz tej jamy. Nasz protokół opisuje procedurę pozyskiwania żywych komórek odpornościowych z jamy otrzewnej myszy, które następnie mogą zostać wykorzystane do analizy fenotypowej metodą cytometrii przepływowej oraz do różnych testów biochemicznych i immunologicznych.

Protokół

  1. Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące elementy:
    • Lód
    • Strzykawka 5ml z igłą 27g
    • Strzykawka 5ml z igłą 25g
    • Blok styropianowy i piny do unieruchomienia myszy
    • Taca, na której można umieścić blok montażowy
    • Nożyczki i pęseta
    • Probówki do zbierania próbek
    • 70% etanol
    • PBS z 3% płodową surowicą cielęcą (FCS) (Wstępnie schłodzony i przechowywany w lodzie)
  2. Uśmierć mysz, spryskaj ją 70% etanolem i unieruchom na bloku styropianowym na grzbiecie.
  3. Za pomocą nożyczek i pęsety przetnij zewnętrzną skórę otrzewnej i ostrożnie odsun ją, aby odsłonić wewnętrzną wyściółkę jamy otrzewnej.
  4. Wstrzyknij 5 ml lodowatego PBS (z 3% FCS) do jamy otrzewnej, używając igły 27g. Wprowadzaj igłę powoli do otrzewnej, uważając, aby nie przebić żadnego z organów.
  5. Po wstrzyknięciu delikatnie masuj otrzewną, aby uwolnić przytwierdzone komórki do roztworu PBS.
  6. Wprowadź do otrzewnej igłę 25 g (skosem do góry) przymocowaną do strzykawki 5 ml i zbierz płyn, delikatnie przesuwając końcówkę igły, aby uniknąć zapchania przez tkankę tłuszczową lub inne organy. Zbierz jak najwięcej płynu, a po odłączeniu igły od strzykawki przelej zebraną zawiesinę komórkową do probówek przechowywanych w lodzie.
    Opcjonalnie: Powtórz kroki 4-6
  7. Wykonaj nacięcie w wewnętrznej skórze otrzewnej i, podtrzymując skórę pęsetą, użyj plastikowej pipety Pasteura, aby zebrać pozostały płyn z jamy.
  8. Jeśli w kroku 6 lub 7 zostanie wykryte widoczne zanieczyszczenie krwią, zanieczyszczoną próbkę należy odrzucić.
  9. Wiruj zebraną zawiesinę komórkową przy 1500 RPM przez 8 minut, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w wybranym medium lub PBS w celu ich policzenia.

Alternatywny protokół otrzymywania makrofagów indukowanych tioglikolanem:

Metoda ta jest stosowana w celu uzyskania wyższej wydajności makrofagów.

  1. Wstrzyknij 5 ml 3% (w/v) podłoża tioglikolanowego Brewera (7) do jamy otrzewnowej każdej myszy.
  2. Odczekaj 3-5 dni, a następnie przejdź do kroku 1 opisanego powyżej w celu pobrania komórek.

W porównaniu do metody bez stymulacji można zebrać około 10 razy więcej makrofagów. Jedyną kwestią jest to, że makrofagi uzyskane tą procedurą różnią się niektórymi właściwościami fizjologicznymi.

Reprezentatywne wyniki:

Z niepoddanego manipulacjom myszy, przy zastosowaniu odpowiedniego protokołu izolacji, można uzyskać od 5 do 10 milionów komórek jamy otrzewnej. Wśród wszystkich żywych komórek 50-60% stanowią limfocyty B, ~30% makrofagi oraz 5-10% limfocyty T (Ryc. 1).

Analiza fenotypu komórek, wykresy rozrzutu cytometrycznego, limfocyty B i T, identyfikacja makrofagów, jama otrzewnowa.
Rysunek 1. Fenotyp komórek izolowanych z jamy otrzewnowej. Po izolacji komórek z jamy otrzewnowej barwiono je przeciwciałami anti-mouse TCRβ-FITC, B220-PE-Texas red, CD11b-Pacific blue, CD23-PE-Cy7 oraz CD5-APC. Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiają odsetki limfocytów B i T (a), makrofagów (b), komórek B1 i B2 (c) oraz komórek B1a i B1b (d).

Dyskusja

Izolacja komórek z jamy otrzewnej jest istotną techniką w badaniu różnych komórek odpornościowych, przede wszystkim makrofagów oraz specyficznych subpopulacji limfocytów B. Choć jest to proces prosty, wiąże się on z kilkoma krytycznymi etapami. Aby uzyskać czystą populację komórek z jamy otrzewnej, należy unikać obecności zanieczyszczającej krwi w pobranej próbce. Eutanazję poprzez zwichnięcie stawów kręgowych szyi należy przeprowadzić ostrożnie, aby zapobiec przedostaniu się krwi do jamy otrzewnej. Alternatywnie można zastosować CO2. Ponadto podczas procedury należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić pęcherza moczowego ani żadnego innego organu w jamie otrzewnej. Odzyskanie większości wstrzykniętego płynu jest również istotne dla uzyskania wysokiej wydajności komórek.

Procedura ta jest powszechnie stosowana w badaniach nad biologią makrofagów, ponieważ z jamy otrzewnej można łatwo uzyskać umiarkowaną liczbę rezydentnych, niestymulowanych makrofagów, co stanowi alternatywę dla żmudnego procesu różnicowania mieloidalnych komórek progenitorowych w dojrzałe makrofagi in vitro przy użyciu czynnika stymulującego kolonie makrofagów (8,9). Wydajność uzyskiwania makrofagów z jamy otrzewnej można zwiększyć, stosując metodę wywoływania tioglikolanem, choć użycie tioglikolanu może zmienić właściwości fizjologiczne makrofagów (7).

Limfocyty B stanowią istotną część naszego układu odpornościowego, odgrywając kluczowe role zarówno w odporności wrodzonej, jak i nabytej. Wśród różnych subpopulacji limfocytów B, komórki B1 stanowią unikalny podzbiór zaangażowany w odporność wrodzoną, autoimmunizację oraz regulację immunologiczną. Limfocyty B1 znajdują się głównie w jamie otrzewnowej i ulegają samoodnowie. Są one jednym z głównych producentów naturalnego IgM, który zapewnia pierwszą linię ochrony przed licznymi wirusami i bakteriami (10-12). Limfocyty B1 są również głównym źródłem IL-10 (6), która jest ważną cytokiną zaangażowaną w regulację immunologiczną. Mimo przeprowadzenia wielu badań nad komórkami B1, wciąż istnieje przestrzeń do dalszej oceny ich przeciwstawnych funkcji, w szczególności ich roli regulacyjnej. Metoda izolacji komórek z jamy otrzewnowej daje unikalną możliwość badania funkcji limfocytów B1.

Podziękowania

Praca ta była częściowo finansowana z grantu NIH nr AI069358 oraz przez BloodCenter Research Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka tioglikolanowa, modyfikacja BreweraBD Biosciences211716

Bibliografia

  1. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  2. Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
  3. Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
  4. Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
  5. Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
  6. O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
  7. Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
  8. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
  10. Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
  11. Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
  12. Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rekcytometria przep ywowaliczenie kom r w komorze countingowejwstrzykiwanie PBSmasa otrzewnejprzemywanie kom rekprotok wirowaniaanaliza limfocyt w B

Powiązane artykuły