Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Podsumowanie

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Streszczenie

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz zawiera gotowe do użycia odczynniki do wykrywania aktywności proteaz. Ten prosty test wykrywania aktywności proteaz wykorzystuje kazeinę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) jako substrat.

Aktywność proteazy prowadzi do rozszczepienia znakowanej FITC kazeiny (substratu) na mniejsze fragmenty, które nie wytrącają się w warunkach kwasowych. Po inkubacji próbki proteazy z substratem, reakcję zakwasza się poprzez dodanie kwasu trójchlorooctowego (TCA). Następnie mieszaninę poddaje się wirowaniu, w wyniku czego nierozłożony substrat tworzy osad, a mniejsze, rozpuszczalne w kwasie fragmenty pozostają w roztworze. Nadsadczyn neutralizuje się, a następnie mierzy fluorescencję fragmentów znakowanych FITC.

Opisana procedura zestawu pozwala na wykrycie kontrolnej proteazy trypsyny w stężeniu około 0,5 μg/ml (do analizy dodano 5 ng trypsyny). Czułość tę można zwiększyć poprzez wydłużenie czasu inkubacji do 24 godzin. Analizę przeprowadza się w probówkach do mikrocentryfugi, a procedury obejmują detekcję fluorescencyjną z wykorzystaniem kuwet lub płytek wielodołkowych.

Protokół

Instrukcje przygotowania

Bufor inkubacyjny, bufor do analizy oraz 0,6 N roztwór TCA są dostarczane jako gotowe do użycia roztwory.

Podłoże FITC-Kazeina – zaleca się rozdzielenie podłoża FITC-Kazeina na mniejsze aletikoty po otrzymaniu produktu, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Jeśli podłoże FITC-Kazeina zostanie poddane wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania, nastąpi niewielki wzrost tła, co obniży czułość analizy. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc je przed światłem. Każda reakcja z próbką, próbą jałową lub kontrolą wymaga 20 μl podłoża FITC-Kazeina. Zamrażanie i rozmrażanie, a także intensywne mieszanie lub wstrząsanie mogą spowodować oddzielenie FITC od kazeiny, co doprowadzi do uzyskania wyższych odczytów tła oraz zmniejszenia ilości podłoża dostępnego do rozszczepienia przez proteazę.

Roztwór kontrolny izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) – kontrolę FITC można zrekonstytuować w buforze do analizy (Assay Buffer) do odpowiedniego stężenia. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i chronić przed światłem.

Przygotowanie końcowego Roztworu Kontrolnego Trypsyny – do fiolki z Trypsin, Protease Control (kod produktu T 6567) dodać 100 μl 1 mM HCl. Krótko wymieszać, aby upewnić się, że trypsyna została rozpuszczona. Dodać 900 μl Buforu Inkubacyjnego i dokładnie wymieszać. Ewentualnie do analizy można zastosować inne bufory. Końcowe stężenie robocze trypsyny wynosi 20 μg/μl. W celu przygotowania Roztworu Kontrolnego Trypsyny należy połączyć alikwot zakwaszonego roztworu trypsyny z odpowiednią ilością Buforu Inkubacyjnego (1 część zakwaszonej trypsyny na 9 części buforu). Przechowywanie trypsyny w warunkach kwasowych zwiększa jej stabilność. Roztwór kontrolny trypsyny jest wrażliwy na temperaturę i nie jest stabilny przy niskich stężeniach.
Prosimy o zapoznanie się z biuletynem technicznym zestawu w zakresie przechowywania i stabilności tych przygotowanych roztworów.

Procedura

1. Najłatwiej jest przygotować kontrole, próbki ślepe i próbki badawcze jednocześnie. Do każdej próbki badawczej dodaj 20 μl Buforu Inkubacyjnego, 20 μl Substratu FITC-Kazeina oraz 10 μl próbki badawczej do probówki do mikrocentryfugi. W przypadku próbek o wysokiej aktywności proteazy może być wymagane ich rozcieńczenie.
2. Przygotuj odpowiednie próbki kontrolne (patrz Próbki Kontrolne), dodając 20 μl Buforu Inkubacyjnego, 20 μl Substratu FITC-Kazeina oraz 10 μl próbki kontrolnej do probówki do mikrocentryfugi.
3. Przygotuj próbkę ślepą, dodając 20 μl Buforu Inkubacyjnego, 20 μl Substratu FITC-Kazeina oraz 10 μl wody ultrapure do probówki do mikrocentryfugi.
4. Delikatnie wymieszaj zawartość każdej probówki i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 minut. Należy unikać zbyt energicznego mieszania, ponieważ nadmierna turbulencja może spowodować wysokie tło fluorescencyjne i zmniejszyć czułość testu.
   Uwaga: Czas inkubacji można wydłużyć do 24 godzin w celu zwiększenia czułości. Należy jednak uważać, aby nie przekroczyć 24 godzin, ponieważ FITC-Kazeina może zacząć ulegać degradacji, co prowadzi do wysokiego tła fluorescencyjnego.
5. Po inkubacji dodaj 150 μl 0,6 N Roztworu Kwasu Trichlorooctowego do każdej probówki do mikrocentryfugi. TCA jest substancją silnie żrącą i należy z nią pracować w odpowiednim sprzęcie ochronnym.
6. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 30 minut.
7. Wiruj probówki przez 10 minut przy 10,000 x g. Nadosad zawiera rozpuszczalne w kwasie fragmenty znakowane FITC i służy do pomiaru fluorescencji.

Pomiary fluorescencji

Metody te można skalować w zależności od wymagań dotyczących dostępnej aparatury. W celu porównania z krzywą standardową przygotowaną z odpowiednich próbek kontrolnych, należy od wartości każdej próbki badawczej (FLUtest) odjąć odczyt fluorescencji próbki ślepej (FLUblank).

Kuwety

1. Do odpowiedniej kuwety pipetować 10 μl supernatantu (krok 7) oraz 1 ml buforu do analizy (Assay Buffer), a następnie delikatnie wymieszać. Uwaga: Roztwór supernatantu i buforu do analizy można przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 24 godziny przed pomiarem fluorescencji.
2. Zarejestrować natężenie fluorescencji przy wzbudzeniu przy 485 nm i monitorowaniu długości fali emisji 535 nm.

Płytki wielodołkowe

1. Do odpowiedniej probówki lub fiolki pipetować 10 μl supernatantu (krok 7) oraz 1 ml buforu do testu (Assay Buffer), a następnie delikatnie wymieszać. Uwaga: Roztwór supernatantu i buforu do testu można przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C do 24 godzin przed pomiarem fluorescencji.
2. Przenieść 200 μl do dołka czarnej płytki 96-dołkowej. Zmierzyć intensywność fluorescencji przy wzbudzeniu 485 nm i monitorowaniu długości fali emisji 535 nm.
   Lub

1. Do dołka czarnej płytki 96-dołkowej pipetować 2 μl supernatantu (krok 7) oraz 200 μl buforu do analizy (Assay Buffer). Uwaga: Roztwór supernatantu i buforu do analizy można przechowywać w ciemności w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 24 godziny przed pomiarem fluorescencji.
2. Zarejestrować natężenie fluorescencji przy wzbudzeniu przy 485 nm i monitorowaniu długości fali emisji 535 nm.

Próbki kontrolne

Roztwór kontrolny trypsyny może być wykorzystany do potwierdzenia prawidłowego przebiegu analizy, wyznaczenia granicy wykrywalności lub stworzenia ogólnej krzywej wzorcowej. W przypadku analizy innej, specyficznej proteazy, zaleca się przygotowanie roztworu kontrolnego zawierającego tę specyficzną proteazę w odpowiednim buforze inkubacyjnym.

Granica wykrywalności testu to ilość proteazy, która generuje znaczący odczyt fluorescencji powyżej wartości uzyskanej dla próbki ślepej. Granica wykrywalności będzie różnić się w zależności od czułości aparatury. Do przygotowania roztworów kontrolnych można wykorzystać rozcieńczenia seryjne roztworu kontrolnego trypsyny.

Za istotny uznaje się odczyt równy 120% wartości uzyskanej dla próby ślepej. Przy zastosowaniu tej procedury rutynowo uzyskiwano granicę wykrywalności na poziomie 5 ng trypsyny. Zaleca się, aby w każdym teście przeprowadzić kontrolę z użyciem co najmniej 5 ng trypsyny. Roztwór kontrolny trypsyny o stężeniu 0,5 μg/ml pozwoli na uzyskanie wymaganych 5 ng trypsyny w teście. 40-krotne rozcieńczenie roztworu kontrolnego trypsyny (20 μg/ml) pozwala na przygotowanie roztworu kontrolnego o stężeniu 0,5 μg/ml, tj. jednej części roztworu kontrolnego trypsyny na 39 części buforu inkubacyjnego.

Rysunek 1 (Krzywa wzorcowa aktywności trypsyny): Roztwór kontrolny trypsyny (20 μg/ml) może być również wykorzystany do sporządzenia krzywej wzorcowej poprzez wykonanie rozcieńczeń seryjnych (patrz Rysunek 1). Odczyt fluorescencji każdej próbki kontrolnej skorygowano poprzez odjęcie odczytu fluorescencji próbki ślepej (FLUblank) od wartości każdej próbki kontrolnej (FLUcontrol).

Typowa krzywa wzorcowa dla trypsyny (kod produktu T 6567) z wykorzystaniem tego zestawu i próbek kontrolnych w zakresie od 0,15 μg/ml (1,5 ng) do 2,5 μg/ml (25 ng). Krzywa ta została wygenerowana zgodnie z opisaną procedurą, z czasem inkubacji wynoszącym 30 minut w kroku 4. Pomiary fluorescencji wykonano na płytce wielodołkowej.

Izotiocyjanian fluoresceiny służy jako kontrola do ewentualnej kalibracji urządzenia (patrz odpowiednie instrukcje producenta) lub do określenia zakresu liniowości sygnału FITC.

Dyskusja

Właśnie zaprezentowaliśmy przykładowy test z wykorzystaniem zestawu Protease Fluorescent Detection Kit do wykrywania aktywności proteaz w próbce biologicznej. Zestaw ten został zoptymalizowany do wykrywania szerokiego zakresu proteaz występujących w zastosowaniach fizjologicznych. Nadaje się on do wykrywania proteaz serynowych, cysteinowych, metaloproteaz oraz proteaz aspartylowych; jednak w przypadku wykrywania niektórych specyficznych proteaz mogą być wymagane modyfikacje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz	Sigma-Aldrich	PF0100
Kwas solny	Sigma-Aldrich	H1758