Disekcja embrionów myszy w 6,5 dniu po zapłodnieniu (dpc)

Podsumowanie

Izolacja embrionów w stadium poimplantacyjnym umożliwia badanie wzorców ekspresji genów oraz analizę procesów podejmowania decyzji dotyczących linii komórkowych podczas rozwoju embrionalnego, jednak prawidłowa dysekcja wczesnego embrionu może być trudna. Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji wczesnych embrionów w stadium prążka pierwotnego (~6,5 days post coitum [dpc]).

Streszczenie

Analiza wzorców ekspresji genów podczas wczesnych etapów rozwoju embrionalnego ssaków może dostarczyć istotnych wskazówek dotyczących funkcji genów, oddziaływań międzykomórkowych oraz mechanizmów sygnalizacyjnych, które kierują formowaniem się wzorców embrionalnych. Jednak wypreparowanie zarodka myszy z błony desidualnej krótko po implantacji może być procedurą trudną, a brakuje szczegółowej dokumentacji tego procesu krok po kroku.

W niniejszym materiale demonstrujemy sposób izolacji embrionów po implantacji (6,5 dpc), polegający najpierw na wycięciu macicy u ciężarnej myszy (wykrycie czopa pochwowego uznano za dzień 0,5 post coitum), a następnie na wyseparowaniu embrionu z decidua macierzystej. Opisano również dyssekcję błony Reicherta oraz usunięcie stożka ektoplacentalnego.

Protokół

Disekcja organów rozrodczych samicy myszy

1. Zabieg eutanazji ciężarnych zwierząt przeprowadza się poprzez uduszenie CO₂ przy użyciu gazu sprężonego.
2. Zwierzę ułożyć na plecach na podkładce chłonnej i nasączyć 70% etanolem, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia preparatu sierścią myszy.
3. Ucisnąć skórę i wykonać regularnymi nożyczkami chirurgicznymi niewielkie nacięcie poprzeczne wzdłuż linii środkowej. Mocno chwycić skórę powyżej i poniżej nacięcia, a następnie rozsunąć ją w stronę głowy i ogona, aby odsłonić jamę brzuszną.
4. Chwycić otrzewną pęsetą i rozciąć ją, aby odsłonić jamę brzuszną.
5. Zlokalizować narządy rozrodcze w grzbietowej części jamy ciała: dwa rogi macicy, jajowody oraz jajniki.

Disekcja na etapie prążka pierwotnego (6,5 dpc)

1. Usunąć róg macicy, chwytając macicę poniżej jajowodu i wycinając ją wzdłuż krezki macicy. Wypreparowaną macicę umieścić w lodowatym PBS.
   
   
   
   Rysunek 1
   
   
2. Oddzielić poszczególne embriony, przecinając róg macicy pomiędzy miejscami implantacji.
   
   
   
   Rysunek 2
   
   
   
3. Chwycić mięśniową wyściółkę macicy, wsuwając pęsetę zegarmistrzowską pomiędzy otaczającą warstwę mięśniową a otaczającą tkankę decydualną. Odchylić warstwę mięśniową, odsłaniając decyduę.
   
   
   
   Rysunek 3
   
   
4. Odciąć fragment odsłoniętej decyduy w okolicy wierzchołka (około 1/5 tkanki decydualnej), co odsłoni środkową część brzuszna lub dystalny koniec zamkniętego w niej embrionu.
   
   
   
   Rysunek 4
   
   
5. Embrion można wydobyć za pomocą końcówek pęsety. Przebić decyduę pęsetą wokół embrionu, a następnie rozchylić pęsetę, aby rozerwać decyduę.
   
   
   
   Rysunek 5
   
   
6. Po usunięciu embrionu może być nadal przytwierdzona błona Reicharta, a także stożek ektoplacentalny (trofoblast). Można przeprowadzić dalszą dyssekcję embrionu poprzez ostrożne preparowanie.
   
   
   Rysunek 6
   

Dyskusja

Implantacja u myszy następuje między 4,5 dpc a narodzinami. Opisaną metodę sekcji można zastosować w sposób niemal identyczny do izolacji embrionów w wcześniejszych lub późniejszych stadiach rozwoju, między 5,5 a 8,5 dpc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikropinceta do sekcji, ząbkowana, prosta	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 pary
Mikropinceta do sekcji wzór #55 INOX	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 pary
Fosforanowy bufor solny Dulbecco’s (1x)	Odczynnik	Invitrogen	14190
Sterylna szalka Petri z polistyrenu Fisherbrand	Narzędzie	Fisher Scientific	08-757-12
4% Paraformaldehyd w PBS	Odczynnik
Proste nożyczki do sekcji z ostrymi końcami	Narzędzie	Fisher Scientific	08-940
Ciężarne myszy	Zwierzę
Mikroskop sekcyjny	Mikroskop