Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Streszczenie

TheDrosophilaoko jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów jak neurogeneza, transdukcja sygnału i neurodegeneracja. Wiele odkryć dokonanych przy użyciu tego systemu wykorzystywało spatiotemporalny charakter różnicowania się fotoreceptorów w rozwijającym się dysku wyobrażeniowym oka. Aby korzystać z tego systemu, badacz musi najpierw nauczyć się identyfikować i wypreparowywać dysk oka. Opisujemy nowy reporter RFP, który pomaga w identyfikacji dysku oka oraz wizualizacji specyficznych typów komórek w rozwijającym się oku. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania dysku wyobrażeniowego oka z larw trzeciego instaru i opisujemy, w jaki sposób reporter eye-RFP może wspomóc ten proces. Reporter eye-RFP jest wyrażany wyłącznie w oku i może być wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zarówno w żywej tkance, jak i po utrwaleniu, bez konieczności amplifikacji sygnału. Pokazujemy również, jak ten reporter może być wykorzystany do identyfikacji specyficznych typów komórek w obrębie dysku oka. Niniejszy protokół oraz zastosowanie reportera eye-RFP pomogą badaczom wykorzystującym tenDrosophilaoko, aby odpowiedzieć na fundamentalnie ważne pytania biologiczne.

Protokół

1. Najpierw nanieś kroplę PBS na szalkę Sylgard pod mikroskopem stereoskopowym.
2. Następnie za pomocą szpatułki wyjmij z fiolki lub butelki kilka wędrujących larw trzeciego stadium i umieść je w PBS.
3. Aby rozpocząć sekcję, użyj pęsety w lewej ręce (jeśli jesteś praworęczny), aby chwycić larwę w dwóch trzecich długości w kierunku tylnym, a następnie użyj drugiej pęsety, aby przytrzymać ciemne haczyki gębowe na końcu przednim.
4. Teraz delikatnie rozdziel larwę, odsuwając obie pęsety od siebie. Aparat gębowy powinien oddzielić się od reszty ciała wraz z kompleksem oko/mózg.
5. Aby zabarwić krążki oka do immunofluorescencji, utrwal krążki na tym etapie, umieszczając je w 4% roztworze paraformaldehydu/PBS na 30-45 minut w lodzie. Następnie przemyj krążki czterokrotnie w PBST i zabarw je odpowiednimi przeciwciałami.
6. Najłatwiej jest przeprowadzić sekcję krążków oka bezpośrednio na szkiełku. Nanieś kroplę PBS na szkiełko i przenieś krążki do kropli PBS, trzymając za aparat gębowy.
7. Tkanki imaginalne są półprzezroczyste, dlatego początkowo krążki oka są trudne do zidentyfikowania. Aby ułatwić ich identyfikację, użyj mikroskopu stereoskopowego z możliwością fluorescencji. Przy użyciu linii reporterowej eye-RFP krążki oka są wyraźnie widoczne jako czerwona fluorescencyjna tkanka nakładająca się na sferyczne płaty optyczne (Rycina 1).
8. Jeśli używasz światłowodowego zimnego źródła światła, skieruj światło pod kątem skośnym do szkiełka, co zapewni krążkom większy kontrast. Krążki oka/antenalne są przyłączone do płatów optycznych za pomocą szypułek optycznych z tyłu oraz do aparatu gębowego za pomocą szypułki wychodzącej z krążka antenalnego z przodu.
9. Aby wypreparować krążki oka, przytrzymaj aparat gębowy jedną pęsetą i użyj drugiej pęsety, aby oddzielić krążki oka od mózgu larwy. Następnie oddziel krążki oka od aparatu gębowego. Na koniec usuń aparat gębowy ze szkiełka, ponieważ może on uniemożliwić płaskie położenie szkiełka nakrywkowego.
10. Po wypreparowaniu wszystkich krążków oka delikatnie przechyl szkiełko i osusz nadmiar PBS. Następnie dodaj kroplę Vectashield i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe.
11. Krążki są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej (Rycina 2).

Reprezentatywne wyniki

Po prawidłowej sekcji tarczka oka/anteny powinna płasko spoczywać na szkiełku, bez żadnych tkanek obcych, takich jak mózg. Biegun grzbietowy i brzuszny tarczki oka są zakrzywione, przez co mają tendencję do zwijania się, ale można tego uniknąć, wykonując serię obrazów Z (Z-series) na mikroskopie konfokalnym i pomijając te sekcje w projekcji. Chociaż tarczka jest nabłonkiem jednowarstwowym, zmienne położenie jąder komórkowych wymaga wykonania projekcji serii Z w celu uzyskania ogólnego obrazu tarczki. Projekcja typowej tarczki oka/anteny eye-RFP wykonana na mikroskopie konfokalnym przedstawiona jest na rysunku 2. Zazwyczaj wykonujemy sekcje o grubości 1 μm przez tarczkę, używając obiektywu 20x lub 40x. Reporter eye-RFP lokalizuje się w jądrach, zatem wzór widoczny na rysunku 2 reprezentuje jądra komórek wykazujących ekspresję RFP.

Rycina 1. Wstępna dysekcja kompleksu oko/mózg z larwy Drosophila trzeciego stadium z markerem eye-RFP. Tarcza imaginalna oka/czułka (obrysowana) jest przytwierdzona do części gębowych (MP) i nakłada się na płat wzrokowy (OL) mózgu. Obraz wykonano przy użyciu stereomikroskopu fluorescencyjnego, aby ukazać ekspresję RFP w tarczy oka. Strona przednia znajduje się po lewej. Pasek skali: 300 μm.

Rycina 2. Ekspresja reportera eye-RFP w tarczce imaginalnej oka. Tarczka oka (ED)/czułkowa (AD) trzeciego stadium larwalnego wypreparowana z larwy eye-RFP, wykazująca ekspresję RFP (czerwony). Tarczkę barwiono faloidyną (zielony), która barwi apikalne powierzchnie komórek i uwidacznia bruzdę morfogenetyczną (grot strzałki). RFP wykazuje ekspresję w komórkach prekursorowych wokół bruzdy morfogenetycznej, w fotoreceptorach 1, 6, 7 oraz w komórkach stożkowych. Strona przednia znajduje się po lewej stronie. Pasek skali: 25 μm.

Dyskusja

Disekcja krążka wyobraźniczego oka Drosophila jest prosta, ale jej opanowanie może wymagać czasu. Kluczowe etapy to identyfikacja krążka oka oraz jego oddzielenie od larwalnego mózgu. Identyfikacja krążka oka jest ułatwiona dzięki zastosowaniu linii eye-RFP opisanej w niniejszym materiale. Możliwe modyfikacje obejmują usunięcie krążka czuciwego lub błony peripodialnej, bądź pozostawienie przyłączonego płata optycznego w celu wizualizacji aksonów PR wchodzących do mózgu.

Linia eye-RFP...