Wizualizacja replikacji pojedynczej cząsteczki DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

Ten protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replikomy w czasie rzeczywistym.

Abstract

Opisujemy prostą, opartą na mikroskopii fluorescencyjnej metodę obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Okrągła, rozwidlona matryca DNA jest dołączana do funkcjonalizowanego szklanego szkiełka nakrywkowego i intensywnie replikowana po wprowadzeniu białek replikacyjnych i nukleotydów (ryc. 1). Dwuniciowy DNA (dsDNA) jest rozszerzany za pomocą przepływu laminarnego i wizualizowany za pomocą barwnika interkalacyjnego. Pomiar położenia rosnącego końca DNA w czasie rzeczywistym pozwala na precyzyjne określenie szybkości replikacji (ryc. 2). Ponadto długość ukończonych produktów DNA informuje o procesowości replikacji. Eksperyment ten można przeprowadzić bardzo łatwo i szybko i wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z dość czułą kamerą.

Protocol

Przed przeprowadzeniem eksperymentu z replikacją pojedynczej cząsteczki, należy wcześniej przygotować kilka materiałów.

1. Szablon replikacji DNA

Substratem do reakcji replikacji jest biotynylowany, ogoniasty okrąg M13 przygotowany przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej^1,2.

Materiały: jednoniciowe DNA M13mp18, biotynylowany starter oligonukleotydowy ogona (5'-Biotin-T₃₆AATTCGTAATCATGGTCATAGCTTTTTCCT-3'), polimeraza DNA T7, blok ciepła, fenol/alkohol izoamylowy/chloroform

1. Wyżarz biotynylowany oligo ogonowy do M13, dodając 10-krotny nadmiar oligo do bufora TBS (330 nM oligo ogona, 33 nM M13).
2. Podgrzać mieszaninę do temperatury 65 °C w bloku grzewczym. Po podgrzaniu wyłącz blok grzewczy i pozwól na powolne chłodzenie, aby prawidłowo wyżarzyć podkład.
3. Dodaj zagruntowany M13 do mieszaniny 64 nM polimerazy DNA T7 i buforu replikacyjnego T7 zawierającego dNTP i MgCl₂.
4. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 12 minut i schładzać 100 mM EDTA.
5. Oczyść wypełnione DNA produktu za pomocą ekstrakcji fenolem/chloroformem/alkoholem izoamylowym i dializ do buforu TE lub innego odpowiedniego buforu do przechowywania i oznacz stężenie DNA (ekstrahować wstecznie każdą fazę organiczną w celu odzyskania wszelkich pozostałości zagruntowanego M13).
6. Jedna iteracja przygotowania matrycy może z łatwością wytworzyć kilka mililitrów matrycy stężenia nanomolowego, co wystarczy na setki do tysięcy eksperymentów z pojedynczą cząsteczką.

2. Funkcjonalne szkiełka nakrywkowe

Aby dołączyć DNA do szkiełka nakrywkowego, szkło jest najpierw funkcjonalizowane za pomocą aminozlanu, który następnie jest sprzężony z biotynylowanymi cząsteczkami PEG. Powłoka ta pomaga zmniejszyć niespecyficzne interakcje DNA i białek replikacyjnych z powierzchnią^1,3.

Materiały: Szkiełka nakrywkowe, Słoiki do barwienia, 3-aminopropylotrietoksysilan, Ester metoksy-PEG5k-NHS, Biotyna-PEG5k-NHSester, Aceton, 1M KOH, Etanol, Piekarnik, Sonikator do kąpieli

1. Dokładnie wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe, umieszczając je w słoikach do barwienia i napełniając słoiki etanolem. Sonikować przez 30 minut, wypłukać słoiki i napełnić 1 M KOH. Sonikuj przez 30 minut Powtórz oba prania.
2. W pierwszej reakcji funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody. Napełnij słoiki acetonem i sonikuj przez 10 minut. Ponownie opłucz słoiki acetonem.
3. Przygotować 2 % v/v roztwór odczynnika silanowego w acetonie. Dodaj do słoików do barwienia i mieszaj przez 2 minuty. Ta reakcja sprzęga grupę alkoksylową aminosilanu ze szkłem, pozostawiając reaktywną aminę na następny etap sprzężenia. Ugasić reakcję dużym nadmiarem wody.
4. Osusz szkiełka nakrywkowe, piecząc je w temperaturze 110°C w piekarniku przez 30 minut.
5. Przygotować mieszaninę PEG metoksy:biotyna w proporcji 50:1 w 100 mM NaHCO₃ pH 8,2. Celuj w około 0,2% w/v biotynylowanego PEG.
6. Odpipetować 100 μl mieszanki PEG na suche, silanizowane szkiełko nakrywkowe i umieścić na nim kolejne szkiełko nakrywkowe. Dołączenie szklanej przekładki szkiełka nakrywkowego pozwoli na oddzielenie szkiełek nakrywkowych.
7. Inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze PEG przez 3 godziny, a następnie oddzielić każdą parę szkiełek nakrywkowych i obficie przemyć wodą. Uważaj, aby szkiełka nakrywkowe były funkcjonalne stroną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta PEG.
8. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe i przechowywać w próżni. Powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc, dzięki czemu można wykonać dziesiątki szkiełek nakrywkowych w partii i wykorzystać w razie potrzeby.

Te materiały powinny być wykonane z wyprzedzeniem, a następnie wykorzystane do każdego eksperymentu. Aby rozpocząć każdy eksperyment z pojedynczą cząsteczką, zacznij od złożenia komory przepływowej.

3. Przygotowanie komory przepływowej

Eksperyment jest przeprowadzany przy użyciu prostej komory przepływowej zbudowanej z funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego, dwustronnej taśmy, zjeżdżalni kwarcowej i rurki. Dla każdego doświadczenia z pojedynczą cząsteczką przygotowuje się jedną komorę przepływową^1,4.

Materiały: Dwustronna taśma, Żyletka, Zjeżdżalnia kwarcowa z otworami na rurki, Szybkoschnąca żywica epoksydowa, Funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe (patrz wyżej), Roztwór streptawidyny (25 μL z 1 mg/ml w PBS), Rurka, Bufor blokujący (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg/ml BSA, 0,005% Tween-20)

1. Zacznij od umieszczenia 20-25 ml buforu blokującego w eksykatorze, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza do późniejszych kroków.
2. Weź szkiełko nakrywkowe funkcjonalizowane PEG i rozprowadź 125 roztworu streptawidyny rozcieńczonego PBS na powierzchni. Pozostaw to do inkubacji przez 20 minut, przygotowując inne części komory, pozwalając streptawidynie związać powierzchniowe biotyny.
3. Wytnij kawałek taśmy dwustronnej, aby dopasować go do rozmiaru zjeżdżalni kwarcowej. Zaznacz ołówkiem położenie otworów na rurki na taśmie, tak aby na taśmie można było narysować kontur komory przepływowej (1 mg/ml).
4. Wokół otworów wykonaj prostokąt o szerokości 2 mm. Będzie to służyć jako kanał przepływowy, więc pamiętaj, aby zrobić proste boki i pozostawić miejsce wokół wlotu i wylotu rurki. W razie potrzeby można użyć wielu kanałów lub różnych rozmiarów.
5. Ciąć wzdłuż narysowanego konturu, wykonując proste, czyste cięcia, aby upewnić się, że żaden klej nie wystaje do kanału.
6. Dokładnie wyczyść kwarc za pomocą acetonu lub etanolu, aby usunąć klej z poprzedniej konstrukcji komory przepływowej.
7. Znajdź najlepsze wyrównanie konturu kanału, usuń jedną stronę podkładu samoprzylepnego i ostrożnie umieść taśmę na szkiełku kwarcowym. Uważaj, aby prawidłowo wyrównać taśmę, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane.
8. Odetnij odcinki rurek do wlotu i wylotu komory przepływowej. Pomaga przeciąć koniec rurki pod kątem około 30°, dzięki czemu rurka nie będzie płasko dociskać się do dna komory. Umieść rurki na jakimś wsporniku, aby je zawiesić w celu łatwego przymocowania do komory przepływowej w następnych krokach.
9. Szkiełko nakrywkowe pokryte streptawidyną należy dokładnie spłukać wodą i osuszyć sprężonym powietrzem. Pamiętaj, że tylko jedna strona jest funkcjonalizowana; Uważaj, aby nie przewrócić szkiełka nakrywkowego. Usuń drugą stronę podkładu taśmy i umieść szkiełko kwarcowe na szkiełku nakrywkowym.
10. Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć powietrze uwięzione w kleju. Pomoże to uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.
11. Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Włóż wyciętą rurkę do otworów kwarcu i uszczelnij ją żywicą epoksydową. To musi wyschnąć przez kilka minut.
12. Po wyschnięciu zacznij blokować powierzchnię, przeciągając część odgazowanego bufora blokującego przez jedną z rurek. Igła o rozmiarze 21 idealnie pasuje do rurki 0,76 mm. Przepłucz kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozwól komorze inkubować przez co najmniej pół godziny.

4. Eksperyment z replikacją pojedynczej cząsteczki

Materiały: Preparowana komora przepływowa, SYTOX Orange, mikroskop TIRF, laser 532 nm, kamera CCD, komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu, substrat DNA z toczącym się kołem, białka replikacyjne

1. Po zablokowaniu komory przepływowej wszystko jest gotowe do rozpoczęcia eksperymentu z pojedynczą cząsteczką.
2. Weź komórkę przepływową i umieść ją na stoliku mikroskopu. Przytrzymaj komorę na miejscu za pomocą stage zaciski i upewnij się, że kanał przepływowy jest ustawiony prosto wzdłuż osi y.
3. Podłączyć rurkę wylotową komory przepływowej do pompy strzykawkowej za pomocą rurki łączącej o większej średnicy lub igły. Umieścić wlot w buforze blokującym i pociągnąć strzykawkę do tyłu, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne przesunięcie rurki wylotowej pomoże usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze przepływowej.
4. Rozcieńczyć podstawowy szablon DNA do 25 pM w 1 ml buforu blokującego. Przepływ do komory z umiarkowanym natężeniem przepływu, aby umożliwić dobre pokrycie powierzchni DNA. 0,025 ml/min przez 30 minut działa dobrze. Można to zmieniać w zależności od tego, ile cząsteczek DNA znajduje się na powierzchni dla każdej partii szkiełek nakrywkowych lub ile jest pożądanych w eksperymencie.
5. Gdy DNA znajdzie się w środku, wypłucz nadmiar DNA za pomocą buforu blokującego. Umyj przez co najmniej 200 objętości komórek przepływowych, aby pozbyć się całego wolnego DNA.
6. Rozpocznij odgazowywanie bufora replikacji. W przypadku eksperymentów replikacji E. coli należy to zrobić w temperaturze 37 °C, aby zmniejszyć ryzyko powstania pęcherzyków w ogrzewanej komorze przepływowej.
7. Włącz laser i kamerę. Schłodzona matryca CCD musi osiągnąć temperaturę, zanim będzie można jej użyć.
8. Jeśli wykonujesz eksperyment w temperaturze 37 °C, włącz grzejnik. Upewnij się, że obiektyw styka się z komorą przepływową, w przeciwnym razie później będzie to radiator.
9. Po umyciu i odgazowaniu można przygotować reakcję. Wymieszaj nukleotydy, DTT i SYTOX w buforze replikacyjnym. Następnie dodaj białka i delikatnie wymieszaj.
10. Przelać mieszaninę reakcyjną do komory przepływowej. Ta prędkość przepływu musi być wystarczająca do rozciągnięcia dsDNA. W przypadku kanału przepływowego o szerokości 2 mm i wysokości 100 μm dobrze sprawdza się 0,04 ml/min.
11. Poczekaj, aż mieszanina dostanie się do komory i rozpocznij obrazowanie. Dobrą wskazówką jest przesunięcie pola widzenia na bok kanału i skupienie się na materiale klejącym. Dzięki temu będziesz mieć pewność, że będziesz blisko powierzchni w celu ustawienia ostrości.
12. Dostosuj moc lasera, ostrość mikroskopu i kąt TIRF. Utrzymuj moc na niskim poziomie, aby uniknąć fotorozszczepienia wybarwionego DNA. Akwizycja z prędkością 1-5 klatek na sekundę przez kilka minut w zależności od szybkości replikacji DNA. W razie potrzeby powtórz czynność, aby uzyskać dłuższe trajektorie replikacji lub przejdź do nowego pola, aby zobaczyć więcej cząsteczek.
13. Po tym, jak mieszanina reakcyjna jest prawie pusta, dobrym pomysłem jest przepłynięcie większej ilości bufora z SYTOX, aby zobaczyć inne pola widzenia. Wykonywanie wielu obrazów różnych replikowanych cząsteczek dostarcza danych statystycznych do określania procesowości.

5. Reprezentatywne wyniki

Aktywnie replikujące się cząsteczki są łatwo postrzegane jako rosnące linie barwionego DNA. W naszych eksperymentach przepływ 25 pM substratu M13 daje 100-1000 cząsteczek w polu widzenia 60x, 125 μm x 125 μm (ryc. 1). Przeprowadzanie eksperymentów replikacyjnych przy użyciu białek replikomu E. coli w temperaturze 37 °C (szczegóły w Materiałach) daje 5-50 replikujących się cząsteczek w polu widzenia. Przy równoważnych stężeniach replikosmu T7, który znacznie skuteczniej inicjuje na podłożu, obserwujemy >70% cząsteczek w kontrpróbie pola. W tych warunkach gęstość produktu jest tak wysoka, że pojedyncze cząsteczki są trudne do rozdzielenia i analizy, dlatego eksperymenty T7 są przeprowadzane przy niższych stężeniach białka.

Analiza danych: Aby uzyskać dane dotyczące szybkości, po prostu wykreśl punkt końcowy DNA w funkcji czasu i oblicz nachylenie (Rysunek 2). W przypadku procesowości określ całkowitą długość DNA. Obie te liczby będą musiały zostać przekonwertowane na pary podstawowe. Przed wykonaniem eksperymentu powinieneś znać rozmiar piksela kamery przy odpowiednim powiększeniu. W przypadku konwersji par zasad dobrym oszacowaniem jest po prostu konwersja na podstawie długości krystalograficznej DNA, 2,9 bp/nm. Jednak przepływ laminarny nie spowoduje całkowitego rozciągnięcia DNA, dlatego kalibrację długości DNA należy przeprowadzić, pobierając DNA o znanej długości, np. DNA o długości 48 502 pz λ, przyłączając je do komórki przepływowej za pomocą biotynylowanego oligo i mierząc jego wybarwioną SYTOX długość przy natężeniu przepływu użytym w eksperymencie replikacji. Określenie liczby par zasad/piksel pozwoli na dokładne obliczenie szybkości replikacji i procesowości. Wykonanie wielu zdjęć i filmów dostarczy dużej liczby cząsteczek produktu, co pozwoli na wykreślenie rozkładów szybkości i procesywności (rysunek 2)¹.

Rysunek 1: (Z Ref. 1) a) Rysunek testu replikacji toczącego się koła. (SA, streptawidyna). Synteza nici wiodącej wydłuża ogon łączący okrąg i powierzchnię. Ogon jest przekształcany w dsDNA przez polimerazę nici opóźnionej i rozciągany przez przepływ laminarny.
b) Przykładowe pole widzenia z SYTOX Orange i wzbudzeniem 532 nm. Małe plamki fluorescencyjne są uwiązanymi, niereplikowanymi podłożami. Zwróć uwagę na ekstremalną długość produktów i dużą liczbę produktów na pole (każda komórka przepływu zawiera >5000 takich pól).

Rysunek 2: (zaadaptowany z Ref. 1) a,b) Kymografy typowych replikujących się cząsteczek z eksperymentów T7 (a) i E. coli (b). c) Trajektorie końcowe cząsteczek z a) i b) wykreślone w funkcji czasu. Trajektorie są wyposażone w regresję liniową w celu uzyskania szybkości replikacji. Pokazane przykłady to 99,4 pz ^s-1 i 467,1 pz ^s-1. d) Rozkłady długości produktów replikacji, dopasowane do pojedynczego rozpadu wykładniczego w celu uzyskania procesowości: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Rozkłady szybkości trajektorii pojedynczych cząsteczek, zgodne z pojedynczymi Gaussianami. Oznacza: 75.9 ± 4.8 pz ^s-1 (T7), 535.5 ± 39 pz ^s-1 (E. coli).

Discussion

Jedną z krytycznych kontroli jest zbadanie wpływu barwnika, SYTOX Orange, na interesujące białka replikacyjne. Prostym sposobem na to jest przeprowadzenie eksperymentu replikacji w komórce przepływowej zgodnie z opisem, ale z pominięciem SYTOX. Po przepłynięciu mieszaniny reakcyjnej przez komorę dodaj bufor z SYTOX w celu wybarwienia DNA i zbadaj rozkład długości replikowanych cząsteczek. Alternatywnie, standardowe reakcje masowe mogą być wykorzystane do sprawdzenia dowolnego wpływu SYTOX na szybkość i wydajność replikacji.

Opisany tutaj eksperyment wykorzystuje tylko jeden kanał przepływu. Można to łatwo zmienić, tworząc wielokanałowe komory przepływowe lub stosując PDMS lub podobne urządzenia mikroprzepływowe. Zwiększenie liczby kanałów znacznie ułatwia badania przesiewowe stężeń białek, mutantów lub cząsteczek inhibitorów oraz zwiększa szybkość gromadzenia danych replikacyjnych.

Jak wspomniano, eksperymenty replikacji E. coli przeprowadzamy w temperaturze 37 °C przy użyciu domowej konstrukcji aluminiowej grzałki przepływowej, rezystancyjnego elementu grzejnego (grzałka z wkładem) i zmiennego zasilania. Zapewnia to dobrą stabilność temperatury i pozwala uniknąć zakupu grzejnika obiektywowego. Aby skalibrować grzałkę, po prostu wywierciliśmy otwór w środku kwarcowej komórki przepływowej, włożyliśmy termoparę do kanału przepływowego i przepływaliśmy bufor jak zwykle. Pomiar temperatury bufora komory przepływowej przy rosnącym napięciu pozwala na dokładne ogrzewanie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
M13mp18 ssDNA	New England Biolabs	N4040
Biotynylowany ogon Oligo	Zintegrowane technologie DNA T7
Polimeraza DNA	New England Biolabs	M0274	Użyj bufora replikacyjnego T7 do przygotowania substratu
Fenol / Alkohol izoamylowy / Chloroform	Grupa Roche 03117987001		24:24:1 v/v
3- aminopropylo-trietoksysilan	Sigma-Aldrich	A3648	Inne aminozlany mogą być stosowane lub mieszane z niereaktywnymi silanami w celu uzyskania rzadszych powierzchni
Sukcynimidyl propionian PEG	Nektar		Podobne PEG-i można kupić w Nanocs, CreativePEGWorks itp.
Biotin-PEG-NHS	Nektar
Taśma dwustronna	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μ m
grubość Zjeżdżalnia kwarcowa	Szkło techniczne	20 mm (szer.) x 50 mm (dł.) x 1 mm (wys.)	Rozmiar pasujący do szkiełek nakrywkowych. Wiercenie otworów za pomocą wierteł z końcówką diamentową (DiamondBurs.net)
Rurki polietylenowe	BD Biosciences	427416	0,76 mm ID, 1,22 OD Można zastąpić rurki o innym rozmiarze.
Streptawidyna	Sigma-Aldrich	S4762	Przygotować 1 mg/ml roztwór, 25 μ Porcje L w PBS pH 7,3
Mieszanina roztworu trifosforanu dezoksyrybonukleotydu	New England Biolabs	N0447
Roztwory trifosforanu rybonukleotydu	Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange	Invitrogen	S11368	Można użyć innego barwnika dsDNA
Mikroskop fluorescencyjny z obiektywem 60x TIRF	Olympus Corporation	IX-71	Mikroskop, kamera itp. mogą być zastąpione podobnym sprzętem
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	11 Plus	Działa w trybie napełniania, aby ułatwić wymianę roztworu
Laser 532 nm	Coherent Inc.	Kompas 215M-75	Wybierz długość fali, która odpowiada wybranej plamie
Kamera EMCCD	Hamamatsu Corp.	ImagEM
	Chroma Technology Corp.	HQ600/75m
T7 Replication: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutaminianu potasu, 10 mM chlorek magnezu, 100 μ g/mL BSA, z 5 mM ditiotreitolem, 600 μ M dNTPs, 300 #x03BC; M ATP, 300 #x03BC; M CTP i 15 nM SYTOX Orange dodawane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane jako: 5 nM gp4 (heksamer), 40 nM polimeraza (1:1 gp5: tioredoksyna), 360 nm gp2,51,5. E. coli Replikacja: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM octan magnezu, 80 mM chlorek potasu, 100 μ g/ml BSA z 10 mM ditiotreitolem, 40 μ M dNTPs, 200 #x03BC; M rNTP i 15 nM SYTOX Orange dodawane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane jako: 30 nM DnaB (heksamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM i alfa; ε θ, 15 nM τ 2γ 1δ δ ’ χ ψ lub τ 3δ δ ’ χ ψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6
E. coli Replikacja: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM octan magnezu, 80 mM chlorek potasu, 100 μ g/ml BSA z 10 mM ditiotreitolem, 40 μ M dNTPs, 200 #x03BC; M rNTP i 15 nM SYTOX Orange dodawane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane jako: 30 nM DnaB (heksamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM i alfa; ε θ, 15 nM τ 2γ 1δ δ ’ χ ψ lub τ 3δ δ ’ χ ψ, 30 nM β (ściemniacz), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6