Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Opisujemy prostą metodę czasu rzeczywistego opartą na mikroskopii fluorescencyjnej, służącą do obserwacji replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Kolisty, rozwidlony matrycowy DNA jest przytwierdzony do funkcjonalizowanej szkiełka podstawowego i poddawany intensywnej replikacji po wprowadzeniu białek replikacyjnych i nukleotydów (Rycina 1). Rosnący produkt w postaci dwuniciowego DNA (dsDNA) jest rozciągany za pomocą przepływu laminarnego i wizualizowany przy użyciu barwnika interkalującego. Pomiar pozycji rosnącego końca DNA w czasie rzeczywistym umożliwia precyzyjne określenie szybkości replikacji (Rycina 2). Ponadto długość gotowych produktów DNA pozwala na ocenę procesywności replikacji. Eksperyment ten można przeprowadzić w sposób bardzo prosty i szybki, a wymaga on jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednio czułą kamerą.

Protokół

Przed przeprowadzeniem eksperymentu z replikacją pojedynczej cząsteczki należy wcześniej przygotować kilka materiałów.

1. Matryca replikacji DNA

Substratem dla reakcji replikacji jest biotynilowany, ogonowany M13 typu rolling circle przygotowany przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej^1,2.

Materiały: jednoniciowy DNA M13mp18, biotynilowany starter oligonukleotydowy ogona (5'-Biotin-T₃₆AATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT-3'), polimeraza DNA T7, blok grzejny, fenol/alkohol izoamylowy/chloroform

1. Przyłącz biotynilowany oligonukleotyd ogona do M13, dodając 10-krotny nadmiar oligonu w buforze TBS (330 nM oligonu ogona, 33 nM M13).
2. Podgrzej mieszaninę do 65 °C w bloku grzewczym. Po osiągnięciu tej temperatury wyłącz blok i pozwól na powolne schłodzenie, aby zapewnić prawidłowe przyłączenie startera.
3. Dodaj M13 z przyłączonym starterem do mieszaniny zawierającej 64 nM polimerazy DNA T7 oraz buforu do replikacji T7 z dNTPs i MgCl₂.
4. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 12 minut, a następnie przerwij ją, dodając 100 mM EDTA.
5. Oczyść uzupełniony produkt DNA za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie przeprowadź dializę do buforu TE lub innego odpowiedniego buforu do przechowywania i wyznacz stężenie DNA (przeprowadź reekstrakcję każdej fazy organicznej, aby odzyskać pozostałe M13 z przyłączonym starterem).
6. Jedna iteracja przygotowania matrycy pozwala na łatwe otrzymanie kilku mililitrów matrycy o stężeniu nanomolarnym, co wystarcza na setki lub tysiące eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami.

2. Funkcjonalizowane szkiełka nakrywkowe

Aby przytwierdzić DNA do szkiełka podstawowego, szkło jest najpierw funkcjonalizowane aminosilanem, który następnie jest sprzęgany z biotynowanymi cząsteczkami PEG. Powłoka ta pomaga ograniczyć niespecyficzne oddziaływania DNA i białek replikacyjnych z powierzchnią^1,3.

Materiały: szkiełka nakrywkowe, słoiki do barwienia, 3-aminopropylotrietoksysilan, ester Methoxy-PEG5k-NHS, ester Biotin-PEG5k-NHS, aceton, 1M KOH, etanol, piec, myjka ultradźwiękowa

1. Dokładnie oczyść szklane laminki, umieszczając je w naczyniach do barwienia i wypełniając naczynia etanolem. Poddaj działaniu myjki ultradźwiękowej przez 30 minut, a następnie wypłucz naczynia i napełnij je 1 M KOH. Poddaj działaniu myjki ultradźwiękowej przez 30 minut. Powtórz oba etapy mycia.
2. Przed pierwszą reakcją funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody. Napełnij naczynia acetonem i poddaj działaniu myjki ultradźwiękowej przez 10 min. Ponownie wypłucz naczynia acetonem.
3. Przygotuj 2 % v/v roztwór odczynnika silanowego w acetonie. Dodaj go do naczyń do barwienia i mieszaj przez 2 minuty. Reakcja ta łączy grupę alkoksylową aminosilanu ze szkłem, pozostawiając reaktywną grupę aminową do kolejnego etapu sprzęgania. Przerwij reakcję, dodając duży nadmiar wody.
4. Wysusz laminki, wypiekając je w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 minut.
5. Przygotuj mieszaninę PEG metoksylowanego i biotynilowanego w stosunku 50:1 w 100 mM NaHCO₃ pH 8.2. Dąż do uzyskania stężenia biotynilowanego PEG na poziomie około 0.2 % w/v.
6. Nanieś pipetą 100 μL mieszaniny PEG na suchą, silanizowaną laminkę i przykryj ją drugą laminką. Zastosowanie szklanego dystansu pozwoli na późniejsze rozdzielenie laminek.
7. Inkubuj laminki w roztworze PEG przez 3 godziny, a następnie rozdziel każdą parę laminek i dokładnie wypłucz wodą. Należy uważać, aby trzymać laminki stroną funkcjonalizowaną do góry, ponieważ tylko jedna strona zostanie pokryta warstwą PEG.
8. Wysusz laminki i przechowuj w próżni. Powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc, dzięki czemu w jednej partii można przygotować dziesiątki laminek i używać ich w miarę potrzeb.

Materiały te należy przygotować z wyprzedzeniem, a następnie wykorzystać w każdym eksperymencie. Aby rozpocząć każdy eksperyment z pojedynczą cząsteczką, należy zacząć od montażu komory przepływowej.

3. Przygotowanie komory przepływowej

Eksperyment jest przeprowadzany z użyciem prostej komory przepływowej skonstruowanej z funkcjonalizowanej lamellipse, dwustronnej taśmy klejącej, szkiełka kwarcowego i rurek. Dla każdego eksperymentu z pojedynczą cząsteczką przygotowuje się jedną komorę przepływową^1,4.

Materiały: Taśma dwustronna, żyletka, szkiełko kwarcowe z otworami na rurki, szybkoschnący epoksyd, funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe (patrz wyżej), roztwór streptawidyny (25 μL w stężeniu 1 mg/mL w PBS), rurki, bufor blokujący (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 mg/mL BSA, 0.005% Tween-20)

1. Zacznij od umieszczenia 20-25 mL buforu blokującego w eksykatorze, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed kolejnymi etapami.
2. Pobierz szkiełko nakrywkowe funkcjonalizowane PEG i rozprowadź na jego powierzchni 125 µL roztworu streptawidyny rozcieńczonego w PBS. Pozostaw do inkubacji na 20 minut podczas przygotowywania pozostałych części komory, aby umożliwić związanie streptawidyny z biotynami na powierzchni.
3. Dotnij kawałek dwustronnej taśmy tak, aby odpowiadał rozmiarowi płytki kwarcowej. Zaznacz ołówkiem na taśmie położenie otworów na rurki, tak aby można było narysować na niej obrys komory przepływowej (1 mg/mL).
4. Wyznacz prostokąt o szerokości 2 mm wokół otworów. Będzie on pełnić funkcję kanału przepływowego, dlatego należy zadbać o proste krawędzie i pozostawienie wolnego miejsca wokół wlotu i wylotu rurek. W razie potrzeby można zastosować wiele kanałów lub różne rozmiary.
5. Wytnij wzdłuż narysowanego obrysu, wykonując proste i czyste cięcia, aby upewnić się, że żadna część kleju nie wystaje do wnętrza kanału.
6. Dokładnie oczyść kwarc za pomocą acetonu lub etanolu, aby usunąć pozostałości kleju z poprzedniej konstrukcji celi przepływowej.
7. Znajdź optymalne wyrównanie obrysu kanału, usuń jedną stronę warstwy ochronnej kleju i ostrożnie przyklej taśmę do płytki kwarcowej. Należy zadbać o prawidłowe wyrównanie taśmy, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane.
8. Dotnij odcinki rurek na wlot i wylot celi przepływowej. Warto uciąć koniec rurki pod kątem około 30°, aby nie przylegała ona płasko do dna komory. Umieść rurki na jakimś podłożu, aby zawiesić je dla łatwego przytwierdzenia do celi przepływowej w kolejnych krokach.
9. Dokładnie wypłucz szkiełko nakrywkowe pokryte streptawidyną wodą i osusz sprężonym powietrzem. Pamiętaj, że funkcjonalizowana jest tylko jedna strona; uważaj, aby nie obrócić szkiełka nakrywkowe. Usuń drugą stronę warstwy ochronnej taśmy i połóż płytkę kwarcową na szkiełku nakrywkowym.
10. Lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć uwięzione w kleju powietrze. Pomoże to uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.
11. Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Wsuń docięte rurki w otwory w kwarcu i utwierdź je żywicą epoksydową. Musi ona schnąć przez kilka minut.
12. Po wyschnięciu rozpocznij blokowanie powierzchni, przepuszczając część odgazowanego buforu blokującego przez jedną z rurek. Igła o rozmiarze 21-gauge idealnie pasuje do rurki o średnicy 0.76 mm. Przepłucz kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw komorę do inkubacji na co najmniej pół godziny.

4. Eksperyment replikacji pojedynczej cząsteczki

Materiały: Przygotowana komora przepływowa, SYTOX Orange, mikroskop TIRF, laser 532 nm, kamera CCD, komputer z oprogramowaniem do akwizycji obrazu, substrat DNA w formie pętli toczącej się (rolling-circle), białka replikacyjne

1. Po zablokowaniu celi przepływowej wszystko jest gotowe do rozpoczęcia eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami.
2. Należy wziąć celę przepływową i umieścić ją na stoliku mikroskopu. Komorę należy przymocować za pomocą klipsów stolika, upewniając się, że kanał przepływowy jest ustawiony prostopadle wzdłuż osi y.
3. Należy połączyć rurkę wylotową celi przepływowej z pompą strzykawkową za pomocą rurki łączącej o większej średnicy lub igły. Wlot należy umieścić w buforze blokującym i odciągnąć tłok strzykawki, aby usunąć powietrze z rurki. Delikatne potrząśnięcie rurką wylotową pomoże usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w celi przepływowej.
4. Należy rozcieńczyć zapas matrycy DNA do stężenia 25 pM w 1 mL buforu blokującego. Roztwór należy wprowadzić do komory z umiarkowaną prędkością przepływu, aby zapewnić dobre pokrycie powierzchni przez DNA. Dobrze sprawdza się prędkość 0,025 mL/min przez 30 minut. Parametr ten można zmieniać w zależności od tego, ile cząsteczek DNA znajduje się na powierzchni dla każdej partii szkiełek podstawowych lub ile jest wymaganych do eksperymentu.
5. Po wprowadzeniu DNA należy wypłukać nadmiar DNA za pomocą buforu blokującego. Płukanie powinno trwać przez co najmniej 200 objętości celi przepływowej, aby usunąć całe wolne DNA.
6. Należy rozpocząć odgazowywanie buforu do replikacji. W przypadku eksperymentów z replikacją E. coli należy wykonać to w temperaturze 37 °C, aby zmniejszyć ryzyko powstania pęcherzyków powietrza w podgrzewanej komorze przepływowej.
7. Należy włączyć laser i kamerę. Chłodzona matryca CCD musi osiągnąć odpowiednią temperaturę przed rozpoczęciem pracy.
8. W przypadku przeprowadzania eksperymentu w 37 °C należy włączyć grzałkę. Należy upewnić się, że obiektyw styka się z celą przepływową, w przeciwnym razie będzie on działał jako radiator.
9. Po płukaniu i odgazowaniu można przygotować mieszaninę reakcyjną. Należy wymieszać nukleotydy, DTT i SYTOX w buforze do replikacji. Następnie należy dodać białka i delikatnie wymieszać.
10. Mieszaninę reakcyjną należy wprowadzić do celi przepływowej. Prędkość przepływu musi być wystarczająca do rozciągnięcia dsDNA. Dla kanału przepływowego o szerokości 2 mm i wysokości 100 µm dobrze sprawdza się prędkość 0,04 mL/min.
11. Należy odczekać, aż mieszanina wypełni komorę, a następnie rozpocząć obrazowanie. Przydatną wskazówką jest przesunięcie pola widzenia na bok kanału i ustawienie ostrości na materiale klejącym. Zapewni to znalezienie się w pobliżu powierzchni podczas ustawiania ostrości.
12. Należy dostosować moc lasera, ostrość mikroskopu i kąt TIRF. Moc powinna pozostać niska, aby uniknąć fotolizy barwionego DNA. Akwizycję należy prowadzić z częstotliwością 1-5 klatek/sekundę przez kilka minut, w zależności od tempa replikacji DNA. W razie potrzeby można powtórzyć procedurę, aby uzyskać dłuższe trajektorie replikacji lub przenieść się do nowego pola widzenia, aby zaobserwować więcej cząsteczek.
13. Gdy mieszanina reakcyjna jest prawie wyczerpana, zaleca się wprowadzenie większej ilości buforu z SYTOX, aby obejrzeć inne pola widzenia. Wykonanie wielu obrazów różnych replikowanych cząsteczek pozwala na uzyskanie statystyk niezbędnych do określenia procesywności.

5. Reprezentatywne wyniki

Aktywnie replikujące się cząsteczki są łatwo widoczne jako rosnące linie barwionego DNA. W naszych eksperymentach przepływ 25 pM substratu M13 daje 100-1000 cząsteczek w polu widzenia o rozmiarach 125 μm x 125 μm przy powiększeniu 60x (Rysunek 1). Przeprowadzenie eksperymentów replikacyjnych z użyciem białek replisomu E. coli w temperaturze 37 °C (szczegóły w sekcji Materiały) daje 5-50 replikujących się cząsteczek na pole widzenia. Przy równoważnych stężeniach replisomu T7, który inicjuje replikację na substracie znacznie wydajniej, obserwujemy, że replikuje >70% cząsteczek w polu widzenia. Warunki te prowadzą do tak wysokiej gęstości produktu, że poszczególne cząsteczki są trudne do rozróżnienia i analizy, dlatego eksperymenty z T7 są przeprowadzane przy niższych stężeniach białek.

Analiza danych: Aby uzyskać dane dotyczące szybkości, należy narysować wykres punktu końcowego DNA w funkcji czasu i obliczyć nachylenie prostej (Rysunek 2). W celu określenia procesywności należy wyznaczyć całkowitą długość DNA. Obie te wartości muszą zostać przeliczone na pary zasad. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy znać rozmiar piksela kamery przy odpowiednim powiększeniu. Dobrym przybliżeniem przy konwersji na pary zasad jest przeliczenie oparte na krystalograficznej długości DNA, wynoszącej 2,9 bp/nm. Jednak przepływ laminarny nie rozciągnie DNA całkowicie, dlatego należy przeprowadzić kalibrację długości DNA, wykorzystując fragment DNA o znanej długości, np. 48 502 bp λ DNA, przytwierdzając go do komory przepływowej za pomocą biotynulowanego oligonukleotydu i mierząc jego długość po barwieniu SYTOX przy szybkości przepływu stosowanej w eksperymencie replikacji. Wyznaczenie liczby par zasad/piksel pozwoli na dokładne obliczenie szybkości replikacji i procesywności. Wykonanie licznych zdjęć i filmów dostarczy dużej liczby cząsteczek produktu, co umożliwi narysowanie rozkładów szybkości i procesywności (Rysunek 2)¹.

Rycina 1: (Z Ref. 1) a) Schemat testu replikacji toczącego się koła. (SA, streptawidyna). Synteza nici prowadzącej wydłuża ogon łączący koło z powierzchnią. Ogon jest przekształcany w dsDNA przez polimerazę nici opóźnionej i rozciągany przez przepływ laminarny.
b) Przykładowe pole widzenia z barwnikiem SYTOX Orange i wzbudzeniem 532 nm. Małe fluorescencyjne punkty to przytwierdzone, niereplikowane substraty. Zwróć uwagę na ekstremalną długość produktów oraz ich dużą liczbę w jednym polu (każda komora przepływowa zawiera >5000 takich pól).

Rysunek 2: (adaptacja z Ref. 1) a,b) Kymografy typowych replikujących się cząsteczek z eksperymentów T7 (a) oraz E. coli (b). c) Trajektorie końcowe cząsteczek z a) i b) przedstawione w funkcji czasu. Trajektorie dopasowano za pomocą regresji liniowej w celu wyznaczenia szybkości replikacji. Przedstawione przykłady to 99.4 bp s^-1 oraz 467.1 bp s^-1. d) Rozkłady długości produktów replikacji, dopasowane do pojedynczego zaniku wykładniczego w celu wyznaczenia procesywności: 25.3 ± 1.7 kbp (T7), 85.3 ± 6.1 kbp (E. coli). e) Rozkłady szybkości trajektorii pojedynczych cząsteczek, dopasowane do pojedynczych rozkładów Gaussa. Średnie: 75.9 ± 4.8 bp s^-1 (T7), 535.5 ± 39 bp s^-1 (E. coli).

Dyskusja

Kluczową kontrolą jest zbadanie wpływu barwnika SYTOX Orange na analizowane białka replikacyjne. Prostym sposobem wykonania tej kontroli jest przeprowadzenie eksperymentu replikacji w komorze przepływowej zgodnie z opisem, ale z pominięciem SYTOX. Po przepływie mieszaniny reakcyjnej przez komorę należy dodać bufor z SYTOX w celu zabarwienia DNA i zbadać rozkład długości zreplikowanych cząsteczek. Alternatywnie można wykorzystać standardowe reakcje w układzie bulk, aby sprawdzić ewentualny wpływ SYTOX na szybkość i wydajność replikacji.

Opisany tutaj eksperyment wykorzystuje tylko jeden kanał przepływowy. Można to łatwo zmienić, tworząc wielokanałowe komory przepływowe lub wykorzystując urządzenia mikroprzepływowe z PDMS lub podobnych materiałów. Zwiększenie liczby kanałów znacznie ułatwia przesiewanie stężeń białek, mutantów lub cząsteczek inhibitorów oraz przyspiesza gromadzenie danych z powtórzeń.

Jak wspomniano, eksperymenty dotyczące replikacji E. coli przeprowadzamy w temperaturze 37 °C, wykorzystując własnoręcznie zbudowany grzejnik do aluminiowej celi przepływowej, rezystancyjny element grzejny (grzałkę patronową) oraz regulowany zasilacz. Zapewnia to dobrą stabilność temperatury i pozwala uniknąć zakupu grzejnika obiektywu. Aby skalibrować grzejnik, po prostu wywierciliśmy otwór w centrum górnej części kwarcowej celi przepływowej, wstawiliśmy termoparę do kanału przepływowego i przepuszczaliśmy bufor w standardowy sposób. Pomiar temperatury buforu w celi przepływowej przy zwiększaniu napięcia pozwala na precyzyjne ogrzewanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ssDNA M13mp18	New England Biolabs	N4040
biotynilowany oligonukleotyd ogonowy	Integrated DNA Technologies
Polimeraza DNA T7	New England Biolabs	M0274	Do przygotowania substratu należy użyć buforu do replikacji T7
fenol/alkohol izoamylilowy/chloroform	Grupa Roche	03117987001	24:24:1 v/v
3-aminopropylotrietoksysilan	Sigma-Aldrich	A3648	Można zastosować inne aminosilany lub zmieszać je z silanami niereaktywnymi wobec amin w celu uzyskania rzadszego rozmieszczenia cząsteczek na powierzchni
Propionian PEG z grupą sukcynimidylową	Nektar		Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp.
Biotyna-PEG-NHS	Nektar
Taśma dwustronna	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μgrubość m
Przedmiotowy szkiełko kwarcowe	Szkło techniczne	20 mm (szer.) x 50 mm (dł.) x 1 mm (wys.)	Przyciąć do rozmiaru szkiełek podstawowych. Wywiercić otwory za pomocą wierteł z końcówką diamentową (DiamondBurs.net).
Przewody polietylenowe	BD Biosciences	427416	śr. wewn. 0,76 mm, śr. zewn. 1,22 mm Można zastosować rurki o innych rozmiarach.
Streptawidyna	Sigma-Aldrich	S4762	Przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml, 25 μalikwoty L w PBS pH 7,3
Mieszanina roztworów dideoksyrybonukleotydotrifosforanów	New England Biolabs	N0447
Roztwory rybonukleotydotrifosforanów	Amersham	272056 272066 272076 272086
SYTOX Orange	Invitrogen	S11368	Można zastosować inny barwnik do dsDNA
Mikroskop fluorescencyjny z obiektywem TIRF 60x	Olympus Corporation	IX-71	Mikroskop, kamera itp. mogą zostać zastąpione podobnym sprzętem
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus	11 Plus	Pracuj w trybie uzupełniania (refill mode), aby ułatwić wymianę roztworów
laser 532 nm	Coherent Inc.	Compass 215M-75	Wybierz długość fali odpowiadającą wybranemu barwnikowi
Kamera EMCCD	Hamamatsu Corp.	Obraz
Filtr emisyjny	Chroma Technology Corp.	HQ600/75m
Replikacja T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutaminianu potasu, 10 mM chlorku magnezu, 100 μg/ml BSA, z 5 mM ditiotreitolem, 600 μM dNTP, 300 μM ATP, 300 μM CTP oraz 15 nM SYTOX Orange dodane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane w następujących stężeniach: 5 nM gp4 (heksamer), 40 nM polimeraza (1:1 gp5: tioredoksyna), 360 nM gp2.51,5. E. coli Replikacja: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM octanu magnezu, 80 mM chlorku potasu, 100 μg/ml BSA z 10 mM ditiotreitolem, 40 μM dNTPs, 200 μM rNTP oraz 15 nM SYTOX Orange dodane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane w następujących stężeniach: 30 nM DnaB (heksamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ lub τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6
E. coli Replikacja: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM octanu magnezu, 80 mM chlorku potasu, 100 μg/ml BSA z 10 mM ditiotreitolem, 40 μM dNTP, 200 μM rNTP oraz 15 nM SYTOX Orange dodane bezpośrednio przed użyciem. Białka dodane w stężeniach: 30 nM DnaB (heksamer), 180 nM DnaC (monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ2γ1δδ’χψ lub τ3δδ’χψ, 30 nM β (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 nM PriA, 40 nM PriB, 320 nM PriC, 480 nM DnaT1,6