Montaż, strojenie i wykorzystanie bezaperturowego mikroskopu w bliskim polu podczerwieni do obrazowania białek

Podsumowanie

Opisano montaż bliskiego pola mikroskopu na podczerwień do obrazowania agregatów białkowych.

Streszczenie

Celem niniejszej pracy jest przeprowadzenie czytelnika przez proces montażu i obsługi podczerwonego mikroskopu bliskiego pola do obrazowania poza limitem dyfrakcyjnym. Bezaperturowy mikroskop bliskiego pola jest instrumentem typu rozproszeniowego, który dostarcza widm podczerwieni z rozdzielczością około 20 nm. Przedstawiono pełną listę komponentów oraz szczegółowy protokół użytkowania. Omówiono typowe błędy popełniane podczas montażu i strojenia instrumentu. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący strukturę drugorzędową włókna amyloidowego.

Protokół

Wstęp:

Bezaperturowa blisko-polowa mikroskopia IR oferuje obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Jest to stosunkowo nowa technika, w której padająca wiązka podczerwieni jest rozpraszana przez ostrą igłę mikroskopu sił atomowych (AFM), oscylującą z częstotliwością rezonansową wspornika w bliskiej odległości od próbki. Detektor IR zbiera rozproszone światło, które jest demodulowane z tą częstotliwością rezonansową lub jej harmonicznymi. W ten sposób można zredukować rozproszenie tła skupionej wiązki lasera padającej na pozostałą część powierzchni próbki i osiągnąć rozdzielczość przestrzenną znacznie przekraczającą limit dyfrakcyjny światła, co pozwala na uzyskanie kontrastu podczerwieni z nanometrową rozdzielczością przestrzenną^i,ii,iii. Ponieważ wierzchołek igły AFM jest znacznie mniejszy niż obszar ogniskowy wiązki lasera, rozproszone światło jest słabe. W celu wzmocnienia tego pola rozproszonego stosuje się detekcję homodynową, w której do zebranego pola rozproszonego dodaje się pole odniesienia, a względna faza pól jest ustawiona tak, aby w detektorze wystąpiła maksymalna interferencja konstruktywna. Intensywność rozproszenia jest wówczas proporcjonalna do wartości pola elektrycznego odniesienia ^{iv, v, vi}. Istotną kwestią w obrazowaniu blisko-polowym jest unikanie artefaktów wywołanych ruchem igły AFM w osi z^{vii, viii, ix, x, xi}. Problem ten można zminimalizować poprzez odpowiednie dostrojenie fazy homodynowej oraz wykluczenie dużych elementów topograficznych, co zostało wcześniej wykazane przez Mueller et al. Technika ta jest następnie niezawodnie wykorzystywana do uzyskiwania eksperymentalnych widm rozproszenia materiałów z rozdzielczością przestrzenną mniejszą niż 30 nm₁₅. Zastosowanie mikroskopii blisko-polowej dla materiałów biologicznych zostało wcześniej zaprezentowane, w szczególności dla makromolekuł, takich jak wirus mozaiki tytoniu^xii oraz bakterie E. Coli^xiii.

W niniejszym raporcie przedstawiamy sposób montażu takiego urządzenia obrazującego. Prezentujemy również informacje o strukturze drugorzędowej włókien amyloidowych utworzonych z fragmentu peptydowego #21-31 β₂-m, uzyskane za pomocą bezaperturowej bliskopolowej skaningowej mikroskopii podczerwieni (ANSIM). Obrazy bliskiego pola są gromadzone równocześnie z topografią, co umożliwia detekcję i pozyskanie widma rozproszenia poszczególnych włókien.

Nasze pomiary wykonane przy użyciu bezaperturowego bliskiego pola skaningowego mikroskopu podczerwieni (ANSIM) przeprowadzono za pomocą urządzenia wykonanego własnym sumptem. Schemat układu eksperymentalnego przedstawiono na Scheme 1. Mikroskop AFM (Multimode, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA) służy do pomiaru topografii próbki, a także do generowania wzmocnionego rozpraszania w bliskim polu, modulowanego częstotliwością oscylacji sondy. Do wzmocnienia rozpraszania ciągłego, strojalnego lasera IR (zakres częstotliwości: 2000 cm^-1 do 1600 cm^-1, laser gazowy PL3 CO, Edinburgh Instruments, Great Britain) w pobliżu powierzchni wykorzystano wsporniki NSC14/Ti-Pt powlekane platyną (MicroMasch, Estonia) w trybie stukowym (tapping-mode). Pole lasera helowo-neonowego (Melles Griot, Albuquerque, NM) służy jako prowadnica dla niewidzialnego promieniowania podczerwonego. Światło lasera IR po przejściu przez częściowy refleks ZnSe jest kierowane w stronę soczewki. Następnie jest ono ogniskowane na wierzchołku oscylującej sondy AFM, przy czym polaryzacja wiązki jest równoległa do długiej osi sondy. Promieniowanie IR zebrane przez soczewkę jest następnie dodawane do referencyjnego sygnału homodynowego. Lustro paraboloidalne służy do ogniskowania promieniowania IR na detektorze podczerwieni z tellurku kadmu i rtęci (MCT) (Graseby Infrared, Orlando, FL). Sterownik piezoelektryczny (Thorlabs, Newton, NJ) jest wykorzystywany do maksymalizacji wykrytego sygnału poprzez korekcję fazy światła homodynowego. Większość opisanych powyżej komponentów optycznych jest sztywno zamocowana na platformie i przesuwana w pozycjach X, Y lub Z za pomocą stolika translacyjnego. Składowa AC wykrytego sygnału jest przesyłana do wzmacniacza lock-in (model SR844 RF, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA), który demoduluje sygnał z częstotliwością oscylacji sondy. Natężenie rozpraszania jest obserwowane podczas skanowania powierzchni próbki przez sondę AFM, a dane topograficzne są pozyskiwane równocześnie. Oprogramowaniem wykorzystanym do zbierania danych i obrazów jest Nanoscope V5.31r1 (Veeco Instruments, Santa Barbara, CA).

Schemat 1

Rycina 1 - przedstawia elementy systemu obrazowania, których montaż i użytkowanie zostaną opisane

0) Stół optyczny
1) Podstawa MM AFM
2) Skaner MM AFM
3) Podwyższona płyta optyczna
(13" x 18" x 3/8", Thorlabs)
4) Lustra kierujące (powlekane złotem, śr. 1")
5) Tubus optyczny z przysłoną i blokiem centralnym
6) Kostka optyczna z częściowym reflektorem ZnSe
7) Tubus optyczny użyty do zabezpieczenia układu na platformie podnoszącej (17)
8) Obiektyw IR
(FL 16 mm, NA 0.28, Ealing)
9) Tubus optyczny dla zebranego światła rozproszonego wstecznie
10) Kostka z pozaosiowym lustrem parabolicznym
(90°, FL 5", Janos)
11) Kostka do utrzymania płytki Ge pod kątem 45°
12) Okular mikroskopowy (x10)
13) Otwór ograniczający (0.5 mm) zamontowany na stoliku XY
14) Detektor IR MCT (Graseby Infrared)
15) Przedwzmacniacz detektora IR (AC i DC)
16) Stolik XY do zmiany pozycji wiązki
17) Stół podnoszący do ogniskowania wiązki
18) Stolik Z do pozycjonowania detektora IR
19) Stolik X do pozycjonowania detektora IR

I. Pierwszy montaż układu optycznego

Krok montażu I.1

Zmontuj układ optyczny z lustrami strojeniowymi i ustaw wiązkę helowo-neonową (HeNe) równolegle do stołu optycznego (0), na w przybliżeniu prawidłowej wysokości (H) nad płytą optyczną (3) i w odległości (D) od centrum skanera (2).

Wysokość H oraz odległość D można oszacować na podstawie wysokości (H1) próbki znajdującej się na skanerze (2) nad stołem optycznym, pożądanego kąta padania (α), wysokości górnej krawędzi płyty montażowej nad stołem optycznym (h), wymiarów geometrycznych kostki optycznej i obiektywu IR (6 i 8 na Rysunku 1) oraz odległości roboczej obiektywu IR (łącznie d, tutaj d=1"+2"+2")

Rysunek 2

H=H1+d*sin(α)-h

D=d*cos(α)

Krok montażu I.2

Rycina 3

Rysunek 3: Bez dzielnika wiązki w kostce (5) i z wydłużoną tubą optyczną na drugim końcu kostki (6) skieruj wiązkę He-Ne bezpośrednio przez przysłony przymocowane do końców tub.

Krok montażu I.3

Rysunek 4

Rysunek 4: Po zdjęciu skanera (2), w miejsce obiektywu IR zamontuj długą tubę optyczną z przysłoną na końcu. Wsuń częściowy reflektor ZnSe, aby skierować wiązkę w stronę próbki poprzez przejście przez długą tubę optyczną. Częściowy reflektor ZnSe powinien być zamontowany w taki sposób, aby wiązka HeNe uderzała w przednią powierzchnię reflektora w geometrycznym centrum kostki optycznej trzymającej częściowy reflektor.

Rysunek 5

Rycina 5: Poprzez obrót półprzepuszczalnego zwierciadła skieruj wiązkę HeNe przez zamkniętą przysłonę wyjściową. Ponieważ uchwyt półprzepuszczalnego zwierciadła nie utrzymuje go dokładnie prostopadle, zamontowano dwie śruby regulacyjne, które umożliwiają pionowe przemieszczanie wiązki. W razie potrzeby należy z nich skorzystać.

Rycina 6

Krok montażu I.4

Rycina 6. Zamocuj lustro paraboloidalne za pomocą gumowych pierścieni O-ring w kostce optycznej (patrz 1, Rycina 5). Poprzez dokręcanie śrub pierścienie O-ring zostają ściśnięte, co umożliwia regulację lustra.

Rysunek 7

Za pomocą dodatkowych zwierciadeł (jedno z nich pokazano na rycinie 7) skieruj wiązkę HeNe w przeciwnym kierunku, zgodnie z ilustracją na rycinie 7. Wyreguluj wiązkę tak, aby przechodziła przez wcześniej używane przysłony. Wiązka ta będzie służyć do regulacji zwierciadła paraboloidalnego.

Rycina 8

Rysunek 8: Lustro paraboloidalne umieszczone w kostce optycznej (10) odbija światło w stronę detektora. Śruby regulacyjne kierują wiązkę przez otwór zwęźkowy (pinhole) umieszczony na wyjściu z kostki (11), w którym znajdzie się okno germanowe (Ge). Po dostrojeniu wiązki do otworu zwęźkowego, należy umieścić detektor MCT blisko otworu. Dostosuj pozycję detektora IR w taki sposób, aby wiązka He-Ne padała na element czuły detektora. Przesuń detektor w dół o ~2 mm (wiązka IR zostanie przesunięta w dół przez okno Ge).

Krok montażu I.5

Rysunek 9

Rysunek 9: Włóż uchwyt z okienkiem z Ge do kostki optycznej (11). Okienko z Ge z powłoką antyrefleksyjną (AR) służy jako filtr IR i umożliwia obserwacje wizualne wspornika oraz próbki. Przymocuj okular (12). Kąt obrotu kostki (11) względem kostki (10) pozwala na skierowanie okularu w pożądanym kierunku. Poprzez obracanie uchwytu okienka z Ge wiązka HeNe jest kierowana przez środek okularu.

Rycina 10

Rysunek 10: Połącz obiektyw IR (8) i skaner AFM (2). Zamocuj ogranicznik wiązki (beamstop) na wylocie tubusu optycznego (5). Podczas obserwacji wiązki HeNe przez okular należy używać filtra ochronnego. Umieść próbkę na skanerze i skieruj wiązkę HeNe przez wlotowy tubus optyczny (5). Upewnij się, że wiązka HeNe jest wystarczająco szeroka, aby wykraczać poza ogranicznik wiązki. Ogranicznik wiązki jest stosowany ze względu na obiektyw Cassegraina, który zbiera światło wpadające jedynie z peryferii wiązki. Poprzez regulację gwintu okularu uzyskuje się ostry obraz wiązki HeNe skupionej na próbce.

Krok montażu I.6

Wymagana jest końcowa regulacja lustra paraboloidalnego. Otwór wyjściowy (pinhole) zostaje zastąpiony przysłoną w pozycji ogniskowej lustra paraboloidalnego. Należy zdjąć okno z Ge oraz detektor IR (należy zaznaczyć pozycję detektora IR!). Za przysłoną należy zamocować dodatkową soczewkę w odległości odpowiadającej w przybliżeniu ogniskowej soczewki od przysłony. W tym momencie za pomocą soczewki powinien być widoczny zaangażowany zwega (cantilever). Należy wyregulować pozycję lustra paraboloidalnego tak, aby koniec sondy znalazł się w centrum zamkniętej przysłony. Należy zauważyć, że gdy wiązka HeNe jest prawidłowo skupiona na sondzie, powstaje jasny błysk między końcem sondy a jej odbiciem na powierzchni próbki. Należy ponownie zamocować okno z Ge i ustawić je tak, aby umożliwić wygodną obserwację wizualną zwegi. Przysłonę należy zastąpić otworem wyjściowym (pinhole), pamiętając, że otwór używany do detekcji IR powinien zostać przesunięty poza centrum ze względu na przemieszczenie wiązki IR przez okno z Ge. Detektor IR należy umieścić w wcześniej zaznaczonej pozycji.

Na koniec skieruj wiązkę IR tak, aby biegła ona równolegle z widzialną wiązką HeNe wykorzystywaną do strojenia.
Teraz wszystko powinno być gotowe do rutynowej regulacji.

Rutynowa regulacja:

Krok korekty A.1:

Ustawianie osi z laserem HeNe

Łatwiej jest przeprowadzić wyrównanie z widzialnym promieniem HeNe (632nm) niż z niewidzialnym promieniem IR (około 6μm).

Ścieżki wiązek HeNe i IR zbiegają się przy lustrze pochylnym. Jeśli lustro to jest pochylone w dół, wiązka HeNe może przejść; jeśli lustro znajduje się w pozycji roboczej, wiązka IR propaguje do układu pola bliskiego. W celu wyrównania tylko jednej z wiązek należy użyć dwóch luster, które nie są wspólne dla drugiej ścieżki i znajdują się przed lustrem pochylnym. W przypadku przypadkowego przesunięcia innego lustra należy najpierw spróbować przywrócić je do poprzedniej pozycji.

A.1.1. Wstępne wyrównanie przy użyciu dwóch luster

Użyj dwóch luster znajdujących się blisko lasera HeNe, aby wyrównać wiązkę tak, aby przechodziła przez wszystkie przysłony na drodze do stolika pola bliskiego. Obserwując wiązkę w ramieniu homodynowym, powinien być widoczny profil wiązki przypominający koronę (ze względu na blokadę wiązki w tubie optycznej). Wskazuje to, że wiązka przechodzi prosto przez tuby.

A1.2. Precyzyjne wyrównanie za pomocą stolika pola bliskiego

Zamocuj głowicę AFM i skieruj końcówkę wspornika na próbkę. Skup wiązkę HeNe na końcu wspornika obrazującego. Jeśli spowoduje to przesunięcie wiązki ze środka wejściowej tuby optycznej (5), powtórz kroki strojenia A.1. i A.1.2., aż wiązka zostanie wycentrowana.

Poprzez przesuwanie translacyjnego stolika optycznego, refleksyjny obiektyw mikroskopu jest regulowany tak, aby skupić światło na wierzchołku końcówki wspornika, gdzie ulega ono rozproszeniu.

Obróć lustro Ge znajdujące się pod okularem (umieszczone w kostce optycznej) i spójrz przez okular. Wiązka jest w tym punkcie skupiana (lub na detektorze IR po wysunięciu lustra Ge z kostki) przez lustro paraboloidalne. Przesuwaj stolik do tyłu lub do przodu, aż zostanie zaobserwowany ostry obraz wierzchołka oraz jego odbicia na powierzchni próbki. Wykorzystaj dwa pozostałe kierunki (góra/dół oraz prawo/lewo), aby umieścić wierzchołek AFM mniej więcej na środku pola widzenia okularu.

Patrząc przez teleskop, obserwuje się wspornik AFM i jego wierzchołek. Ponownie przypominamy o konieczności używania filtra ochronnego podczas obserwacji wiązki HeNe. Nawet bez wiązki HeNe obserwuje się pewne czerwone światło, które pochodzi z wewnętrznego oświetlenia kontroli odległości AFM. Przesuwaj stół translacyjny w kierunku prawo-lewo i/lub góra-dół, aż na wierzchołku sondy pojawi się jasnoczerwony błysk. Jeśli centrowanie jest bardzo niedokładne, przesuń stół na lewo od AFM, a następnie powoli przesuwaj go w prawo. Obserwuj czerwone odbicie przesuwające się po refleksyjnej powierzchni próbki. Jeśli czerwone odbicie nadal nie jest widoczne, przesuń stół ponownie w lewo i poruszaj nim w górę i w dół. Kontynuuj przesuwanie w kierunkach lewo-prawo oraz góra-dół, aż zaobserwujesz czerwony błysk podczas skupiania wiązki HeNe na wierzchołku sondy AFM.

A1.3. Nakładanie pola homodynowego na światło rozproszone

Otwórz ramię homodynowe i spójrz przez okular. Widoczne będą trzy lub więcej punktów w linii o malejącej intensywności; punkty te są wynikiem wielokrotnych odbić od przedniej i tylnej powierzchni różnych elementów optycznych. Przesuń lustro w ramieniu homodynowym tak, aby drugi punkt (licząc od dołu i według intensywności) pokrył się z jasnym obrazem wierzchołka, co oznacza miejsce, w którym wierzchołek i jego odbicie zbiegają się ze sobą.

A1.4. Ustawienie detektora

Zdejmij lustro Ge, a wiązka HeNe powinna skierować się w stronę, w której znajduje się detektor IR. Za tubą optyczną obserwuje się dwie plamki w kształcie pierścienia. Druga plamka (pod względem intensywności) to ta, która powinna przejść przez otwór w folii termochronnej na powierzchni detektora IR. Plamka o najwyższej intensywności powinna być widoczna na krawędzi otworu.

A1.5. Zmiana jednej próbki na inną

Po zmianie próbki końcówka AFM nie znajduje się już w dokładnie tej samej pozycji co wcześniej, jednak nie powinna być zbyt daleko od niej. Należy rozpocząć od kroku A.1.2, ponieważ różnica ta zazwyczaj nie jest bardzo duża.

Uwaga: Jeśli ustawienie jest nieprawidłowe, należy sprawdzić, czy wiązka HeNe nadal przechodzi przez wszystkie przysłony i tworzy jasny czerwony punkt na wierzchołku AFM. Czasami można nie zauważyć, że lustro zostało dotknięte, a tym samym przesunięte z pierwotnej pozycji. Jeśli ustawienie nadal jest błędne, niestety cała procedura ustawiania musi zostać powtórzona.

Krok regulacji 2: Wyrównanie wiązki IR

Należy użyć linii lasera CO o wysokiej intensywności / mocy (co najmniej 100 mW), co ułatwi przeprowadzenie ustawienia. Napełnij detektor ciekłym azotem i pozostaw go do ustabilizowania na co najmniej 30 minut.

2.1. Wstępne ustawienie za pomocą dwóch luster

Umieść miernik mocy za pierwszą przysłoną, aby monitorować moc wpadającej wiązki IR. Następnie wyreguluj lustro znajdujące się przed lustrem pochylnym, aby uzyskać najwyższy odczyt mocy. Przenieś miernik mocy i przytrzymaj go za przysłoną znajdującą się najbliżej etapu bliskiego pola, a następnie reguluj lustro pochylne, aż do uzyskania maksymalnego odczytu mocy. Powtórz ten krok kilka razy w celu optymalnego dostrojenia.

2.2. Monitorowanie sygnału 1f

Referencję wzmacniacza lock-in należy ustawić w celu wyizolowania częstotliwości oscylacji końcówki, wybierając 1F (ext.), co odpowiada częstotliwości oscylacji AFM. W oprogramowaniu Nanoscope w trybie force plot należy ustawić rozmiar skanowania na 3 μm. Po przeprowadzeniu regulacji wstępnej opisanej w punkcie 2.1., należy uzyskać odpowiedni kształt sygnału 1F. Następnie, regulując sterownik piezoelektryczny, należy dostroić fazę między światłem rozproszonym zbieranym z końcówki a światłem homodynowym z ramienia homodynowego. Steruje to lustrem w ramieniu homodynowym poprzez zmianę napięcia piezoelektryka tak, aby pierwsze minimum sygnału 1F znajdowało się w okolicy 500 nm, licząc od zera. Ponieważ każda zmiana w ustawieniach wpłynie na długość obu dróg światła, a tym samym na ich względne fazy, faza musi zostać skorygowana za pomocą piezoelektryka.

Co będzie widoczne (sygnał 1f)?
Błędne wyrównanie:	Dwa wybrzuszenia na 3 μm zaobserwowany zostanie rozmiar skanowania z.
Wyrównanie ośrodka:	Krzywizna pierwszego wybrzuszenia wydaje się nieco bardziej wklęsła niż wypukła, a drugie wybrzuszenie jest mniejsze od pierwszego.
(Niemal) prawidłowe dopasowanie:	Zaobserwowane zostaną dwa piki. Pierwszy pik jest wyższy od drugiego, a krzywizna po prawej stronie pierwszego piku będzie ujemna (wklęsła).

Co należy zrobić w celu wyrównania?
Nieprawidłowe dopasowanie:	Powtórz procedurę pozycjonowania opisaną w kroku 2.1 w razie potrzeby. Ze względu na dużą średnicę wiązki IR, większość wiązki przejdzie przez przysłony nawet wtedy, gdy nie będzie ona idealnie ustawiona. Nawet jeśli nadal obserwowane są dwa wybrzuszenia, można zwiększyć natężenie sygnału 1F poprzez dostrojenie jednego lub obu luster pozycjonujących. Zwracaj uwagę na niewielkie zmiany w krzywiźnie pierwszego wybrzuszenia. Przede wszystkim uzbrój się w cierpliwość, ponieważ jest to najtrudniejszy etap pozycjonowania.
Dopasowanie medium:	Należy spróbować wyregulować jedno lub oba lustra ustawiające, aby uzyskać niemal prawidłowe wyrównanie. Można również spróbować przesunąć pozycjoner translacyjny XYZ, jednakże należy robić to w bardzo małych przyrostach.
(Niemal) prawidłowe dopasowanie:	Wyreguluj lustra i spróbuj zwiększyć maksimum pierwszego wybrzuszenia. Sygnały 1F wynoszą zazwyczaj od 8 do 16 V, a przy niskich mocach wejściowych są mniejsze. Zmień fazę poprzez zmianę napięcia za pomocą sterownika piezoelektrycznego w taki sposób, aby pierwsze minimum znalazło się bliżej zera. Jeśli występuje znaczący sygnał 1F, przełącz referencję wzmacniacza lock-in, aby wyizolować sygnał 2F. Powinien być obserwowalny pewien poziom sygnału; spróbuj go nieco poprawić, bardzo delikatnie regulując lustra i zmieniając fazę.

2.3. Zmiana próbki na inną

Wykonaj krok A.1.5 przy wyrównaniu wiązki HeNe. Przyłóż końcówkę AFM i przeprowadź wiązkę IR przez mikroskop. Obserwuj sygnał 1F. Jeśli sygnał 1F jest nadal widoczny, wyreguluj lustro pochylne i dostrój fazę. Nadal może być obserwowany dobry sygnał 1F, a w konsekwencji dobry sygnał 2F. Jeśli tak nie jest, precyzyjnie wyrównaj wiązkę, stosując krok 2.2.

Reprezentatywne wyniki:

Przygotowanie próbek Peptyd #21-31 został zsyntezowany w Center for Biotechnology and Bioengineering na University of Pittsburgh i oczyszczony (>95%) metodą HPLC. W celu syntezy włókien amyloidowych do roztworu 1 mM peptyd #21-31 w wodzie 18 MΩ dodano 0,8 mg TMAO (Sigma-Aldrich), zgodnie z procedurą opisaną przez Yang et al.^xiv

Przygotowano ultra płaskie podłoża złote^xv. 40 μL mieszaniny z okresu jednego miesiąca (inkubacja w temperaturze pokojowej, pH 5.5) naniesiono na kilka minut na świeże ultra płaskie podłoża złote. Płukano je krótko strumieniem wody 18 MΩ, osuszono przepływającym gazem N₂ i umieszczono w urządzeniu ANSIM.

Rysunek 11 przedstawia obrazy topografii i pola bliskiego zarejestrowane dla fibryli peptydowych #21-31. A) Obraz topografii uzyskany jednocześnie z odpowiadającym mu obrazem pola bliskiego. Etykiety reprezentują poszczególne fibryle i służą do wskazania rodzaju konformacji wtórnej każdej z nich. B i C) Odpowiadające im obrazy pola bliskiego zarejestrowane przy dwóch różnych liczbach falowych: 1631 i 1691 cm^-1. Pole każdego obrazu wynosi 1 x 1 μm². Lewa skala reprezentuje wysokość, a prawa skala to pole rozproszone z wzmacniacza synchronicznego.

Rycina 11