Mrożenie i rozmrażanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Od czasu opracowania przez Jamesa Thomsona i współpracowników w 1998 roku techniki izolacji i hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) in vitro, zamrażanie komórek do późniejszego wykorzystania oraz rozmrażanie i namnażanie komórek z zapasów mrożonych stały się istotnymi procedurami wykonywanymi w rutynowej hodowli komórek hES. Ponieważ komórki hES są bardzo wrażliwe na stresy towarzyszące zamrażaniu i rozmrażaniu, należy zachować szczególną ostrożność. W niniejszym materiale prezentujemy właściwą technikę szybkiego rozmrażania komórek hES z zapasów przechowywanych w ciekłym azocie, ich wysiewania na mysie embrionalne komórki karmidła oraz powolnego zamrażania w celu długoterminowego przechowywania.

Streszczenie

Od czasu Jamesa Thomsonai wsp.opracowano technikę w 1998 roku w celu izolacji i hodowli hES in vitro; mrożenie komórek do późniejszego wykorzystania oraz rozmrażanie i namnażanie komórek z zamrożonego banku stały się istotnymi procedurami wykonywanymi w rutynowej hodowli komórek hES. Ponieważ komórki hES są bardzo wrażliwe na stresy związane z mrożeniem i rozmrażaniem, należy zachować szczególną ostrożność. W niniejszym materiale prezentujemy właściwą technikę szybkiego rozmrażania komórek hES z zapasów w ciekłym azocie, ich wysiewania na komórki karmicielskie z zarodka myszy oraz powolnego mrożenia w celu długoterminowego przechowywania.

Protokół

1. Rozmrażanie komórek hES

Przygotowanie przed eksperymentem

1. Na jeden dzień przed rozmrożeniem komórek hES, wysiej warstwę wspierającą z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich (MEF), szczep CF1, do jednej studni żelatynowanej 6-dołkowej płytki hodowlanej w pożywce do hodowli MEF (podstawowa pożywka D-MEM uzupełniona o 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1% niezasadniczych aminokwasów). Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
2. Przed wyjęciem komórek hES z ciekłego azotu upewnij się, że cały niezbędny sprzęt i odczynniki są przygotowane i gotowe do użycia, aby zapewnić sprawne i pomyślne rozmrożenie.

Rozmrażanie komórek hES

3. Za pomocą metalnej pincety wyjmij probówkę kriogeniczną z komórkami hES z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie.
4. Tocz probówkę między dłońmi w rękawiczkach przez 3-5 sekund, aby usunąć szron.
5. Zapisz informacje znajdujące się na etykiecie probówki.
6. Używając metalnej pincety, zanurz probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Delikatnie obracaj probówkę i często (ale szybko!) sprawdzaj postęp rozmrażania, podnosząc ją pod światło, aby ocenić wielkość kryształków lodu. Nie zanurzaj zakrętki probówki w kąpieli wodnej, aby uniknąć kontaminacji komórek.
7. Gdy pozostanie już tylko mały kryształek lodu, zanurz całą probówkę w etanolu w celu sterylizacji.
8. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś zawartość probówki kriogenicznej bezpośrednio na dno stożkowej probówki o pojemności 15 mL.
9. Do probówki powoli dodaj 4 mL pożywki do hodowli komórek hES (podstawowa pożywka D-MEM/F-12 uzupełniona o 20% Knockout serum replacement, 1% nieessentialnych aminokwasów, 1% L-glutaminy, 0,2% β-merkaptoetanolu oraz 4 ng/mL bFGF). Delikatnie kołysz probówką, aby stale mieszać komórki podczas dodawania nowej pożywki.
10. Wiruj komórki przez 5 minut przy 200 x g.

Wysiewanie komórek hES

11. Podczas wirowania komórek hES, przygotuj płytkę z komórkami karmionymi MEF, opisując ją odpowiednimi informacjami o komórkach hES: linią komórkową, numerem pasażu oraz datą rozmrożenia.
12. Gdy do końca wirowania pozostaną około 2 minuty, odessaj pożywkę hodowlaną MEF i dodaj do dołka 1,0 mL PBS.
13. Przenieś osad komórek hES z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie odessaj nadsącz. Należy uważać, aby nie odessać osadu komórkowego, ale usunąć jak najwięcej nadsączu, ponieważ roztwór ten zawiera DMSO z medium do mrożenia.
14. Bardzo delikatnie resuspenduj osad, dodając 2,5 mL pożywki do hodowli komórek hES za pomocą szklanej pipety 5 mL i pipetując 3-4 razy.
15. Odessaj PBS z dołka z komórkami karmionymi MEF i powoli dodaj całe 2,5 mL zawiesiny komórek hES do przygotowanego dołka na płytce 6-dołkowej.
16. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C i ostrożnie przesuwaj płytkę przód-tył oraz na boki, aby równomiernie rozmieścić komórki w całym dołku. Nie wykonuj ruchów okrężnych płytką, aby uniknąć koncentracji kolonii w centrum.
17. Pozostaw komórki do przytwierdzenia w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez noc.
18. Dzień po rozmrożeniu usuń pożywkę (wraz z wszelkimi pływającymi komórkami) i dodaj do dołka 2,5 ml świeżej pożywki do hodowli komórek hES.
19. Opcjonalnie: Usuniętą pożywkę wraz z komórkami można przenieść na osobną, przygotowaną płytkę z komórkami karmionymi MEF. Ten krok często prowadzi do powstania nowych kolonii, które można hodować równolegle z komórkami z pierwotnego rozmrożenia.
20. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez noc.

2. Zamrażanie komórek hES

1. Podczas wirowania komórek hES, opisz fiolki kriogeniczne wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, podając linię komórkową, numer pasażu oraz datę zamrażania. Typowa gęstość przy zamrażaniu komórek hES to zawartość jednego dołka (z płytki 6-dołkowej) na jedną fiolkę kriogeniczną.
2. Po zakończeniu wirowania komórek hES, przenieś probówki z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Odessań nadsącz z probówki, uważając, aby nie naruszyć luźnego osadu komórkowego.
3. Resuspenduj osad komórkowy odpowiednią ilością pożywki do hodowli komórek hES: 0,5 mL pożywki do hodowli komórek hES na jedną fiolkę kriogeniczną. Podczas pipetowania zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ komórki hES lepiej regenerują się po rozmrożeniu, jeśli zostaną zamrożone w stosunkowo dużych fragmentach kolonii.
4. Powoli, delikatnie potrząsając probówką, dodaj do komórek odpowiednią ilość (0,5 mL na fiolkę kriogeniczną) 2X pożywki do zamrażania komórek hES (60% zdefiniowanego FBS, 20% pożywki do hodowli komórek hES i 20% DMSO). Po dodaniu pożywki do zamrażania, bardzo delikatnie pipetuj roztwór jeden lub dwa razy w celu wymieszania.
5. Szybko, lecz ostrożnie, przelej 1 mL zawiesiny komórkowej do każdej fiolki kriogenicznej.
6. Przenieś fiolki do pojemnika do zamrażania z izopropanolem i umieść w zamrażarce w temperaturze -80°C na noc. W pojemniku do zamrażania z izopropanolem komórki będą zamrażać się w tempie 1°C na minutę.
7. Następnego dnia szybko przenieś zamrożone fiolki za pomocą pęsety metalowej do zbiornika z ciekłym azotem.

Reprezentatywne wyniki

W pierwszym dniu po rozmrożeniu ludzkich komórek ES małe kolonie mogą być przezroczyste i trudne do zauważenia pod mikroskopem. Ponieważ świeżo rozmrożone komórki ES mają tendencję do powolnej proliferacji, może minąć kilka dni, zanim pojawią się jako uformowane kolonie (Rycina 1).

Rysunek 1. Odzyskiwanie i wzrost komórek. Komórki hES rozmrożone z ciekłego azotu obrazowano  1, 7 i 11 dni po rozmrożeniu.

Dyskusja

Towarzyszący film prezentuje metodę rozmrażania i zamrażania komórek hES. Komórki zamrożone w ciekłym azocie należy rozmrozić tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać jak najlepszą przeżywalność. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania rozmrażanych komórek: należy ograniczyć manipulacje komórkami i pipetować je delikatnie. Jedną fiolkę komórek hES można wysiać albo do jednego dołka płytki 6-dołkowej, albo do wszystkich dołków płytki 4-dołkowej, a następnie niezwłocznie umieścić w inkubatorze. Ponieważ hodowla w czterech oddzielnych dołkach zmniejsza ryzyko utraty całej kultury w wyniku kontaminacji oraz ułatwia lokalizację kolonii komórek hES na mniejszej powierzchni, przy pierwszym rozmrażaniu komórek hES zaleca się stosowanie płytki 4-dołkowej.

W pierwszym dniu po rozmrożeniu komórek hES kolonie są małe i mogą być przezroczyste. Należy codziennie uzupełniać pożywkę do hodowli komórek hES, nawet jeśli kolonie nie są widoczne pod mikroskopem, ponieważ pojawienie się uformowanych kolonii komórek hES w hodowli może zająć kilka dni. Podczas rozmrażania komórek ważne jest zastosowanie świeżo wysianej warstwy feederowej MEF, ponieważ kolonie często nie osiągają odpowiedniej wielkości do pasażowania aż do 10 12 dni po rozmrożeniu.

Podczas rozmrażania ampułki z komórkami hES o niskim numerze pasażu, dobrą praktyką jest namnożenie i zamrożenie dodatkowych ampułek, aby zachować zapas komórek o niskim pasażu do przyszłych hodowli i eksperymentów. Warto również rutynowo zamrażać wszystkie „nadmiarowe” zdrowe komórki hES w celu utrzymania zapasów mrożonych. Najbardziej udane rozmrażania i późniejsze hodowle dotyczyły zamrożonych, wysokiej jakości, niezróżnicowanych i aktywnie dzielących się kolonii komórek hES. Komórki hES regenerują się po zamrożeniu bardziej efektywnie, jeśli są traktowane delikatnie w postaci większych agregatów komórkowych. Końcowa wielkość agregatu powinna być zbliżona do (lub nieco większa od) wielkości agregatów wysiewanych po rutynowym pasażu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-MEM	Invitrogen	11965-092	Do pożywki MEFjavascript:void(0);
Surowica cielęca (FBS), certyfikowana	Invitrogen	16000-044	Inaktywowana ciepłem Do pożywki MEF
D-MEM/F-12	Invitrogen	11330-057
Zamiennik surowicy Knockout	Invitrogen	10828-028	Wstępna weryfikacja w celu zapewnienia wsparcia dla komórek hES
bFGF	Stemgent	03-0002	Stężenie końcowe [4 ng/mL]
Niezasadnicze aminokwasy	Invitrogen	11140-050
L-glutamina	Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Stężenie końcowe [1X]
PBS	Invitrogen	14190-250	Bez Ca2+ lub Mg2+
Kolagenaza IV	Invitrogen	17104-019	Przygotować świeży roztwór o stężeniu 1 mg/mL w D-MEM/F-12
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G1890	Typ A, wieprzowa
DMSO	Sigma-Aldrich	D2560	Do pożywki do zamrażania
Surowica cielęca (FBS), definiowana	Hyclone	SH300.70.01	Do pożywki do zamrażania
Płytki 6-dołkowe	Nalge Nunc international	140675	Do ogólnej hodowli
Płytki 4-dołkowe	Nalge Nunc international	176740	Do rozmrażania
Szklane pipety 5 mL	Fisher Scientific	13-678-27E	Pakowane indywidualnie
Probówki stożkowe 15 mL	Corning	430052	Polipropylenowe
Fiolki kriogeniczne	Nalge Nunc international	5000-1020	Pojemność 1,5 mL
Kontener do zamrażania	Nalge Nunc international	5100-0001	Mr. Frosty”