Kariotypowanie jest prostą i użyteczną techniką powszechnie stosowaną do wykrywania zmian genetycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania preparatów rozprzestrzeniających chromosomy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu monitorowania stanu chromosomowego tych komórek utrzymywanych w hodowli.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choć wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) posiadają stabilny diploidalny kariotyp 1, w wielu badaniach doniesiono, że w zależności od warunków hodowli stają się one podatne na nabywanie anomalii chromosomalnych, takich jak dodanie całych chromosomów lub ich części. Rzeczywiście, podczas długotrwałej hodowli obserwuje się zmiany kariotypowe przy zastosowaniu dysocjacji enzymatycznej lub chemicznej 2,3,4, podczas gdy manualna dyssekcja kolonii podczas pasażowania pozwala zachować stabilny kariotyp 5. Ponadto zmiany w środowisku, takie jak usunięcie komórek zasilających (feeder cells), wydają się również naruszać integralność genetyczną hESC 3,6. Ponieważ zmiany chromosomalne mogą wpływać na fizjologię komórkową, charakterystyka integralności genetycznej hESC in vitro jest kluczowa, biorąc pod uwagę, że hESC stanowią niezbędne narzędzie w badaniach nad embriogenezą i testowaniu leków. Co więcej, w kontekście przyszłych zastosowań terapeutycznych zmiany chromosomalne stanowią poważny problem, gdyż często są one powiązane z kancerogenezą.
Prezentujemy tutaj prostą i użyteczną metodę otrzymywania wysokiej jakości preparatów rozproszonych chromosomów do późniejszej analizy zestawu chromosomowego za pomocą technik prążkowania G, FISH, SKY lub CGH 7,8. Zalecamy rutynową kontrolę statusu chromosomalnego w odstępach co 5 pasażów w celu monitorowania pojawiania się translokacji i aneuploidii
Priscila Britto i Rafaela Sartore wniosły równy wkład w przygotowanie pracy.
Protokół
WYPOSAŻENIE
- Inkubator do hodowli tkankowych, 37°C, 5% CO2
- Wirówka
- Zestaw mikropipet (100, 100μL)
- Kąpiel wodna 37°C
- Kąpiel wodna 90°C jako źródło pary wodnej
- Mikroskop kontrastowy
PIERWSZY KROK
Traktowanie komórek kolcemidem
W tej procedurze wykorzystano linię hESC H9 hodowaną na embrionalnych fibroblastach mysich (mEF) inaktywowanych mitomycyną C (Sigma) i utrzymywaną w DMEM/F12 (Invitrogen) uzupełnionym o 20% knockout serum replacement (KSR, Gibco) oraz 8ng/mL czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2, R&D).
W celu uzyskania dużej liczby preparatów metafaz, zaleca się stosowanie kultur o wysokim indeksie mitotycznym, w których znajduje się wiele dzielących się komórek.
- Wyjąć kolbę z hodowlą z inkubatora i w komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać Colcemid do stężenia końcowego 0,1μg/mL.
- Przenieść kolbę z powrotem do inkubatora i odczekać 3 godziny, aby inhibitor mógł wywołać zatrzymanie mitozy w metafazie, gdy chromosomy są silnie skondensowane i mogą być łatwo wizualizowane pod mikroskopem.
Fiksacja komórek
- Usunąć medium i dodać tripsynę/EDTA 0,05% w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni komórek. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dezaktywować enzym, dodając medium hodowlane zawierające surowicę lub dodając surowicę bezpośrednio do komórek.
UWAGA: Ważne jest upewnienie się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek, aby otrzymać dobre preparaty metafazowe. - Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować przy 122 g przez 5 minut.
- Odlać nadsącz, pozostawiając około 200 µL, a następnie delikatnie resuspender osad poprzez opukiwanie probówki, tak jak pokazano na filmie. Upewnić się, że komórki są dobrze zdysocjowane i w roztworze nie widać żadnych skupisk.
- Następnie należy powoli dodać 5 mL roztworu hipotonicznego (KCl 75mM) podgrzanego wcześniej do 37°C, spływając po ściance probówki zgodnie z poniższym opisem. Najpierw dodać 3 mL, odwrócić probówkę do pozycji poziomej, aby wymieszać komórki z roztworem hipotonicznym, a następnie dodać pozostałe 2 mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut.
UWAGA: Na tym etapie roztwór hipotoniczny spowoduje zwiększenie objętości komórkowej i pomoże w rozplątaniu chromosomów. Czas inkubacji jest kluczowy dla uzyskania dobrych preparatów chromosomowych. Jeśli czas będzie zbyt długi, błona komórkowa może pęknąć zbyt wcześnie, co doprowadzi do utraty chromosomów. Jeśli będzie zbyt krótki, uzyskanie preparatów chromosomowych może być trudne, ponieważ błona komórkowa może nie ulec przerwaniu. - Dodać 3 krople roztworu utrwalającego (metanol/lodowaty kwas octowy 3:1), delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać utrwalacz z komórkami, i wirować przy 122 g przez 5 minut bez hamowania.
UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być świeżo przygotowany.
UWAGA: Ważne jest stosowanie wirowania bez hamowania, aby uniknąć uszkodzenia komórek i zapobiec utracie materiału. - Odlać nadsącz, pozostawiając około 200 µL, i delikatnie resuspender osad, opukując dno probówki.
UWAGA: Ponownie należy upewnić się, że komórki są dobrze zdysocjowane i w roztworze nie widać żadnych skupisk. - Dodać pierwsze 3 mL roztworu utrwalającego, powoli po ściance probówki, obracając ją jednocześnie. Odwrócić probówkę do pozycji poziomej, aby wymieszać komórki, a następnie dodać kolejne 2 mL roztworu utrwalającego po ściance probówki, aby opuścić komórki na dno. Przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.
UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w roztworze utrwalającym przez wiele miesięcy w temperaturze 4°C. Poza ochroną komórek w ich obrzękniętym stanie, roztwór utrwalający usuwa lipidy i denaturuje białka. Procesy te sprawiają, że błona komórkowa staje się krucha, co w konsekwencji ułatwia rozcieranie chromosomów.
CZYSZCZENIE SZKIEŁEK PRZEDMIOTOWYCH
Przed przystąpieniem do przygotowywania preparatów z rozprzestrzenionymi chromosomami należy upewnić się, że szkiełka są odpowiednio oczyszczone, w przeciwnym razie może dojść do utraty części jąder komórkowych oraz metafaz. Krok ten jest również istotny w przypadku planowanego zastosowania jakiejkolwiek techniki hybrydyzacji 9.
- Umieść preparaty w zlewce zawierającej 6M HCl na co najmniej 3 h w temperaturze pokojowej.
- Po tym czasie myj preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
- Opłucz preparaty wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
- Gotowe preparaty można przechowywać w 96% etanolu, a bezpośrednio przed użyciem osuszyć ściereczką niepozostawiającą włókien.
UWAGA: W przypadku metod hybrydyzacji in situ preparaty nie mogą być przechowywane w 96% etanolu przez więcej niż 2 dni
KROK DRUGI
Przemywanie komórek
- Następnego dnia odwiruj komórki przy 122 g przez 5 minut bez hamowania.
- Odrzuć nadsącz, pozostawiając około 200 ml. Resuspenduj osad, delikatnie potrząsając probówką, a następnie powoli, po ściance probówki i obracając ją, dodaj 5 ml świeżego roztworu utrwalającego (metanol/lodowaty kwas octowy 3:1). Powtórz ten etap płukania jeszcze 2 razy, tak aby łącznie wykonać trzy płukania.
UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być świeżo przygotowany.
Przygotowanie szkiełek
- Podczas ostatniego etapu wirowania pozostaw wystarczającą ilość roztworu, aby zhomogenizować osad komórkowy i uzyskać odpowiednią gęstość komórek na szkiełkach (patrz: rycina 1).
- Nanieś 20-30 μL zawiesiny komórkowej na czyste, suche szkiełko, prowadząc pipetę bardzo blisko i równolegle do powierzchni. W miarę odparowywania roztworu utrwalającego powierzchnia szkiełka staje się ziarnista.
- Natychmiast wystaw szkiełko stroną górną do pary wodnej z gorącej wody (90°) na 30 sekund, aby doprowadzić do rozpęcznienia komórek.
UWAGA: W tym momencie metanol z roztworu utrwalającego odparowuje, co prowadzi do zwiększenia stężenia kwasu octowego, który wraz z wodą stymuluje rozprzestrzenianie się chromosomów. - Sprawdź preparat pod mikroskopem kontrastowym, aby upewnić się, że stężenie oraz rozmieszczenie komórek są prawidłowe (patrz: rycina 1).
- Szkiełka są teraz gotowe do analizy zestawu chromosomów za pomocą metod cytogenetycznych, takich jak pasmowanie G (Giemsa), FISH, SKY lub CGH.
WAŻNE WSKAZÓWKI
Jak wybrać odpowiednią metafazę do analizy
Wybierając okrągłe i odizolowane metafazy (rycina 2D), można uniknąć błędnego uznania za aneuploidie przyrostu liczby chromosomów wynikający z nałożenia się dwóch lub więcej preparatów lub utraty chromosomów spowodowanej ich wypadnięciem poza obszar analizy. Należy zatem unikać wyboru metafaz znajdujących się w pobliżu jąder komórkowych, ponieważ niektóre chromosomy mogą być przez nie zasłonięte (rycina 2A i 2B). Ponadto należy poszukiwać okrągłych metafaz i upewnić się, że każdy chromosom jest oddzielony od pozostałych w obrębie metafazy (rycina 2C).
Komórki karmące i kariotyp hESC
W przypadku analizy prążkowania G (G-banding) oraz SKY obecność komórek karmia w hodowli hESC nie zakłóca wyników, ponieważ komórki karmia nie znajdują się w stanie podziału (zostały dezaktywowane za pomocą mitomycyny C lub napromieniowania) i nie będą stanowić części populacji w metafazie. Jednakże w przypadku zastosowania techniki FISH w jądrach interfazowych zaleca się oddzielenie populacji hESC od komórek karmia poprzez manualne pobranie kolonii przed trypsynizacją do analizy FISH.
Rycina 1: Jak określić odpowiednią gęstość komórek na preparatach. Obrazy z mikroskopu fazowego przy użyciu obiektywu 10x. (A) Gęstość komórek jest zbyt wysoka. Strzałki wskazują rozprzestrzenia metafaz zbyt blisko jąder. (B) Preparat o dobrej gęstości komórek. Okręgi pokazują rozprzestrzenia metafaz odizolowane od jąder lub innych metafaz. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
Rysunek 2: Jak wybrać odpowiednią metafazę do analizy. Chromosomy są zabarwione DAPI, a obrazy zostały uzyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 100x. (A) (B) Należy unikać metafaz znajdujących się w pobliżu jąder (wskazanych strzałkami) (C) oraz metafaz niesymetrycznych, w których chromosomy są rozdzielone (okrąg). (D) Okrągła metafaza jest odpowiednią metafazą do analizy. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przygotowanie rozprzestrzeń chromosomowych jest kluczowym etapem dla pomyślnej analizy stanu genetycznego embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu rutynowych technik, takich jak prążkowanie G, oraz bardziej zaawansowanych metod, takich jak FISH, SKY i CGH.
Niniejszą procedurę można zastosować w przypadku wielu typów komórek, zmieniając czas inkubacji z kolcemmidem, który zależy od długości cyklu komórkowego. W przypadku kolonii embrionalnych komórek macierzystych czas ten wynosi 3 godzi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probówka do wirowania 15 ml | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Kwas octowy lodowaty | Isofar | 100 | |
| Metanol | Isofar | 208 | |
| Chlorek potasu (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Przeszkiełko | Bioslide | 7105-1 | |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T4799 |
Bibliografia
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- Maitra, A. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).
- Mitalipova, M. M. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).
- Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).
- Caisander, G. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).
- Imreh, M. P. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).
- Robin-Wesselschmidt, J. L. Human Stem Cell Manual. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).
- Rooney, D. E. Human Cytogenetics. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).
- Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. Practical in situ hybridization. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
