Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Podsumowanie

Kariotypowanie jest prostą i użyteczną techniką powszechnie stosowaną do wykrywania zmian genetycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania preparatów rozprzestrzeniających chromosomy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu monitorowania stanu chromosomowego tych komórek utrzymywanych w hodowli.

Streszczenie

Choć wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) posiadają stabilny diploidalny kariotyp ¹, w wielu badaniach doniesiono, że w zależności od warunków hodowli stają się one podatne na nabywanie anomalii chromosomalnych, takich jak dodanie całych chromosomów lub ich części. Rzeczywiście, podczas długotrwałej hodowli obserwuje się zmiany kariotypowe przy zastosowaniu dysocjacji enzymatycznej lub chemicznej ^2,3,4, podczas gdy manualna dyssekcja kolonii podczas pasażowania pozwala zachować stabilny kariotyp ⁵. Ponadto zmiany w środowisku, takie jak usunięcie komórek zasilających (feeder cells), wydają się również naruszać integralność genetyczną hESC ^3,6. Ponieważ zmiany chromosomalne mogą wpływać na fizjologię komórkową, charakterystyka integralności genetycznej hESC in vitro jest kluczowa, biorąc pod uwagę, że hESC stanowią niezbędne narzędzie w badaniach nad embriogenezą i testowaniu leków. Co więcej, w kontekście przyszłych zastosowań terapeutycznych zmiany chromosomalne stanowią poważny problem, gdyż często są one powiązane z kancerogenezą.

Prezentujemy tutaj prostą i użyteczną metodę otrzymywania wysokiej jakości preparatów rozproszonych chromosomów do późniejszej analizy zestawu chromosomowego za pomocą technik prążkowania G, FISH, SKY lub CGH ^7,8. Zalecamy rutynową kontrolę statusu chromosomalnego w odstępach co 5 pasażów w celu monitorowania pojawiania się translokacji i aneuploidii

Priscila Britto i Rafaela Sartore wniosły równy wkład w przygotowanie pracy.

Protokół

SPRZĘT

• Inkubator do hodowli tkankowych, 37°C, 5% CO₂
• Wirówka
• Zestaw mikropipet (100, 100μL)
• Kąpiel wodna 37°C
• Kąpiel wodna 90°C jako źródło pary wodnej
• Mikroskop kontrastowy

PIERWSZY KROK

Traktowanie komórek kolcemidem

W tej procedurze wykorzystano linię hESC H9 hodowaną na embrionalnych fibroblastach mysich (mEF) inaktywowanych mitomycyną C (Sigma) i utrzymywanych w pożywce DMEM/F12 (Invitrogen) uzupełnionej o 20% zamiennika surowicy knockout (KSR, Gibco) oraz 8ng/mL czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2, R&D).

Aby uzyskać dużą liczbę preparatów metafaz, zaleca się stosowanie kultur o wysokim indeksie mitotycznym, w których znajduje się wiele dzielących się komórek.

1. Wyjąć kolbę z hodowlą z inkubatora i w komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać Colcemid do stężenia końcowego 0,1μg/mL.
2. Przenieść kolbę z powrotem do inkubatora i odczekać 3 godziny, aby inhibitor mógł zatrzymać podział mitotyczny w metafazie, gdy chromosomy są silnie skondensowane i mogą być łatwo zwizualizowane pod mikroskopem.

Fiksacja komórek

3. Odessać pożywkę i dodać tripsynę/EDTA 0,05% w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni komórek. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dezaktywować enzym, dodając pożywkę hodowlaną zawierającą surowicę lub dodając surowicę bezpośrednio do komórek.
   UWAGA: Ważne jest upewnienie się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek, aby otrzymać dobre preparaty metafazowe.
4. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować przy 122 g przez 5 minut.
5. Odlać nadsącz, pozostawiając około 200 µL, i delikatnie resuspendować osad poprzez opukiwanie probówki, jak pokazano na filmie. Upewnić się, że komórki są dobrze zdysocjowane i w roztworze nie widać żadnych grudek.
6. Następnie należy powoli dodać 5 mL podgrzanego do 37°C roztworu hipotonicznego (KCl 75mM), wlewając go po ściance probówki zgodnie z poniższym opisem. Najpierw dodać 3 mL, odwrócić probówkę do pozycji poziomej, aby wymieszać komórki z roztworem hipotonicznym, a następnie dodać pozostałe 2 mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut.
   UWAGA: Na tym etapie roztwór hipotoniczny spowoduje zwiększenie objętości komórek i pomoże w rozplątaniu chromosomów. Czas inkubacji jest kluczowy dla uzyskania dobrych preparatów chromosomowych. Jeśli czas będzie zbyt długi, błona komórkowa może pęknąć zbyt wcześnie, co doprowadzi do utraty chromosomów. Jeśli będzie zbyt krótki, uzyskanie preparatów chromosomowych może być trudne, ponieważ błona komórkowa może nie ulec przerwaniu.
7. Dodać 3 krople roztworu utrwalającego (metanol/lodowaty kwas octowy 3:1), delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać utrwalacz z komórkami, i wirować przy 122 g przez 5 minut bez hamowania.
   UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być świeżo przygotowany.
   UWAGA: Ważne jest stosowanie wirowania bez hamowania, aby uniknąć uszkodzeń komórek i zapobiec utracie materiału.
8. Odlać nadsącz, pozostawiając około 200 µL, i delikatnie resuspendować osad poprzez opukiwanie dna probówki.
   UWAGA: Ponownie upewnić się, że komórki są dobrze zdysocjowane i w roztworze nie widać żadnych grudek.
9. Dodać pierwsze 3 mL roztworu utrwalającego, powoli wlewając go po ściance probówki podczas jej obracania. Odwrócić probówkę do pozycji poziomej, aby wymieszać komórki, a następnie dodać kolejne 2 mL roztworu utrwalającego po ściance, aby opuścić komórki na dno. Przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.
   UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w roztworze utrwalającym przez wiele miesięcy w temperaturze 4°C. Poza ochroną komórek w ich obrzękniętym stanie, roztwór utrwalający usuwa lipidy i denaturuje białka. Procesy te sprawiają, że błona komórkowa staje się krucha, co w konsekwencji ułatwia rozprzestrzenianie chromosomów.

CZYSZCZENIE SZKIEŁEK PRZEDMIOTOWYCH

Przed przystąpieniem do przygotowania preparatów z rozprzestrzenionymi chromosomami należy upewnić się, że szkiełka są odpowiednio oczyszczone, w przeciwnym razie może dojść do utraty części jąder komórkowych oraz metafaz. Krok ten jest również istotny w przypadku planowanego zastosowania jakiejkolwiek techniki hybrydyzacji ⁹.

1. Umieść preparaty w zlewce zawierającej 6M HCl na co najmniej 3 h w temperaturze pokojowej.
2. Po tym czasie płucz preparaty pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
3. Opłucz preparaty wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
4. Następnie preparaty można przechowywać w 96% etanolu i osuszyć ściereczką niepozostawiającą włókien bezpośrednio przed użyciem.

UWAGA: W przypadku metod hybrydyzacji in situ szkiełka nie mogą być przechowywane w 96% etanolu dłużej niż przez 2 dni

KROK DRUGI

Przemywanie komórek

10. Następnego dnia odwiruj komórki z prędkością 122 g przez 5 minut bez hamowania.
11. Odlej nadsącz, pozostawiając około 200 ml. Resuspenduj osad, delikatnie potrząsając probówką, a następnie powoli, po ściance i obracając probówkę, dodaj 5 ml świeżego roztworu utrwalającego (metanol/lodowaty kwas octowy 3:1). Powtórz ten etap płukania jeszcze 2 razy, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania.
    UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być świeżo przygotowany.

Przygotowanie slajdów

12. Podczas ostatniego etapu wirowania pozostaw wystarczającą ilość roztworu, aby zhomogenizować osad komórkowy i uzyskać odpowiednią gęstość komórek na szkiełkach (patrz rycina 1).
13. Nanieś 20-30 μL zawiesiny komórkowej na czyste, suche szkiełko, prowadząc pipetę bardzo blisko i równolegle do powierzchni. W miarę odparowywania roztworu utrwalającego powierzchnia szkiełka staje się ziarnista.
14. Niezwłocznie wystaw szkiełko stroną górną do pary gorącej wody (90°) na 30 sekund, aby doprowadzić do rozpęcznienia komórek.
    UWAGA: W tym momencie metanol z roztworu utrwalającego odparowuje, co prowadzi do zwiększenia stężenia kwasu octowego, który wraz z wodą stymuluje rozprzestrzenianie się chromosomów.
15. Skorzystaj z mikroskopu fazowo-kontrastowego, aby sprawdzić, czy stężenie oraz rozkład komórek są prawidłowe (patrz rycina 1).
16. Szkiełka są teraz gotowe do analizy zestawu chromosomów za pomocą metod cytogenetycznych, takich jak prążkowanie G (Giemsa), FISH, SKY lub CGH.

WAŻNE WSKAZÓWKI

Jak wybrać odpowiednią metafazę do analizy

Wybierając okrągłe i odizolowane metafazy (rycina 2D), można uniknąć błędnej interpretacji aneuploidii jako przyrostu chromosomów wynikającego z nałożenia się dwóch lub więcej preparatów lub utraty chromosomów spowodowanej ich „wystrzeleniem” poza obszar analizy. Należy zatem unikać wyboru metafaz znajdujących się w pobliżu jąder komórkowych, ponieważ niektóre chromosomy mogą być przez nie przesłonięte (rycina 2A i 2B). Ponadto należy szukać okrągłych metafaz i upewnić się, że żaden chromosom nie jest oddzielony od metafazy (rycina 2C).

Komórki karmione i kariotyp hESC

W przypadku analizy prążkowania G oraz SKY obecność komórek karmicieli w hodowli hESC nie zakłóca wyników, ponieważ komórki karmiciele nie znajdują się w stanie podziału (zostały dezaktywowane za pomocą mitomycyny C lub naświetlania) i nie będą częścią populacji w metafazie. Jednakże w przypadku zastosowania techniki FISH w jądrach interfazowych zaleca się oddzielenie populacji hESC od komórek karmicieli poprzez ręczne zebranie kolonii przed trypsynizacją do analizy FISH.

Rycina 1: Jak określić odpowiednią gęstość komórek na preparatach. Obrazy z mikroskopu fazowego przy użyciu obiektywu 10x. (A) Gęstość komórek jest zbyt wysoka. Strzałki wskazują preparaty metafazowe znajdujące się zbyt blisko jąder. (B) Preparat o dobrej gęstości komórek. Okręgi pokazują preparaty metafazowe odizolowane od jąder lub innych metafaz. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Rysunek 2: Jak wybrać odpowiednią metafazę do analizy. Chromosomy są barwione DAPI, a obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 100x. (A) (B) Należy unikać metafaz znajdujących się w pobliżu jąder (wskazane strzałkami) (C) oraz metafaz nieokrągłych, w których chromosomy są rozdzielone (okrąg). (D) Okrągła metafaza jest odpowiednia do analizy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.

Dyskusja

Przygotowanie rozprzestrzeń chromosomowych jest kluczowym etapem dla pomyślnej analizy stanu genetycznego embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu rutynowych technik, takich jak prążkowanie G, oraz bardziej zaawansowanych metod, takich jak FISH, SKY i CGH.

Niniejszą procedurę można zastosować w przypadku wielu typów komórek, zmieniając czas inkubacji z kolcemmidem, który zależy od długości cyklu komórkowego. W przypadku kolonii embrionalnych komórek macierzystych czas ten wynosi 3 godzi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
probówka do wirowania 15 ml	Techno Plastic Products	91015
Colcemid Karyo MAX	GIBCO, by Life Technologies	15212-012
EDTA	Isofar	721
Kwas octowy lodowaty	Isofar	100
Metanol	Isofar	208
Chlorek potasu (KCl)	Merck & Co., Inc.	104.931.000
Przeszkiełko	Bioslide	7105-1
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T4799