Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Streszczenie

Pełny wgląd w mechanizmy działania żywych komórek można uzyskać jedynie poprzez badanie kluczowych procesów, które wywołują i kierują zdarzeniami na poziomie komórkowym. Do tej pory ogromna złożoność systemów biologicznych sprawiała, że precyzyjne eksperymenty na poziomie pojedynczych cząsteczek były zbyt wymagające, co prowadziło do koncentrowania się na badaniach pojedynczych układów z wykorzystaniem stosunkowo mało precyzyjnych pomiarów uśrednionych dla całej populacji (bulk ensemble-average measurements). Jednak wiele istotnych procesów w żywej komórce zachodzi na poziomie zaledwie jednej lub kilku cząsteczek; pomiary populacyjne zazwyczaj maskują stochastyczny i heterogeniczny charakter tych zdarzeń. W niniejszej pracy, wykorzystując zaawansowaną mikroskopię optyczną oraz analityczne narzędzia analizy obrazu, demonstrujemy sposób monitorowania białek w pojedynczej żywej komórce bakteryjnej z precyzją na poziomie pojedynczych cząsteczek, a także sposób obserwacji dynamiki w obrębie kompleksów molekularnych w funkcjonujących maszynach biologicznych. Zastosowane techniki mają bezpośrednie znaczenie fizjologiczne. Są one minimalnie perturbujące i nieinwazyjne dla badanej próbki biologicznej oraz w pełni dostosowane do badań materiału żywego, co nie jest łatwo dostępne w innych biofizycznych podejściach do badania pojedynczych cząsteczek. Ponadto wszystkie badane preparaty biologiczne produkują białko znakowane fluorescencyjnie na poziomach niemal identycznych z tymi w niemodyfikowanych szczepach komórkowych („kodowanie genomiczne”), w przeciwieństwie do częściej stosowanego, lecz mniej idealnego podejścia polegającego na generowaniu znacznie większej ilości białka niż występuje to naturalnie („ekspresja plazmidowa”). Dzięki temu badane próbki biologiczne są znacznie bliższe naturalnym organizmom, a tym samym obserwacje są bardziej istotne dla rzeczywistych procesów fizjologicznych.

Protokół

1. Aby rozpocząć tę procedurę, 50 μl zamrożonych zapasów komórek bakteryjnych Escherichia coli ekspresujących białka fluorescencyjne należy najpierw rozmrozić i hodować tlenowo z wytrząsaniem w 5 ml pożywki LB przez noc w temperaturze 37 °C. Rano 50 μl tej nasyconej kultury należy pobrać i przesiać do minimalnej pożywki M63 z glukozą, inkubując w temperaturze 30 °C przez 4 do 6 godzin. W tym przypadku demonstrujemy użycie dwóch różnych szczepów komórek, z których jeden ekspresuje cytochrom transportujący elektrony połączony z GFP, a drugi białko zaangażowane w bakteryjny silnik wiciowy połączone z GFP.
2. Komórki można zebrać bezpośrednio z rosnącej subkultury, jeśli mają być badane jako próbki unieruchomione, lub można je poddać ścinaniu w celu skrócenia wici bakteryjnych, jeśli mają być badane w warunkach „przypięcia” (tethered).
3. Ścinanie polega na umieszczeniu zazwyczaj 1-5 ml subkultury w urządzeniu składającym się z dwóch sterylnych strzykawek połączonych sterylnym przewodem. Ścinanie odbywa się poprzez naprzemienne naciskanie tłoków każdej strzykawki, aby przepchnąć kulturę przez wąską rurkę. Czynność tę wykonuje się 50-100 razy, w zależności od wymaganego stopnia ścinania. Następnie kulturę wiruje się w celu osadzenia komórek, które następnie zawiesza się ponownie w pożywce minimalnej w celu usunięcia fragmentów wici.
4. Przygotowujemy oczyszczone szkiełka nakrywkowe BK7 poprzez zanurzenie ich w nasyconym roztworze KOH w etanolu na 20 min, a następnie dokładne wypłukanie w wodzie dejonizowanej i etanolu oraz pozostawienie do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 1 h.
5. Konstruujemy prostą komorę przepływową (flow-cell), aby umieścić komórki w mikroskopie. Polega to na narysowaniu linii z parafiny na szkiełku mikroskopowym BK7, a następnie stworzeniu „tunelu-kanapki” poprzez nałożenie na górze jednej z oczyszczonych nakrywek i delikatne dociśnięcie jej pęsetą, co daje objętość komory przepływowej wynoszącą 5-10 μl.
6. Aby obserwować komórki unieruchomione, wypełniamy komorę przepływową poprzez iniekcję 0,1% w/v roztworem poli-L-lizyny i inkubujemy w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 min. Następnie wypłukujemy komorę, używając 100 μl pożywki minimalnej, wstrzykując pożywkę z jednego końca komory przepływowej i odsączając ją papierem tkankowym z drugiego końca.
7. Następnie odsączamy 20 μl rozcieńczenia 1:500 mikrosfer lateksowych o średnicy 200 nm (Polysciences) w pożywce minimalnej, aby oznakować powierzchnię nakrywki. Komorę przepływową odwraca się tak, aby nakrywka była skierowana w dół, umieszcza na platformie oddalonej od powierzchni w prostej komorze wilgotnościowej i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 5 min. Niezwiązane koraliki są następnie usuwane poprzez odsączanie 100 μl pożywki minimalnej.
8. Jeśli chcemy obserwować komórki przypięte, pomijamy etap z poli-L-lizyną, a zamiast tego wypełniamy komorę przepływową przeciwciałem antyflagellinowym w stężeniu 5 mg/ml. Komorę przepływową umieszcza się w komorze wilgotnościowej na 10 min, a następnie wypłukuje poprzez odsączanie.
9. Następnie przez komorę przepływową odsącza się 20 μl kultury komórkowej, używając próbki ściętej w przypadku obserwacji komórek przypiętych lub próbki nieściętej przy obserwacji komórek unieruchomionych.
10. Komorę przepływową odwraca się i umieszcza w komorze wilgotnościowej na 20 min. Niezwiązane komórki są następnie wypłukiwane poprzez odsączanie 100 μl pożywki minimalnej.
11. Kroplę olejku immersyjnego umieszcza się w centrum górnej powierzchni nakrywki, a następnie komorę przepływową delikatnie kładzie się na uchwycie próbek specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego, zapewniając kontakt optyczny z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej.
12. Włącza się kamerę z mnożeniem elektronów w mikroskopie i ustawia chłodzenie kamery na -70 °C. Oprogramowanie ustawia się na akwizycję obrazów przy typowej częstotliwości klatek 25 Hz w trybie transferu klatek, początkowo wyłączając kontrolę wzmocnienia w kamerze.
13. Włącza się oświetlenie w polu jasnym i ustawia ostrość obrazu, wybierając odpowiednią komórkę lub grupę komórek do obrazowania na podstawie tego, czy są one przytwierdzone z osią długą równolegle do powierzchni nakrywki. Ostrość jest precyzyjnie regulowana, aby upewnić się, że koraliki lateksowe 200 nm przytwierdzone do powierzchni nakrywki są dokładnie w ostrości.
14. Sekwencja obrazów jest pozyskiwana w polu jasnym, aby zarejestrować obrys ciała komórki. Oświetlenie w polu jasnym zostaje wyłączone, a wzmocnienie kamery ustawione na maksimum.
15. W przypadku standardowej akwizycji z wykorzystaniem fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (lub TIRF), wiązka lasera o odpowiedniej długości fali (tutaj, do wzbudzenia zielonego białka fluorescencyjnego używamy lasera 473 nm) jest wstępnie ustawiona tak, aby była ogniskowana w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, ale przesunięta bocznie z osi optycznej, aby wygenerować pole ewanescentne do wzbudzenia fluorescencji w próbce komórkowej.
16. Uruchamia się akwizycję kamery i otwiera migawkę lasera, aby wzbudzić białka fluorescencyjne wewnątrz bakterii. Parametry natężenia lasera i szybkości akwizycji muszą zostać zoptymalizowane dla konkretnego badanego systemu biologicznego poprzez eksperymentowanie z różnymi wartościami, ale typowy zakres istotny dla badania mobilnych kompleksów białkowych w błonie komórkowej to moc lasera 1-10 mW w okrągłym obszarze wzbudzenia o średnicy ~30 μm, z czasem ekspozycji na klatkę od 5-40 ms. Próbki są naświetlane aż do fotowyblaknięcia, zazwyczaj przez ~10 s.
17. Ten protokół może być stosowany zarówno dla komórek przypiętych, w których ciało komórki obraca się wokół punktu przyczepienia między nakrywką a kikutem wici, jak i dla komórek unieruchomionych, które są sztywno przymocowane do powierzchni nakrywki.
18. Niektóre szczepy komórek o wysokiej liczbie kopii kompleksów zyskują na wstępnym, ograniczonym dyfrakcyjnie wyblaknięciu laserowym jednego bieguna komórki przed obrazowaniem TIRF. Wyblaknięcie to jest równoważne z tym stosowanym w metodzie powrotu fluorescencji po fotowyblaknięciu (lub FRAP). W naszym specjalistycznym mikroskopie część światła lasera wzbudzającego może być odprowadzona do drugiej niezależnej ścieżki używanej do wyblaknięcia typu FRAP. Zazwyczaj stosuje się moc lasera 1-10 mW, a typowy czas wyblaknięcia mieści się w zakresie 10-300 ms. Skutkuje to znacznie wyższym kontrastem obrazowania w strefie wyblakłej komórki, co pozwala na łatwiejszą wizualizację pojedynczych kompleksów, które następnie dyfundują do tego obszaru.
19. Do wizualizacji kompleksów w cytoplazmie komórki, które dyfundują znacznie szybciej niż te w błonie komórkowej, stosuje się inny tryb oświetlenia zwany „slimfield”. Tutaj skupiona wiązka lasera jest rozszerzana bocznie tak, aby objąć tylko jedną komórkę. Tworzy to bardzo intensywne pole, pozwalające na wykonywanie znacznie krótszych ekspozycji, zazwyczaj rzędu milisekundy.
20. Po akwizycji danych obrazy są przesyłane do specjalnie napisanego oprogramowania (zakodowanego w LabVIEW 8.5). Automatycznie wykrywa ono pozycje fluorescencyjnych plamek w komórkach z precyzją zazwyczaj kilku nanometrów i wyodrębnia ich rozmiar oraz jasność. Jasność śladu fotowyblaknięcia w funkcji czasu śledzonego kompleksu molekularnego jest następnie wykorzystywana do oszacowania stechiometrii, tzn. ile pojedynczych białek fluorescencyjnych tworzy pojedynczy kompleks molekularny.

Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym wykonaniu protokołu obrazy komórek obserwowane w polu jasnym są bardzo wyraźne, z ciemnymi obrysami ciał komórkowych na tle białego/szarego wnętrza (Rycina 1a). W przypadku fluorescencji z wykorzystaniem unieruchomionych komórek widoczne są wyraźne punkty intensywności, zazwyczaj o szerokości 250-300 nm (Rycina 1b). Zdrowe, przytwierdzone komórki będą obracać się wokół punktu przytwierdzenia na obrazach w polu jasnym. Pod wpływem wzbudzenia fluorescencyjnego w punkcie przytwierdzenia mogą być widoczne niektóre kompleksy molekularne, co w naszym przypadku wskazuje na lokalizację znakowanego białka w obrębie silnika wiciowego. Punkty te są pojedynczymi kompleksami molekularnymi, a ich liczba zależy od zastosowanego trybu oświetlenia oraz od tego, ile kompleksów znajduje się w komórce w danym momencie. Mobilność punktów zależy od badanego specyficznego układu biologicznego. Jeśli początkowa gęstość punktów jest bardzo wysoka, co ma miejsce w przypadku zastosowanych tutaj znakowanych cytochromów, przeprowadzenie wstępnego wybielania FRAP może poprawić kontrast obrazowania.

Rycina 1. (A) Obraz w polu jasnym oraz (B) obraz TIRF (fałszywe kolory) unieruchomionej komórki Escherichia coli wykazującej ekspresję białka połączonego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), które jest znane z udziału w pracy silniczków wiciowych bakterii. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję ryciny 1.

Dyskusja

Należy uważać, aby nie doprowadzić do zbyt silnego ścinania komórek podczas obserwacji bakterii przytwierdzonych do podłoża, ponieważ może to upośledzić funkcjonalność silniczków flagellarnych. Ważne jest, aby nie używać komórek dłużej niż przez godzinę po umieszczeniu ich na preparacie mikroskopowym, gdyż może dojść do wyczerpania zapasów tlenu. Może być wymagana znaczna optymalizacja w celu znalezienia najlepszych warunków obrazowania mikroskopowego dostosowanych do konkretnego badanego systemu biologicznego. Wskazane ...