Test pierścienia aortalnego

Podsumowanie

Angiogeneza, czyli wypączkowanie naczyń krwionośnych z istniejącej sieci naczyniowej, wiąże się zarówno z procesami naturalnymi, jak i patologicznymi. W niniejszej pracy prezentujemy test pierścienia aorty, który umożliwia bezpośrednie dodawanie potencjalnych stymulatorów i inhibitorów angiogenezy do pierścieni aorty w hodowli. Wypączkowanie oraz wzrost nowych naczyń można ocenić poprzez inspekcję pierścieni aorty w okresie od 6 do 12 dni.

Streszczenie

Angiogeneza, czyli wyrastanie naczyń krwionośnych z już istniejącego układu naczyniowego, towarzyszy zarówno procesom naturalnym, jak i patologicznym. Różne testy angiogenezy obejmują badanie pojedynczych komórek śródbłonka w warunkach hodowli (1). Test pierścienia aorty jest modelem angiogenezy opartym na hodowli organów. W tym teście naczynia angiogenne wyrastają z segmentu aorty (zmodyfikowano z (2)). W skrócie, wycina się aortę piersiową myszy, usuwa warstwę tłuszczową oraz osłonkę zewnętrzną i przygotowuje pierścienie o długości około 1 mm. Poszczególne pierścienie są następnie zatapiane w małej, stałej kopule ekstraktu macierzy podstawowej (BME), odlewanej w poszczególnych studzienkach płytki 48-dołkowej. Do pierścieni można bezpośrednio dodawać czynniki angiogenne oraz inhibitory angiogenezy, a w celu badania parakrynnych efektów angiogennych można zastosować mieszaną kokulturę pierścieni aorty i innych typów komórek. Wyrastanie naczyń obserwuje się pod stereomikroskopem w okresie od 6 do 12 dni. Ze względu na dużą zmienność wynikającą z niejednorodności segmentów aorty, zdecydowanie zaleca się prowadzenie doświadczeń w sześciu powtórzeniach. Wzrost nowych naczyń jest monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu i obrazowany za pomocą mikroskopii fazowej, a nadnadkreszty są zbierane w celu pomiaru odpowiednich czynników angiogennych i antyangiogennych, markerów śmierci komórkowej oraz azotynów.

Protokół

Jeden dzień przed eksperymentem:

1. Pozostawić BME (zredukowany czynnik wzrostu, Cultrex, Trevigen) do rozmrożenia na lodzie lub w temperaturze 4°C; po rozmrożeniu przechowywać na lodzie, aby zapobiec ponownemu zestaleniu.

Dzień eksperymentu:

1. Myszy (w wieku 6-7 tygodni) należy znieczulić i upuścić im krew.
2. Wyciąć aortę piersiową do szalki Petriego wypełnionej zimnym, sterylnym PBS.
3. Przeprowadzić mechaniczne oczyszczanie z otaczającej tkanki tłuszczowej. Uwaga: należy unikać wysychania aorty na każdym etapie.
4. Za pomocą skalpela równomiernie pociąć aortę na pierścienie o grubości 1 mm. Cięcie musi być jednorodne i precyzyjne.
5. Przenieść pierścienie do świeżego, zimnego PBS i przez cały czas przechowywać na lodzie.
6. Używając schłodzonych końcówek do pipety, dodać do każdej studzienki płytki 48-dołkowej wypukłą kroplę 150 ml zimnego BME. Pozostawić kroplę BME do zastygnięcia w temperaturze 37°C przez 20-30 minut.
7. Umieścić pojedynczy pierścień aorty na górnym środku każdej kopuły. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37°C.
8. Na każdy pierścień dodać dodatkowe 150 ml BME. Inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 37°C.
9. Przygotować pożywkę: bezsurowicza pożywka dla ludzkich komórek śródbłonkowe (GIBCO, Carlsbad, CA) uzupełniona o 2% FCS, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (Cellgro).
10. Do każdej studzienki dodać 500 ml pożywki zawierającej odpowiednio:
    1. Próbki eksperymentalne.
    2. Kontrolę pozytywną: suplement wzrostu komórek śródbłonkowych (ECGS, stężenie końcowe 200 μg/ml, BD Biosciences).
    3. Kontrolę negatywną: samą pożywkę.
11. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 12 dni; fotografować pierścienie między 6. a 12. dniem pod standardowym stereoskopem z kontrastem fazowym.
12. Opcjonalnie: zebrać nadytęki.

Uwagi:

1. Przez cały czas należy zachować warunki sterylności.
2. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do BME.

Dyskusja

Test pierścienia aortalnego jest przydatnym narzędziem do oceny czynników angiogennych oraz antyangiogennych. Naczynia wyrastające z pierścieni aortalnych rekrutują komórki mięśni gładkich i perycyty do połączenia się z rurką komórek śródbłonkowych, co oznacza, że są one anatomicznie podobne do neonaczyni w warunkach in vivo. Co więcej, test pierścienia aortalnego myszy daje przewagę w postaci szerokiej gamy dostępnych narzędzi transgenicznych dla tego gatunku. Jednak test pierścienia aortalnego ma kilka wad. Po...