Transfekcja DNA mięśni szkieletowych ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

Podsumowanie

Opisujemy szczegółowe procedury wydajnej transfekcji plazmidowego DNA do włókien mięśni stop żywych myszy z wykorzystaniem elektroporacji oraz następującej po niej wizualizacji ekspresji białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Rosnącym obszarem zainteresowania w biologii komórki jest ekspresja transgenicznie zmodyfikowanych form białek istotnych dla organizmu (np. konstruktów znakowanych fluorescencyjnie i/lub wariantów zmutowanych) w celu zbadania ich endogennej dystrybucji oraz znaczenia funkcjonalnego. Ciekawym podejściem, które wdrożono w celu realizacji tego celu w w pełni zróżnicowanych komórkach, jestin vivotransfekcja plazmidów różnymi metodami do konkretnych tkanek, takich jak wątroba¹, mięsień szkieletowy^2,3, a nawet mózg⁴Przedstawiamy tutaj szczegółowy opis kroków, które należy wykonać w celu efektywnej transfekcji materiału genetycznego do włókienmięsień zginacz krótki palców(FDB) imiędzykostny (IO) mięśnie dorosłych myszy przy użyciu anin vivometoda elektroporacji. Parametry eksperymentalne zostały zoptymalizowane w celu maksymalizacji liczby przetransfekowanych włókien mięśniowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu uszkodzeń tkanek, które mogłyby pogorszyć jakość i ilość białek ekspresowanych w poszczególnych włóknach. Potwierdziliśmy, że zastosowanie opisanej w niniejszej pracy metodologii pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności białek rozpuszczalnych, tj. EGFP i ECFP³, kalpain, FKBP12, β2a-DHPR, itp.; białka strukturalne, t. j. minidystrofina i α-aktynina; oraz białka błonowe, t. j. α1s-DHPR, RyR1, kardiologiczny Na/Ca²⁺wymiennik, kanał NaV1.4 Na, SERCA1 itp., gdy są one stosowane w odniesieniu do FDB, IO i innych mięśni myszy i szczurów. Wydajna ekspresja niektórych z tych białek została zweryfikowana biochemicznie³i dowody funkcjonalne⁵Jednak przede wszystkim najczęściej stosowanym przez nas podejściem potwierdzającym jest standardowa mikroskopia fluorescencyjna oraz dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa (TPLSM), które pozwalają zidentyfikować nie tylko ogólną ekspresję, ale także szczegółową lokalizację wewnątrzkomórkową konstruktów białkowych znakowanych fluorescencyjnie. Metoda ta może być w równym stopniu wykorzystana do transfekcji plazmidów kodujących ekspresję białek o znaczeniu fizjologicznym (jak pokazano tutaj), jak i dla interferencyjnego RNA (siRNA) mającego na celu stłumienie ekspresji białek występujących naturalnie (nie badano tego jeszcze w naszej pracy). Należy zauważyć, że transfekcja włókien mięśni FDB i IO jest szczególnie istotna dla badania fizjologii mięśni ssaków, ponieważ włókna dysocjowane enzymatycznie z tych mięśni stanowią obecnie jeden z najbardziej odpowiednich modeli do badania podstawowych mechanizmów pobudliwości oraz sprzężenia wzbudzenie-skurcz w warunkach clampy prądowej lub napięciowej.^2,6-8Empty input. No HTML to translate.

Protokół

Procedury eksperymentalne dla elektroporacji in vivo mięśni FDB i IO

1. Przed rozpoczęciem protokołów elektroporacji in vivo, należy namnożyć plazmidy ekspresyjne ssaków, aby uzyskać stężenie w zakresie 2-5 μg plazmidu/μl w buforze TE. Uwaga: rutynowo stosujemy komercyjne zestawy do amplifikacji i postępujemy zgodnie z procedurami producenta. Komercyjne plazmidy ekspresyjne zawierające promotor CMV bardzo dobrze sprawdzają się w transfekcjach in vivo w mięśniach szkieletowych.
2. Odmierz niezbędną objętość (10-20 μl) roztworu plazmidu i przechowuj ją w dwóch probówkach Eppendorf o pojemności 0,5 ml (jedna dla każdej łapy myszy).
3. Przygotuj roztwór zawierający 2 mg/ml hialuronidazy w sterylnym roztworze Tyrode'a.
4. Używając komory anestezjologicznej, wprowadź mysz w stan głębokiej narkozy, stosując 4% izofluranu w O2 za pomocą zatwierdzonej aparatury do znieczuleń gazowych. Umieść zwierzę na podkładce grzewczej (37 °C) i utrzymuj anestezię za pomocą maski dla gryzoni. Monitoruj głębokość narkozy za pomocą odruchu zaciśnięcia palca.
5. Pod kontrolą mikroskopu sekcyjnego wstrzyknij 10 μL roztworu hialuronidazy pod poduszki łap jednej z kończyn myszy, używając sterylnej igły 33G o długości 1”. Przebij skórę w punkcie bliskim pięcie i wprowadź igłę podskórnie w kierunku podstawy palców na ok. 1/4”.
6. W razie potrzeby powtórz procedurę w drugiej łapie.
7. Odłącz aparat do znieczulenia i umieść mysz w klatce. Pozwól jej w pełni wybudzić się z narkozy.
8. Po godzinie ponownie znieczul zwierzę i umieść je na podkładce grzewczej. Postępując zgodnie z procedurą opisaną dla roztworu hialuronidazy, wstrzyknij łącznie 20-50 μg plazmidowego DNA (w zależności od wielkości konstruktu plazmidowego). Całkowita objętość wstrzykniętego roztworu powinna być mniejsza niż 20 μL/łapa. Uwaga: gdy konieczne jest podanie 15-20 μL, zaleca się zamknięcie miejsca wkłucia igły za pomocą kleju tkankowego.
9. Odłącz aparat do znieczulenia i umieść mysz w klatce. Pozwól jej w pełni wybudzić się z narkozy i odczekaj 10-15 min.
10. Znieczul zwierzę po raz trzeci i umieść je na podkładce grzewczej.
11. Wybierz jedną łapę zwierzęcia. Umieść jedną pozłacaną igłę akupunkturową pod skórą w okolicy pięty, a drugą u podstawy palców. Elektrody powinny być ustawione równolegle do siebie i prostopadle do długiej osi łapy.
12. Połącz głowice igieł (elektrody) ze stymulatorem elektrycznym za pomocą mikroklipsów. Przeprowadź elektroporację mięśni, aplikując 20 impulsów o czasie trwania 20 ms każdy, z częstotliwością 1 Hz. W zależności od rozstawu elektrod, amplitudę napięcia impulsów należy dostosować (monitorując za pomocą oscyloskopu), aby uzyskać pole elektryczne o natężeniu ~100 V/cm. Uwaga: przy odpowiednim poziomie znieczulenia nie powinny być obserwowane skurcze w odpowiedzi na bodźce.
13. W razie potrzeby powtórz powyższe procedury w przeciwległej łapie zwierzęcia.
14. Wróć zwierzę do klatki i po pełnym wybudzeniu z narkozy utrzymuj je pod obserwacją. Uwaga: jeśli procedura przebiegła prawidłowo, zwierzę powinno odzyskać pełną sprawność w ciągu 30 minut, po czym może zostać przeniesione z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt w zootechnikum. Wstrzyknięcia hialuronidazy i DNA w poduszki łap nie wywołują zauważalnych działań niepożądanych u zwierząt. Po wybudzeniu z narkozy myszy są w stanie normalnie poruszać się po klatce. Jako dodatkową ostrożność, dodaj do wody pitnej zwierzęcia karprofen w stężeniu 0,0027 mg/ml przez 2 dni jako lek przeciwbólowy.
15. Ekspresję białka można ocenić 2-8 dni po transfekcji. Jednak w przypadku wielu białek obserwowano trwałą ekspresję przez wiele miesięcy.

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza UCLA, zgodnie z wymogami Ustawy o Dobrostanie Zwierząt (Animal Welfare Act) oraz polityki PHS w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

Reprezentatywne wyniki:

Prawidłowe przeprowadzenie opisanych powyżej procedur elektroporacji in vivo powinno skutkować efektywną transfekcją plazmidów w mięśniach FDB i IO. Należy jednak pamiętać, że wydajność ekspresji transgenicznych wariantów białek będzie zależeć od plazmidu, wielkości i złożoności białka, właściwości funkcjonalnych białka oraz szeregu innych zmiennych niezależnych od badacza. Jak pokazano na Rysunku 1 dla mięśnia FDB poddanego elektroporacji w obecności komercyjnego plazmidu (pmR-mCherry) kodującego białko mCherry , większość włókien mięśniowych została poddana transfekcji zgodnie z naszym protokołem, co potwierdza fakt, że większość z nich wykazuje czerwoną fluorescencję. Nie wyklucza to możliwości, że poszczególne włókna wykazują różny stopień ekspresji białka lub że niektóre włókna nie zostały poddane transfekcji w ogóle 3. Należy zauważyć, że efektywna ekspresja dużych ilości białek fluorescencyjnych, takich jak mCherry, EGFP, ECFP i EYFP, nie upośledza pobudliwości włókien mięśniowych ani właściwości sprzężenia wzbudzenia ze skurczem. W rzeczywistości są one nieodróżnialne od włókien w mięśniach poddanych transfekcji pozornej (wyniki nie pokazane).

Praktyczne podejścia stosowane w celu weryfikacji lokalnej ekspresji białek znakowanych fluorescencyjnie w włóknach mięśni szkieletowych.

Wewnątrzkomórkową lokalizację białek transgenicznych wyrażanych di novo rutynowo ocenia się poprzez jednoczesne pozyskiwanie, przy użyciu TPLSM, obrazów fluorescencyjnych odpowiednich znaczników oraz obrazów dobrze zidentyfikowanych markerów struktur komórkowych. Najbardziej typowe z tych ostatnich to: a) obrazy generacji drugiej harmonicznej (SHG), wynikające z anizotropii miozyny w pasmach A sarkomerów (wycentrowanych w liniach M)9,10 oraz b) obrazy fluorescencyjne di-8-ANEPPS, które można uzyskać poprzez znakowanie powierzchni oraz błon systemu kanalików poprzecznych (kanalików T) włókien mięśniowych tym nieprzenikalnym barwnikiem potencjometrycznym11. Na obrazach fluorescencyjnych włókien mięśniowych barwionych di-8-ANEPPS kanaliki T jawią się jako wąskie pasma fluorescencji zorientowane niemal prostopadle do długiej osi włókna. Pasma te są rozmieszczone nierównomiernie: dzieli je długi odcinek rozciągający się przez linie M oraz krótki odcinek rozciągający się przez linię Z¹¹.

Ekspresja i lokalizacja α-actinin-EGFP w włóknach mięśni szkieletowych.

Przykład ekspresji wariantu z etykietą białka strukturalnego mięśni α-aktyniny przedstawiono na Rycynie 2. Białko to jest znane jako główny składnik linii Z i w związku z tym jest rutynowo stosowane jako marker tej struktury12. Przeprowadziliśmy transfekcję mięśni FDB i IO plazmidem pEGFPN1-α-actinin1 kodującym ludzką (pozaprzekładkową) α-aktyninę z etykietą EGFP na C-końcu. Sześć dni po transfekcji stwierdzono, oceniając rozmieszczenie fluorescencji EGFP, że α-aktynina jest wyrażana głównie w postaci wąskich pasm rozmieszczonych równomiernie wzdłuż osi włókna. Widoczny jest pojedynczy pas na sarkomer (Ryciny 2A i 2D). Kolokalizacja tych pasm z liniami Z została wykazana poprzez porównanie rozkładu fluorescencji EGFP z obrazami SHG (Rycina 2B) oraz di-8-ANEPPS (Rycina 2E). Jak pokazano na obrazie nakładkowym (Rycina 2C), pasma α-aktyniny-EGFP przeplatają się z pasmami SHG, co wskazuje, że znajdują się one w połowie drogi między dwoma kolejnymi pasmami M, pokrywając się z położeniem linii Z. W przetransfekowanych włóknach mięśniowych barwionych di-8-ANEPPS pasma α-aktyniny-EGFP są widoczne w centrum każdej pary kanalików T (Rycina 2F), które wiadomo, że flankują linie Z (tj. są oddalone o krótszy dystans), co wskazuje na ukierunkowanie transgenicznej α-aktyniny do linii Z.

Ekspresja DHPRα1s z tagiem EGFP na N-końcu

Wydajność transfekcji mięśni wektorem pEGFPC1.1-DHPR α1s została zweryfikowana na obrazach TPLSM (np. rysunek 3A), które wykazują, że większość włókien wykazuje ekspresję EGFP-DHPRα1s (białka błonowego). Najbardziej charakterystyczną cechą transfekowanych włókien jest dwupasmowy wzór fluorescencji EGFP (rysunki 3A i 3B), co jest zgodne z oczekiwaniami w przypadku białka skierowanego do kanalików T. Na rysunku 3 można również zauważyć, że mimo różnego poziomu intensywności fluorescencji w zależności od włókna, pasmowy wzór fluorescencji poszczególnych włókien wydaje się być jednorodny na całej ich długości. Przy większym powiększeniu (rysunek 3B) wyraźnie widać, że nierównomierne odstępy między pasmami są podobne do tych zaobserwowanych we włóknach barwionych di-8-ANEPPS (np. rysunek 2E). Obrazy nałożone (rysunek 3B i 3E) ilustrują, że pasma SHG znajdują się w większych odstępach między pasmami EGFP-DHPRα1s, co potwierdza obecność tego białka w kanalikach T. Dodatkowe pomiary FRET z wykorzystaniem niefluorescencyjnego lipofilnego anionu DPA- (dane niepokazane) dodatkowo wykazują, że część EGFP znajduje się w odległości kilku nanometrów od wewnętrznej warstwy błon kanalików T.

Lokalizacja i ocena funkcjonalna ekspresji EYFP-ClC1

Włókna przetransfekowane pEYFP-ClC1, które koduje konstrukt z EYFP (na N-końcu) kanału chlorkowego mięśni szkieletowych (ClC1), wykazują pasma fluorescencji EYFP (Rysunek 4A) o wzorze podobnym do tego, który zaobserwowano dla ekspresji EGFP-DHPRα1s (Rysunek 3A) i odpowiadającym układowi kanalików poprzecznych, zilustrowanemu barwieniem di-8-ANEPPS (Rysunek 2E). Zgodnie z oczekiwaniami, nałożenie obrazów EYFP-ClC1 (Rysunek 4A) i SHG (Rysunek 4B), przedstawione na obrazie złożonym (Rysunek 4C), pokazuje, że pasma SHG są centrycznie położone w szerokich odstępach pomiędzy pasmami fluorescencji EYFP.

Aby ocenić, czy ekspresja EYFP-ClC1 prowadzi do znaczącego wzrostu przewodnictwa spoczynkowego włókien mięśniowych, co jest oczekiwane w przypadku nadekspresji funkcjonalnych kanałów chlorkowych, poddano włókna mięśniowe z przetransfekowanego mięśnia FDB dysocjacji enzymatycznej, a następnie badano ich właściwości elektrofizjologiczne przy użyciu dwumikroelektrodowego układu eksperymentalnego opisanego wcześniej^6,11,13. Rysunek 5 przedstawia wyniki z dwóch włókien: jedno wykazuje dużą ilość EYFP-ClC1, co oceniono na podstawie pomiarów całkowitej intensywności fluorescencji w standardowym mikroskopie fluorescencyjnym (nie pokazano), natomiast drugie stanowi kontrolę nietransfekowaną. Zapis napięcia na Rysunku 5A (uzyskany z włókna mięśniowego wykazującego ekspresję EYFP-ClC1) pokazuje, że ze względu na nadmierne przewodnictwo spoczynkowe włókno jest niemal niewzbudliwe. W celu wywołania bardzo słabej odpowiedzi aktywnej (brak przestrzału, Rysunek 5A) konieczne było zastosowanie impulsów stymulujących prądem do 400 nA (0,5 ms). Po zastąpieniu zewnętrznego roztworu Tyrodego roztworem zawierającym 500 μM blokera kanałów chlorkowych 9-ACA, impulsy prądowe o natężeniu 200 nA były wystarczające do wywołania potencjału czynnościowego (Rysunek 5B), choć znacznie wolniejszego i szerszego niż te zarejestrowane w włóknie kontrolnym (Rysunek 5C). Zgodnie z oczekiwaniami, dodatek 9-ACA miał minimalny wpływ na to włókno kontrolne (Rysunek 5D).

Rysunek 1. Wydajność transfekcji metodą elektroporacji in-vivo. Obrazy w świetle przechodzącym (A) i fluorescencyjne (B) mięśnia FDB poddanego transfekcji pmR-mCherry. Liczba dni po protokole elektroporacji: 12 dni. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rycina 2. Ekspresja i celowanie α-actininy-EGFP w włóknach FDB. Panele A i B przedstawiają odpowiednio obrazy fluorescencyjne EGFP oraz SHG włókna wykazującego ekspresję α-actininy-EGFP. Panel C przedstawia superpozycję obrazów z paneli A i B. Panele D i E przedstawiają odpowiednio obrazy fluorescencyjne innego włókna wykazującego ekspresję α-actininy-EGFP oraz włókna barwionego di-8-ANEPPS. Panel F przedstawia superpozycję obrazów z paneli D i E. Liczba dni po protokole elektroporacji: 6 dni.

Rysunek 3. Ekspresja i celowanie EGFP-DHPRα1s we włóknach FDB. Panel A: obraz fluorescencji EGFP grupy włókien wykazujących ekspresję EGFP-DHPRα1s. Panel B: powiększenie obszaru zaznaczonego kwadratem w panelu A w celu lepszego zobrazowania pasmowego wzorca ekspresji białka. Panel C: obraz SHG odpowiadający obrazowi w panelu A. Panel D: nałożenie obrazów A i C. Panel E: powiększenie obszaru wskazanego w panelu D. Dni po protokole elektroporacji: 20 dni.

Rycina 4. Ekspresja i lokalizacja EYFP-ClC1 we włóknach mięśnia zginacza głębokiego palców (FDB). Panele A i B przedstawiają odpowiednio fluorescencję EYFP oraz obrazy SHG włókien wykazujących ekspresję EYFP-ClC1. Panel C przedstawia superpozycję obrazów z paneli A i B. Panel D przedstawia profil natężenia zmierzony wzdłuż białej linii zaznaczonej na obrazie w panelu C. Liczba dni po protokole elektroporacji: 7 dni.

Rycina 5. Ocena elektrofizjologiczna włókien wykazujących ekspresję transgenicznego EYFP-ClC1. Panele A i B przedstawiają zapisy napięcia z włókna wykazującego ekspresję EYFP-ClC1 w odpowiedzi na impulsy prądowe odpowiednio przed i po zastosowaniu 9-ACA. Panele C i D przedstawiają zapisy napięcia (potencjały czynnościowe) wywołane w odpowiedzi na impulsy prądowe we włóknie nietransfekowanym odpowiednio przed i po zastosowaniu 9-ACA.

Dyskusja

Opisujemy tutaj szczegółowe kroki, które należy podjąć w celu uzyskania efektywnej transfekcji plazmidów DNA do włókien mięśni szkieletowych za pomocą elektroporacji in vivo. Głównymi zaletami naszego podejścia są prostota wykonania oraz minimalna inwazyjność, co skutkuje znikomym zagrożeniem dla zdrowia zwierząt. W rzeczywistości opisane powyżej protokoły elektroporacji nie wymagają więcej niż dwóch iniekcji podskórnych na każdą stopę, po których następuje protokół stymulacji elektrycznej; wszystkie te czynnośc...