Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).
Artykuł metodologiczny
Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W 2006 roku Yamanaka i współpracownicy po raz pierwszy wykazali, że dostarczenie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4 za pomocą retrowirusów pozwala na indukcję stanu pluripotencji w fibroblastach myszy.1 Ta sama grupa badawcza zgłosiła również sukces w przeprogramowaniu ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) przy użyciu ludzkich wersji tych samych czynników transkrypcyjnych dostarczonych przez wektory retrowirusowe.2 Ponadto James Thomson et al. donieśli, że koekspresja innego zestawu czynników (Oct4, Sox2, Nanog i Lin28) za pośrednictwem lentiwirusów pozwala na przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w komórki iPS.3
Komórki iPS są podobne do komórek ES pod względem morfologii, proliferacji oraz zdolności do różnicowania się we wszystkie typy tkanek organizmu. Ludzkie komórki iPS mają wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES, unikając jednocześnie dylematów etycznych związanych z niszczeniem embrionów. Generowanie specyficznych dla pacjenta komórek iPS pozwala ominąć istotną przeszkodę w spersonalizowanych terapiach medycyny regeneracyjnej, eliminując możliwość odrzucenia immunologicznego nieautologicznych przeszczepionych komórek.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów z wykorzystaniem zestawu Stemgent Human TF Lentivirus Set. Wykazujemy również, że komórki przeprogramowane za pomocą tego zestawu zaczynają wykazywać morfologię iPS cztery dni po transdukcji. Przy użyciu Stemolecule Y27632 dokonaliśmy selekcji komórek iPS i zaobserwowaliśmy prawidłową morfologię po trzech kolejnych rundach wyławiania kolonii i pasażowania. Wykazujemy ponadto, że po przeprogramowaniu komórki wykazywały ekspresję markera pluripotencji AP, markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3 oraz markerów jądrowych Oct4, Sox2 i Nanog.
Protokół
1. Reprogramowanie
- Wysiać komórki BJ z gęstością 1 x 105 komórek na studnię płytki 6-dołkowej. Hodować komórki w 2 ml pożywki wzrostowej (450 ml EMEM uzupełnionej o 50 ml FBS kwalifikowanego dla ES, 5 ml 10 mM nieessentialnych aminokwasów, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy i 0,9 ml 55 mM β-merkaptoetanolu) przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Tego samego dnia rozpocząć przygotowywanie płytek z warstwą wspomagającą MEF, dodając 0,1% żelatyny rozcieńczonej w wodzie do płytki 6-dołkowej i inkubując przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Po inkubacji usunąć pożywkę z komórek BJ i dodać do każdej studni 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej o 6 μg/ml polybrene, 500 μl hOct4-lentiwirusa, 50 μl hSox2-lentiwirusa, 50 μl hNanog-lentiwirusa oraz 50 μl hLin28-lentiwirusa. Delikatnie zakołysać płytką, aby zapewnić równomierne pokrycie pożywką. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Tego samego dnia wyjąć 1 fiolkę komórek MEF CF-1 z ciekłego azotu i rozmrozić. Usunąć płyn ze studni pokrytych żelatyną (patrz krok 1.2) i dodać komórki wspomagające MEF z gęstością 0,2 x 105 komórek/studnię. Całkowita objętość na studnię powinna wynosić 2 ml komórek w pożywce wzrostowej MEF (450 ml DMEM uzupełnionej o 50 ml FBS i 5 ml nieessentialnych aminokwasów).
- Następnego dnia odkleić komórki BJ za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i resuspender w pożywce wzrostowej. Usunąć pożywkę z płytki z warstwą wspomagającą MEF (patrz krok 1.4) i dodać 2 ml/studnię zawiesiny komórek BJ. Stężenie komórek powinno wynosić około 5 x 104 komórek/studnię. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- 24 godziny po ponownym wysianiu wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli ludzkich komórek ES/iPS (400 ml DMEM/F12 uzupełnionej o 100 ml Knockout Serum Replacement, 5 ml 10 mM nieessentialnych aminokwasów, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 0,9 ml 55 mM β-merkaptoetanolu i 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego bFGF). Wymieniać pożywkę co 24 godziny przez 7 dni.
- Po siedmiu dniach zmienić pożywkę na warunkową pożywkę MEF (patrz sekcja 2).
2. Przygotowanie medium uwarunkowanego przez MEF
- Zasiej komórki zasilające MEF CF-1 w zagęszczeniu 2 x 105 komórek/dołek na płytce 6-dołkowej w 2 ml pożywki wzrostowej MEF. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.
- Wymień pożywkę na pożywkę do hodowli ludzkich komórek ES/iPS. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.
- Zbieraj supernatant co 24 godziny przez cztery dni. Przefiltruj supernatant przez filtr 0,22 μm.
- Uzupełnij supernatant o 50 ng/ml bFGF.
3. Selekcja i pasażowanie kolonii iPS
- Wybierz kolonię o charakterystyce ES i wysiej ją ponownie w pożywce do hodowli ludzkich komórek ES/iPS uzupełnionej o 10 μM Stemolecule Y27632 na naczyniach hodowlanych uprzednio wysianych z komórkami feederowymi MEF linii CF-1. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny przez pierwsze siedem dni (bez dodawania Stemolecule Y27632). Po siedmiu dniach zmień pożywkę na kondycjonowaną pożywkę MEF (patrz sekcja 2 w celu przygotowania). Kontynuowano pasażowanie komórek, aż uzyskały one typową morfologię ludzkich komórek ES.
4. Badanie immunocytochemiczne markerów pluripotencji
- Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.
- Utrwalić komórki, dodając 500 μl utrwalacza, inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.
- Zablokować niespecyficzne wiązanie, dodając 500 μl buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
- Inkubować komórki z 250 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyto TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog oraz Lin28 w rozcieńczeniach 1:100).
- Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.
- Inkubować komórki z 250 μl przeciwciała wtórnego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem (użyto koniugatu Goat anti-Mouse IgM Cy3, Goat anti-Mouse IgG Cy3, Goat anti-Rat IgM Cy3 oraz Goat anti-Rabbit Cy3 w rozcieńczeniach 1:300).
- Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.
- Do ostatniego płukania dodać DAPI (stężenie końcowe 1 μg/ml) i inkubować przez 5 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.
- Przeanalizować komórki pod powiększeniem.
Część 5: Reprezentatywne wyniki
1. Wyniki morfologii:
Komórki fibroblastów napletka ludzkiego (BJ) poddano kotransdukcji czynnikami Oct4, Sox2, Nanog i Lin28. Zmiany morfologiczne zaobserwowano już w 4. dniu po transdukcji, a skupiska komórek stały się bardziej zwarte w 17. dniu (Rysunek 1). Kolonie pobrano ręcznie w 25. dniu i hodowano na warstwie wspierającej z komórek MEF szczepu CF-1. Aby ułatwić tworzenie kolonii iPS po reprogramowaniu, podczas każdego pasażowania w trakcie wstępnego wysiewania na noc stosowano inhibitor ROCK Y27632 firmy Stemolecule. Kolonie iPS o dobrej morfologii zaobserwowano po trzech kolejnych rundach pobierania i pasażowania kolonii.
2. Ekspresja markerów pluripotencji:
Aby dalej scharakteryzować wyizolowane kolonie komórek iPS, sprawdzono obecność typowych markerów pluripotencji ekspresywnych w komórkach ES. Kolonie wykazywały silną aktywność fosfatazy alkalicznej (AP) (Rysunek 2). Ponadto w koloniach komórek iPS przeprowadzono immunocytochemię (ICC) z wykorzystaniem panelu przeciwciał specyficznych dla markerów pluripotencji, w tym markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3, a także markerów jądrowych Oct4, Sox2 i Nanog. Wyizolowane kolonie iPS były pozytywne pod kątem wszystkich markerów (Rysunek 3). Wyniki ICC wykazują, że komórki iPS prezentowały odpowiedni wzorzec ekspresji markerów pluripotencji, co dowodzi, że komórki te ściśle przypominają niezróżnicowane ludzkie komórki ES.
Rycina 1: Zmiany morfologiczne transdukowanych komórek BJ. Obrazy w jasnym polu typowej kolonii komórek iPS utworzonej (A) 4 dni i (B) 17 dni po transdukcji.
Rysunek 2: Aktywność AP przeprogramowanych komórek BJ. Trzy różne kolonie barwione zestawem Stemgent Alkaline Phosphatase Staining Kit.
Rysunek 3: Ludzkie komórki iPS wykazują wysoką ekspresję następujących markerów specyficznych dla komórek ES: markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3 oraz markerów jądrowych Oct 4, Nanog i Sox2.
Dyskusja
Wyniki te wykazują, że zestaw lentiwirusowy Stemgent Human TF może być wykorzystany do wydajnego generowania kolonii iPS poprzez indukcję ektopowej ekspresji przetransdukowanych czynników transkrypcyjnych w ludzkich fibroblastach. Projektując eksperymenty z przeprogramowaniem, należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych w celu optymalizacji wydajności procesu. Po pierwsze, w pierwszym kroku transdukcji może być konieczna modyfikacja stosunku aktywnego wirusa do komórek docelowych (multiplicity of infection M.O.I.), aby osiągnąć optymalną wydajność transdukcji. Po drugie, warunki wzrostu komórek docelowych mogą wpływać na przeprogramowanie. Komórki zdrowe i proliferujące są bardziej podatne na przeprogramowanie. Po trzecie, przy modyfikowaniu protokołu dla różnych liczb komórek zaleca się, aby liczba komórek docelowych była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego. Wreszcie, w celu zapewnienia sukcesu przeprogramowania należy rozważyć zastosowanie inhibitorów ROCK, takich jak Y27632, ponieważ niedawne badania wykazały ich przydatność w zwiększaniu przeżywalności kolonii hES.4,5
Oświadczenia
Autorzy tego artykułu są zatrudnieni przez firmę Stemgent, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszej pracy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw lentiwirusów TF dla ludzi | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| Przeciwciało TRA-1-81 | Stemgent | 09-0012 | |
| Przeciwciało TRA-1-60 | Stemgent | 09-0009 | |
| Przeciwciało SSEA-4 | Stemgent | 09-0003 | |
| Przeciwciało SSEA-3 | Stemgent | 09-0014 |
Bibliografia
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
Przedruki i uprawnienia
