Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Podsumowanie

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Streszczenie

Wraz z rozwojem inżynierii tkankowej rośnie ogromne zapotrzebowanie na opracowanie bardziej odpowiednich materiałów i technik przetwarzania, aby sprostać wymaganiom (np. mechanicznym i dotyczącym unaczynienia) bardziej złożonych organów i tkanek. Elektroprzędzenie jest popularną techniką tworzenia włóknistych rusztowań, które naśladują architekturę i skalę rozmiarów naturalnej macierzy pozakomórkowej. Takie włókniste rusztowania są również użyteczne jako podłoża do hodowli komórek, ponieważ włókna mogą być wykorzystane do kierowania zachowaniem komórek, w tym różnicowaniem komórek macierzystych (patrz obszerne przeglądy Maucket al.and Sillet al.(po więcej informacji). W niniejszym artykule opisujemy ogólny proces elektroprzędzenia polimerów, a jako przykład przedstawiamy elektroprzędzenie reaktywnego kwasu hialuronowego zdolnego do sieciowania pod wpływem ekspozycji na światło (patrz Ifkovitset al.(do przeglądu literatury na temat materiałów fotousieciowalnych). Przedstawiamy również dodatkowe możliwości przetwarzania, takie jak fotolitografia oraz formowanie rusztowań wielopolimerowych. Fotolitografię można wykorzystać do tworzenia rusztowań z kanałami i porowatością wieloskalową w celu zwiększenia infiltracji komórkowej i dystrybucji tkanki. Rusztowania wielopolimerowe są przydatne do lepszego dostrojenia właściwości (mechanicznych i degradacji) rusztowania, w tym precyzyjnego doboru porowatości dla infiltracji komórek. Co więcej, techniki te można rozszerzyć o szeroki wachlarz polimerów i reaktywnych makromerów, aby tworzyć złożone rusztowania dostarczające sygnałów niezbędnych do rozwoju skutecznych konstruktów inżynierii tkankowej.

Protokół

A. Elektroprzędzenie pojedynczego polimeru

1. Przed przygotowaniem roztworu do elektroprzędzenia, należy sporządzić 0,5% wag. roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959 (I2959) w wodzie dejonizowanej, rozpuszczając go w temperaturze 37°C przez kilka dni. Krok ten nie jest konieczny, jeśli nie jest używany polimer fotoreaktywny.
2. Połączyć zmetyloakrylowany kwas hialuronowy (MeHA, synteza opisana w Burdick et al.), poli(tlenek etylenu) (PEO, 900 kDa) oraz I2959 w wodzie dejonizowanej w celu przygotowania roztworu o końcowym stężeniu 2% wag. MeHA, 3% wag. PEO oraz 0,05% wag. I2959. Użyć wirówki typu vortex do mieszania roztworu, aż stanie się on klarowny. Rodzaj i stężenie polimeru, a także użyty rozpuszczalnik mogą zostać zmodyfikowane na tym etapie w zależności od pożądanych właściwości rusztowania.
3. Przenieść roztwór do strzykawki i przymocować do niej igłę tępą o rozmiarze 18 G i długości 6 cali.
4. Zaprogramować pompę strzykawkową na szybkość wypływu 1,2 mL/hr. Włożyć strzykawkę z igłą do urządzenia.
5. Przymocować uziemiony przewód wysokiego napięcia do aparatu zbierającego. W celu zebrania włókien rozłożonych losowo należy użyć płaskiej metalowej płyty, a w celu zebrania włókien uporządkowanych – trzpienia obracającego się z prędkością ~10 m/s. Przewód naładowany dodatnio przymocować do igły. Schemat aparatury do elektroprzędzenia przedstawiono na Rysunku 1.
6. Ustawić igłę lub urządzenie zbierające w taki sposób, aby odległość między nimi wynosiła 15 cm.
7. Uruchomić przepływ w pompie strzykawkowej. Gdy ciecz pojawi się na końcówce igły, włączyć źródło zasilania i ustawić napięcie na 22 kV.
8. Po zakończeniu procesu zbierania (od kilku minut w przypadku cienkich filmów, do 24 godzin dla grubszych mat), zdjąć rusztowanie z aparatury zbierającej i przechowywać je w próżni przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczalnika.
9. Ocenić morfologię włókien za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM); reprezentatywne rusztowania dla struktur uporządkowanych i nieuporządkowanych pokazano na Rysunku 1.

Uwaga: Szybkość przepływu próbki, odległość do urządzenia zbierającego oraz napięcie zależą od kombinacji polimeru i rozpuszczalnika i muszą zostać zoptymalizowane dla każdego układu, zazwyczaj poprzez obserwację morfologii rusztowania za pomocą SEM.

B. Fotousieciowanie i fotowzorowanie

1. Wytnij próbki o wymiarach 5mm X 5mm z matrycy rusztowania.
2. Przygotuj zestaw do sieciowania, umieszczając każde rusztowanie na szklanym slajdzie pokrytym folią, kładąc fotomaskę bezpośrednio na rusztowaniu, przykrywając całość czystym szklanym slajdem i spinając oba końce żabkami biurowymi. Uwaga: jednocześnie można przygotować cztery próbki; jeśli pożądany nie jest konkretny wzór, do sieciowania można użyć przezroczystej folii bez wzoru.
3. Przepłucz zestaw z rusztowaniami w komorze azotowej. Ważne jest, aby konstrukcja pozostała wolna od tlenu, który może hamować proces sieciowania.
4. Umieść zestaw z rusztowaniami w komorze azotowej pod światłem o długości fali 365 nm i natężeniu ~10 mW/cm², stosując adapter kolimujący, przez 5 minut. Patrz schemat na Rysunku 2.
5. Wyjmij każde rusztowanie i umieść je w płytce 12-dołkowej.
6. Do każdego dołka wlej 2 mL wody dejonizowanej, zabezpiecz płytkę folią Parafilm, aby zapobiec odparowywaniu wody, i inkubuj w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Wymień wodę trzy razy.
7. Zweryfikuj powstanie porów pod mikroskopem świetlnym (patrz przykład na Rysunku 2). Rusztowania są teraz gotowe do użycia.

Uwaga: Fotousieciowanie nie jest konieczne dla wielu rodzajów polimerów, jednak fotolitograficzne wzorowanie można stosować wyłącznie w przypadku polimerów fotoreaktywnych.

C. Podwójne elektroprzędzenie polimerów z wizualizacją włókien za pomocą fluorescencji

1. Przygotować 5% wagowy roztwór PEO (200 kDa) w 90% etanolu. Mieszać przy 700 obr./min w 50°C przez co najmniej 2 godziny przed elektroprząśnięciem.
2. Przenieś roztwór PEO do strzykawki i dodaj DAPI, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml w roztworze do elektroprządu. Owiń strzykawkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
3. Przygotować ten sam roztwór, który opisano w kroku A2, z tym że należy dodać również rhodaminę B z grupą metakryloyloxyethyl thiocarbamoyl (MeRho, 683,24 g/mol) do uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 25 μM w roztworze do elektroprzędzenia. Owiń strzykawkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
4. Ostrożnie użyj taśmy klejącej, aby przymocować zmetykrylowane szkiełka nakrywki (patrz Khademhosseini i wsp.) do powierzchni trzpienia. Uwaga: włókna zostaną przytwierdzone do metakrylowanych szkiełek nakrywkowych.
5. Przymocuj jeden koniec 5-milimetrowego odcinka rurki silikonowej z złączami luer-lock do jednej z strzykawek, a drugi koniec do igły. Włóż strzykawkę do pompy strzykawkowej i wprowadź igłę przez otwór w rozdzielaczu. Powtórz czynność z drugą strzykawką i rozdzielaczem po przeciwnej stronie trzpienia. Rozdzielacze przesuwają się wzdłuż długości trzpienia i służą do zapewnienia równomiernego rozkładu obu polimerów w powstałym rusztowaniu. Patrz schemat w Rysunek 3.
6. Należy odpowiednio dostosować parametry opisane w sekcji A zgodnie z Tabela 1Upewnij się, że końcówki igieł są wycentrowane na trzpieniu.
   
   Tabela 1. Parametry podwójnego elektroprzędzenia polimerów
   

   Strzykawka	Odległość od Fannera do końcówki igły (cm)	Odległość od końcówki igły do trzpienia (cm)	Szybkość przepływu (ml/h)	Napięcie przyłożone (kV)
   MeHA	6	15	1.2	+22
   PEO	6	10	1.2	+15

   
   
7. Po prawidłowym ustawieniu wszystkich elementów należy wyłączyć światło, a następnie uruchomić mandrel oraz pompy strzykawkowe. Należy usunąć folię aluminiową ze strzykawek. Gdy ciecz pojawi się na końcach obu igieł, należy jednocześnie włączyć zasilacze i podłączyć wentylatory.
8. Po zakończeniu zbierania wyłączyć zasilacze oraz trzpień i odłączyć wentylatory. Ostrożnie usunąć szkiełka nakrywki i taśmę za pomocą żyletki.
9. Wizualizuj włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla rhodaminy i DAPI. Zobacz przykład w Rysunek 3Uwaga: Włókna fluorescencyjne są najlepiej widoczne, gdy proces elektroprzędzenia trwa krótko (<3 minuty), jednakże proces ten można przedłużyć w nieskończoność w celu utworzenia grubszych konstruktów, szczególnie bez użycia szkiełek podstawowych.

D. Wysiewanie komórek na rusztowania

1. Umieść każde szkiełko podstawowe z naniesionym polimerem z elektroprzędzenia w oddzielnej studzience płytki wielodołkowej o odpowiednim rozmiarze. Uwaga: oddziaływania komórek z włóknami są łatwo widoczne przy elektroprzędzeniu na metakrylowanych szkiełkach szklanych. Do wizualizacji włókien można ponownie zastosować MeRho.
2. Inkubuj rusztowania w PBS przez noc, aby zapewnić całkowite usunięcie rozpuszczalnika i wszelkich możliwych wymywalnych produktów ubocznych.
3. Usuń PBS ze studzienek.
4. W celu sterylizacji rusztowań umieść je pod lampą bakteriobójczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 30 minut. W przypadku zasiewania całego rusztowania, obróć je i umieść pod lampą bakteriobójczą na kolejne 30 minut.
5. Przeprowadź standardową hodowlę komórkową i przygotuj skoncentrowaną zawiesinę komórek o pożądanej gęstości (np. 6,000 cells cm^-2). Przykładowo, użyj 100 mL zawiesiny komórek dla szkiełka o wymiarach 22 mm X 22 mm. Umieść w inkubatorze na 1 godzinę.
6. Dodaj odpowiednią ilość pożywki do hodowli komórkowej do każdej studzienki. Umieść rusztowania z powrotem w inkubatorze.
7. Przebarw komórki przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu Live/Dead. Uwaga: w celu wizualizacji komórek można zastosować inne rodzaje barwienia, takie jak DAPI (jądra komórkowe) i znakowana fluorescencyjnie faloidyna (aktynowe włókna stresu).
8. Wizualizuj komórki i włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla TRITC i FITC. Zobacz przykład na Rysunku 4.

Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Schemat przedstawiający konfigurację urządzenia do tworzenia rusztowań nieukładanych (góra) oraz rusztowań układanych (dół). Pokazano przykładowe obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla każdego typu rusztowania. Pasek skali = 5μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rysunek 2. Schemat metody wzorowania. Wzory są formowane poprzez umieszczenie fotomaski między źródłem światła a rusztowaniem podczas fotousieciowania, a następnie wypłukanie niezwiązanego polimeru. Fotomaska oraz obraz SEM rusztowań po formowaniu porów i liofilizacji. Pasek skali = 100 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.

Rysunek 3. Schemat układu do wielopolimerowego elektroprzędzenia i niezbędnych parametrów procesowych, a także reprezentatywny obraz fluorescencyjny mieszaniny dwóch populacji włókien (przykład: czerwone MeHA i niebieskie PEO), które zostały jednoczesnie elektroprzędzione w celu utworzenia wielopolimerowego rusztowania. Pasek skali = 100 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3.

Rycina 4. Przykład obrazu z barwieniem Live/Dead ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych oraz ich oddziaływań z włóknami otrzymanymi metodą elektroprzędzenia. Pasek skali = 100 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.

Dyskusja

Do przygotowania włóknistych rusztowań polimerowych wykorzystano metodę elektroprzędzenia. Jako przykład ilustrujący zastosowano rusztowania fotousieciowalne oparte na kwasie hialuronowym, w których do przeprowadzenia sieciowania wymagana jest ekspozycja na światło. Dzięki zastosowaniu reaktywnych makromerów, takich jak MeHA, w rusztowaniach utworzono kanały (które wcześniej wykazały zdolność do poprawy dystrybucji komórek) poprzez użycie maski podczas fotousieciowania, co pozwoliło na uzyskanie struktur makroporowatych ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DAPI	Odczynnik	Invitrogen	D1306
I2959	Odczynnik	Ciba Specialty Chemicals
PEO 200 kDa		Polysciences, Inc.	17503
PEO 900 kDa	Odczynnik	Sigma-Aldrich	189456
Metakryloksyetylotiokarbamoilorodamina B	Odczynnik	Polysciences, Inc.	23591-100	Przygotować roztwór zapasowy w DMSO
Zestaw barwiący Live/Dead	Odczynnik	Invitrogen	L3224	Zawiera kalceinę (barwi żywe komórki na zielono) i jodek etydinium (barwi martwe komórki na czerwono)
Pompa strzykawkowa	Urządzenie	KD Scientific	KDS100	Dwie pompy są niezbędne do przędzenia podwójnego polimeru
Źródło zasilania	Urządzenie	Gamma High Voltage	ES30P-5W	Dwa urządzenia są niezbędne do przędzenia podwójnego polimeru
Silnik	Urządzenie	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Musi być przymocowany do specjalnie wykonanego trzpienia
Tachometr	Urządzenie	Network Tool Warehouse	ESI-330	Służy do monitorowania prędkości trzpienia
System utwardzania punktowego UV Omnicure z adapterem kolimującym	Urządzenie	EXFO	S1000
Przewód silikonowy	Urządzenie	McMaster-Carr	51135K151
Adapter żeński Luer Lock	Urządzenie	McMaster-Carr	51525K293
Adapter męski Luer Lock	Urządzenie	McMaster-Carr	51525K143
Igły	Urządzenie	Fisher Scientific	14-825-16H
Łaseczki	Urządzenie	Corning	2875-22