Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu Stemgent Human TF Lentivirus

Summary

Pokazujemy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych za pośrednictwem lentiwirusa za pośrednictwem ludzkich czynników Oct4, Sox2, Nanog i Lin28. Pluripotencja została potwierdzona przez morfologię i obecność markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Abstract

W 2006 roku Yamanaka i współpracownicy po raz pierwszy wykazali, że dostarczanie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc i Klf4 za pośrednictwem retrowirusa jest w stanie indukować stan pluripotencjalny w fibroblastach myszy. ¹ Ta sama grupa doniosła również o udanym przeprogramowaniu ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) przy użyciu ludzkich wersji tych samych czynników transkrypcyjnych dostarczanych przez wektory retrowirusowe. ² Ponadto James Thomson i in. stwierdzili, że koekspresja innego zestawu czynników (Oct4, Sox2, Nanog i Lin28) za pośrednictwem lentiwirusa była zdolna do przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w komórki iPS. ³

iPS komórki są podobne do komórek ES pod względem morfologii, proliferacji i zdolności do różnicowania się we wszystkich typach tkanek ciała. Ludzkie komórki iPS mają wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES bez etycznego dylematu zniszczenia zarodka. Wytwarzanie specyficznych dla pacjenta komórek iPS pozwala ominąć ważną przeszkodę na drodze do spersonalizowanych terapii medycyny regeneracyjnej, eliminując możliwość odrzucenia immunologicznego przeszczepionych komórek nieautologicznych.

Tutaj demonstrujemy protokół przeprogramowania ludzkich komórek fibroblastów za pomocą zestawu Stemgent Human TF Lentivirus Set. Pokazujemy również, że komórki przeprogramowane za pomocą tego zestawu zaczynają wykazywać morfologię iPS cztery dni po transdukcji. Używając Stemolecule Y27632, wyselekcjonowaliśmy komórki iPS i zaobserwowaliśmy prawidłową morfologię po trzech sekwencyjnych rundach pobierania i pasażowania kolonii. Wykazaliśmy również, że po przeprogramowaniu komórki wyświetlały marker pluripotencji AP, markery powierzchniowe TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3 oraz markery jądrowe Oct4, Sox2 i Nanog.

Protocol

1. Przeprogramowanie

1. Nasiona komórek BJ o gęstości 1 x 10⁵ komórek na dołek płytki 6-dołkowej. Hodować komórki w 2 ml pożywki wzrostowej (450 ml EMEM uzupełnionej 50 ml FBS kwalifikowanego przez ES, 5 ml 10 mM aminokwasów endogennych, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy i 0,9 ml 55 mM β-merkaptoetanolu) przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
2. Tego samego dnia należy rozpocząć przygotowywanie płytek podających MEF, dodając 0,1% żelatyny rozcieńczonej w wodzie do płytki 6-dołkowej i inkubując przez noc w temperaturze 37°C i 5%_CO2.
3. Po inkubacji usunąć pożywkę z komórek BJ i dodać 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej 6 μg/ml polibrenu, 500 μl hOct4-lentiwirusa, 50 μl hSox2-lentiwirusa, 50 μl hNanog-lentivirus i 50 μl hLin28-lentivirus do każdej studzienki. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne pokrycie podłoża. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
4. Tego samego dnia wyjmij 1 fiolkę komórek CF-1 MEF z ciekłego azotu i rozmroź. Usunąć ciecz z dołków pokrytych żelatyną (patrz krok 1.2) i dodać komórki zasilające MEF o gęstości 0,2 x 10⁵ komórek / studzienkę. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 2 ml komórek w pożywce wzrostowej MEF (450 ml DMEM uzupełnione 50 ml FBS i 5 ml aminokwasów endogennych).
5. Następnego dnia odłącz komórki BJ z 0,05% trypsyną/EDTA i odwiruj przy 200 x g przez 5 minut. Zassać pożywkę i ponownie zawiesić w podłożu wzrostowym. Usunąć pożywkę z płytki podającej MEF (patrz krok 1.4) i dodać 2 ml/dołek zawiesiny komórek BJ. Koncentracja komórek powinna wynosić około 5 x 10⁴ komórki / studzienkę. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
6. Zastąp pożywkę 24 godziny po ponownym wysiewie ludzkim podłożem do hodowli komórek ES/iPS (400 ml DMEM/F12 uzupełnione 100 ml zamiennika surowicy nokautującej, 5 ml 10 mM aminokwasów endogennych, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 0,9 ml 55 mM β-merkaptoenolu i 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego bFGF). Zmieniaj podłoże co 24 godziny przez 7 dni.
7. Po siedmiu dniach zmienić pożywkę na pożywkę kondycjonowaną MEF (patrz punkt 2).

2. Przygotowanie pożywki kondycjonowanej MEF

1. Wysiewaj komórki zasilające CF-1 MEF w 2 x 10 5 komórek/studzienka na 6-dołkowej płytce w 2 ml pożywki wzrostowej MEF. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
2. Zmienić pożywkę na pożywkę do hodowli komórek ludzkich ES/iPS. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
3. Zbierać supernatant co 24 godziny przez cztery dni. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm.
4. Uzupełnić supernatant 50 ng/ml bFGF.

3. Wybór i przechodzenie kolonii iPS

1. Wybierz kolonię podobną do ES i ponownie zasiaj ją w ludzkiej pożywce hodowlanej ES/iPS uzupełnionej 10 μM Stemolecule Y27632 na szalkach do hodowli komórkowych wstępnie obsianych komórkami zasilającymi CF-1 MEF. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
2. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny przez pierwsze siedem dni (bez suplementacji Stemolecule Y27632). Po siedmiu dniach zmienić pożywkę na pożywkę kondycjonowaną MEF (przygotowanie patrz punkt 2). Kontynuowaliśmy pasażowanie komórek, aż wykazały typową ludzką morfologię ES.

4. Immunocytochemiczne badanie markerów pluripotencji

1. Delikatnie umyj komórki trzy razy za pomocą PBS.
2. Utrwalić komórki za pomocą 500 μl utrwalacza przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Delikatnie umyj komórki trzy razy za pomocą PBS.
4. Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą 500 μl buforu blokującego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować komórki z 250 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyliśmy TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 w rozcieńczeniach 1:100).
6. Delikatnie umyj komórki trzy razy za pomocą PBS.
7. Inkubować komórki z 250 μl przeciwciała drugorzędowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, trzymając z dala od światła (użyliśmy koniugatu koziego anty-mysiego IgM Cy3, koziego koniugatu anty-mysiego IgG Cy3, koziego koniugatu anty-szczurzego IgM Cy3 i koniugatu koziego anty-królika Cy3 w rozcieńczeniach 1:300).
8. Delikatnie umyj komórki trzy razy za pomocą PBS.
9. Dodaj DAPI (stężenie końcowe 1 μg/ml) do ostatniego płukania i inkubuj 5 minut, aby uwidocznić jądra.
10. Przeanalizuj komórki w powiększeniu.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

1. Wyniki morfologii:

Ludzkie komórki fibroblastów napletka (BJ) były kotransdukowane z Oct4, Sox2, Nanog i Lin28. Zmiany morfologiczne zaobserwowano już w 4 dniu po transdukcji, a skupisko komórek stało się ciaśniej upakowane w 17 dniu (ryc. 1). Kolonie zostały ręcznie wybrane w 25 dniu i wyhodowane na komórkach zasilających CF-1 MEF. Aby ułatwić tworzenie kolonii komórek iPS po przeprogramowaniu, użyliśmy Stemolecule Y27632, inhibitora ROCK, do początkowego wysiewu przez noc podczas każdego pasażu. Kolonie komórek iPS o dobrej morfologii obserwowano po trzech sekwencyjnych rundach pobierania i pasmowania kolonii.

2. Ekspresja markerów pluripotencji:

Aby dokładniej scharakteryzować izolowane kolonie komórek iPS, szukaliśmy obecności wspólnych markerów pluripotencji wyrażanych w komórkach ES. Kolonie wykazywały silną aktywność fosfatazy alkalicznej (AP) (ryc. 2). Dodatkowo przeprowadzono immunocytochemię (ICC) na koloniach komórek iPS z panelem przeciwciał specyficznych dla markerów pluripotencji, w tym markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3, a także markerów jądrowych Oct4, Sox2 i Nanog. Izolowane kolonie iPS były dodatnie dla wszystkich markerów (ryc. 3). Wyniki ICC pokazują, że komórki iPS wykazywały odpowiedni wzorzec ekspresji markera pluripotencji, co pokazuje, że te komórki iPS bardzo przypominają niezróżnicowane ludzkie komórki ES.

Rysunek 1: Zmiany morfologiczne transdukowanych komórek BJ. Obrazy w jasnym polu typowej kolonii komórek iPS utworzonej w (A) 4 dniu i (B) 17 dniu po transdukcji.

Rysunek 2: Aktywność AP przeprogramowanych komórek BJ. Trzy różne kolonie barwione zestawem do barwienia fosfatazy alkalicznej Stemgent.

Rysunek 3: Ludzkie komórki iPS wyrażają wysoki poziom następujących markerów specyficznych dla komórek ES: markery powierzchniowe TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3 oraz markery jądrowe 4 października, Nanog i Sox2.

Discussion

Wyniki te pokazują, że zestaw Stemgent Human TF Lentivirus Set może być używany do wydajnego generowania kolonii iPS poprzez indukowanie ektopowej ekspresji transdukowanych czynników transkrypcyjnych w ludzkich fibroblastach. Projektując eksperymenty przeprogramowywania, należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych, aby zoptymalizować wydajność przeprogramowania. Po pierwsze, może być konieczna modyfikacja stosunku aktywnego wirusa do celu (mnogość infekcji M.O.I.) podczas pierwotnego etapu transdukcji w celu osiągnięcia optymalnej wydajności transdukcji. Po drugie, warunki wzrostu komórek docelowych mogą wpływać na przeprogramowanie. Zdrowe i proliferacyjne komórki są bardziej podatne na przeprogramowanie. Po trzecie, podczas modyfikowania protokołu dla różnych numerów komórek, zaleca się, aby docelowe liczby komórek były dostosowywane proporcjonalnie do powierzchni szalki hodowlanej. Wreszcie, należy rozważyć zastosowanie inhibitorów ROCK, takich jak Y27632, aby zapewnić skuteczne przeprogramowanie, ponieważ ostatnie badania wykazały jego przydatność w zwiększaniu przeżywalności kolonii hES. ^4,5

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw ludzkiego lentiwirusa TF	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
Przeciwciało TRA-1-81	Stemgent	09-0012
Przeciwciało TRA-1-60	Stemgent	09-0009
Przeciwciało SSEA-4	Stemgent	09-0003
Przeciwciało SSEA-3	Stemgent	Numer katalogowy: 09-0014