Unikanie osmotyczne w Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkiego NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów na autyzm

Summary

Neurexin i neuroligin to białka adhezyjne błonowo-neuronowe, które odgrywają istotną rolę w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy są wadliwe w wykrywaniu siły osmotycznej, ale gdy zawierają również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Abstract

Neureksyny i neuroliginy to cząsteczki adhezyjne obecne w synapsach pobudzających i hamujących, które są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania sieci neuronowej¹. Białka te znajdują się na błonach presynaptycznych i postsynaptycznych ². Badania na myszach wskazują, że neureksyny i neurologiny odgrywają zasadniczą rolę w przekaźnictwie synaptycznym ¹. Ostatnie doniesienia wykazały, że zmienione połączenia neuronalne podczas rozwoju układu nerwowego człowieka mogą stanowić podstawę etiologii wielu przypadków zaburzeń ze spektrum autyzmu ³.

Caenorhabditis elegans może być używany jako eksperymentalne narzędzie ułatwiające badanie funkcjonowania komponentów synaptycznych, ze względu na jego prostotę do eksperymentów laboratoryjnych oraz biorąc pod uwagę, że jego układ nerwowy i okablowanie synaptyczne zostały w pełni scharakteryzowane. W C. Geny Elegans nrx-1 i NLG-1 są ortologiczne w stosunku do ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, które kodują odpowiednio białka alfa-neureksyny-1 i neuroliginy-1. U ludzi i nicieni organizacja neureksyn i neuroligin jest podobna w odniesieniu do domen funkcjonalnych.

Głowa nicieni zawiera amfidę, organ zmysłowy nicienia, który pośredniczy w reakcjach na różne bodźce, w tym na siłę osmotyczną. Amfid składa się z 12 czuciowych neuronów dwubiegunowych z orzęsionymi dendrytami i jednym presynaptycznym aksonem końcowym ⁴. Dwa z tych neuronów, nazwane ASHR i ASHL, są szczególnie ważne w osmotycznej funkcji czuciowej, wykrywając rozpuszczalne w wodzie repelenty o wysokiej sile osmotycznej ⁵. Dendryty tych dwóch neuronów wydłużają się do czubka jamy ustnej, a aksony rozciągają się do pierścienia nerwowego, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami, determinując odpowiedź behawioralną ⁶.

Aby ocenić implikacje neureksyny i neuroliginy w unikaniu wysokiej siły osmotycznej, pokazujemy odmienną reakcję mutantów C. elegans wadliwych w genach nrx-1 i nlg-1, używając metody opartej na pierścieniu fruktozowym ^{4M 7}. Fenotypy behawioralne potwierdzono przy użyciu specyficznych klonów RNAi ⁸. U C. elegans dsRNA wymagane do wyzwolenia RNAi może być podawane przez karmienie ⁹. Dostarczanie dsRNA przez żywność indukuje interferencję RNAi w genie będącym przedmiotem zainteresowania, umożliwiając w ten sposób identyfikację składników genetycznych i szlaków sieciowych.

Protocol

1: Test unikania osmotyki.

1. Na około 16-24 godziny przed badaniem należy pobrać zwierzęta w stadium larwalnym L4 z każdego genotypu na świeżą płytkę NGM zawierającą OP50 E. coli i inkubować ją w temperaturze 20 °C. Następnego dnia rozpocznij eksperyment z młodymi dorosłymi.
2. Zaleca się przeprowadzenie testu "na ślepo". Płytki z każdym szczepem, który ma być testowany, powinny być ponownie oznakowane przez drugiego eksperymentatora, wykonującego test przy użyciu ponownie oznakowanych płytek, które zostaną zdemaskowane po zakończeniu eksperymentu.
3. W dniu testu należy przygotować 4M roztwór podstawowy fruktozy z 1% roztworem czerwieni kongijskiej i całkowicie rozpuścić w temperaturze pokojowej. Zalecamy sprawdzenie roztworu przed każdym testem, ponieważ barwnik może z czasem się wytrącić.
4. Pierścień pierścieniowy (o średnicy 1 cm) na płytce NGM jest obrysowany na środku stałego podłoża z 15 μl czerwonego roztworu fruktozy 4M. Pozwól, aby roztwór fruktozy wsiąknął w agar, zwykle zajmuje to od 2 do 5 minut.
5. Umieść poszczególne młode dorosłe zwierzęta każdego szczepu w pierścieniu i obserwuj przez następne 10 minut, aby określić reakcję na barierę osmotyczną. Zwierzęta unikające obrączki więcej niż sześć razy z rzędu są klasyfikowane jako normalne; Te, które opuszczają pierścień w mniej niż sześciu próbach, są uważane za wadliwe pod względem wrażliwości osmotycznej.
   Uwaga: W każdym teście należy użyć szczepu kontrolnego. Młode dorosłe zwierzęta N2 są wykorzystywane jako kontrole pozytywne, ponieważ zdecydowanie unikają bariery pierścieniowej. Nie należy używać zwierząt, które były wcześniej głodzone, przeszły przez larwy Dauer lub pochodzą ze zbyt suchych płytek. Na początku zwierzęta kontrolne powinny być oceniane w dwóch egzemplarzach, aby potwierdzić, że płytki testowe i roztwór są prawidłowe.

2: Generowanie powalających robaków przez karmienie RNAi.

1. Płytki RNAi: Płytki do karmienia NGM RNAi zawierają na litr: 17 g agaru, 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl, 1 ml 5 mg cholesterolu ^ml-1; napełnić kolbę do 1 litra_H2Oi przelać do autoklawu. Po ostygnięciu agaru do około 65 °C dodać 25 ml 1 M KPO₄ o pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M MgSO₄, 0,5 ml karbenicyliny (50 mg ^ml-1) i 1 ml 1M IPTG. Jeśli zaczynasz od przygotowanego stałego NGM, rozpuść stałe podłoże w kuchence mikrofalowej, a następnie umieść płynny NGM na stole do ostygnięcia, a następnie dodaj KPO₄, pH 6,0, CaCl₂,_MgSO4, karbenicylinę i IPTG, jak wskazano wcześniej.
   
   Dodać 10 ml NGM do każdej płytki Petriego o średnicy 60 mm. Pozostaw do ostygnięcia i odwróć płyty, utrzymując je w temperaturze pokojowej przez noc przed użyciem. Talerze można przechowywać w plastikowej torbie w temperaturze 4 °C przez około 4-5 dni.
2. Przygotowanie i indukcja bakterii: Wyizolować kolonie szczepu E.coli HT115 (DE3), przekształcone wektorem L4440 zawierającym fragment odpowiadający genowi docelowemu, na płytkach agarowych Luria-Bertani (LB) (17 g agaru, 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl na litr) zawierających ampicylinę (50 μg/ml) i tetracyklinę (15 μg/ml).
   
   Wybrać kolonię bakterii i zaszczepić w LB 50 μg/ml ampicyliny i hodować przez 6-8 godzin z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C; Wysiewaj kroplę tej kultury na przygotowane płytki NGM i dokładnie wysusz płytki przed inkubacją przez noc (12, 24 godziny) w temperaturze pokojowej, aby umożliwić bakteriom wzrost i rozpoczęcie indukcji. Inkubacja przebiegała w ciemności, ponieważ tetracyklina jest wrażliwa na światło i może wpływać na zmienność testów RNAi między płytkami.
   
   Konieczne jest stosowanie kontroli dodatniej i ujemnej w eksperymentach z karmieniem RNAi. Kontrolą pozytywną jest komórka E.coli HT115 transformowana wektorem L4440 zawierającym sekwencję genu unc-22. Knockdown genu unc-22 powoduje "drgający fenotyp". Kontrolą ujemną jest komórka E.coli HT115 przekształcona pustym wektorem L4440.
3. Obchodzenie się z robakami i punktacja: Pierwszego dnia umieść robaki w stadium L4 z płytki NGM wysianej OP50 na płytkach NGM bez bakterii i inkubuj w temperaturze 20 °C przez 12 godzin (na czczo).
   
   Następnego dnia przenieś młode, dorosłe hermafrodyty na czczo na płytkę wysianą bakteriami wyrażającymi specyficzny gen docelowy RNAi. Pozostawić 40-48 godzin w temperaturze 20 °C, aby uzyskać potomstwo F1.
   
   Następnie umieść kilka dorosłych robaków F1 na innej płytce obsianej tymi samymi bakteriami. Po 24-48 godzinach wybierz i wyizoluj z potomstwa F2 młode dorosłe osobniki (w pełni ukształtowany wystający srom z niewielką ilością jaj) i oceń fenotypy.
   
   Uwaga: indukcja RNAi w neuronach ma pewne ograniczenia ze względu na właściwości oporne układu nerwowego C. elegans na RNAi. Aby przezwyciężyć problemy związane z tą nieefektywnością neuronów, zaleca się stosowanie szczepu rrf-3, który jest nadwrażliwym tłem dla działania RNAi w neuronach ¹⁰. W naszych eksperymentach nie stwierdzono różnic między szczepami Bristol N2 i rrf-3 pod względem analizowanych genów i fenotypu.

3: Użyte szczepy.

Szczepy C. elegans użyte w tej pracy są pokazane w Tabeli 1. Zmutowane szczepy zostały skrzyżowane z N2 typu dzikiego co najmniej cztery razy, aby usunąć niechciane losowe mutacje, które mogły zostać wygenerowane podczas protokołu mutagenezy.

OP50 E. Szczep coli został dostarczony przez Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. Bakteria E.coli HT115 (DE3) z plazmidem pL4440 przenoszącym fragmenty genu nrx-1 (JA:C29A12.5) i nlg-1 (JA:C40C9.5) dostarczył dr Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Hiszpania.

4: Reprezentatywne wyniki.

Ilustracyjne wyniki są przedstawione na rysunkach 1 i 2. Przeprowadzono dziesięć zwierząt z każdego szczepu i co najmniej trzy repliki eksperymentów.

Rysunek 1. Eksperymenty z zachowaniami unikającymi osmotyki.
Szczepy kontrolne i zmutowane robaki z niedoborem nrx-1 (ok1649 i tm1961)V reagują odwróceniem do tyłu, gdy napotkają barierę osmotyczną (fruktoza 4M). Mutanty nlg-1 (ok259 i tm474) X nie wykrywają tej bariery. Podwójne mutanty z niedoborem nlg-1 i nrx-1, szczepy CRR21 (ok1649 ; OK259)VX i CRR23 (tm1961; ok259)VX odzyskał fenotyp typu dzikiego. * oznacza znaczące różnice (P ≤ 0,001) w teście t-studenta, w odpowiedzi każdego szczepu na test Bristol N2 typu dzikiego według testu t-studenta

Rysunek 2. Eksperymenty z powalającymi robakami poprzez karmienie RNAi.
E.coli HT115 (DE3) transformowane z pustym wektorem pL4440 lub zawierającym fragment odpowiadający docelowym genom nrx-1 lub nlg-1 wykorzystano do karmienia różnych szczepów robaków. * wskazuje na istotne różnice (P ≤ 0,001) w teście t-studenta, w odpowiedzi szczepu N2 karmionego bakteriami przenoszącymi wektor pL4440 z fragmentem ukierunkowanym na gen nlg-1 w porównaniu ze szczepem N2 karmionym pustym wektorem pL4440.

Discussion

Neureksyny i neuroliginy odgrywają istotną rolę w przekaźnictwie synaptycznym¹¹ i różnicowaniu połączeń synaptycznych ¹². Obie cząsteczki zostały zidentyfikowane jako geny kandydujące do autyzmu ^13,14.

W tym filmie pokazujemy prostą metodę, która pozwala nam badać wpływ genów na odpowiedź unikania osmotycznego u C. elegans. Mutanty z niedoborem neuroliginy są wadliwe w wykrywaniu siły osmotycznej; ale mutanty z niedoborem neureksyny wykazują odpowiedź...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela 1. C. elegans szczepy. Strain Gen Allel Źródło Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPONIA VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPONIA NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; NLG-1 OK1649; ok259 Ta praca CRR22 nrx-1; NLG-1 TM1961; ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokio Damskie s Uniwersytet Medyczny, Japan.