Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
TheDrosophilaoko jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów jak neurogeneza, transdukcja sygnału i neurodegeneracja. Wiele odkryć dokonanych przy użyciu tego systemu wykorzystywało spatiotemporalny charakter różnicowania się fotoreceptorów w rozwijającym się dysku wyobrażeniowym oka. Aby korzystać z tego systemu, badacz musi najpierw nauczyć się identyfikować i wypreparowywać dysk oka. Opisujemy nowy reporter RFP, który pomaga w identyfikacji dysku oka oraz wizualizacji specyficznych typów komórek w rozwijającym się oku. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania dysku wyobrażeniowego oka z larw trzeciego instaru i opisujemy, w jaki sposób reporter eye-RFP może wspomóc ten proces. Reporter eye-RFP jest wyrażany wyłącznie w oku i może być wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zarówno w żywej tkance, jak i po utrwaleniu, bez konieczności amplifikacji sygnału. Pokazujemy również, jak ten reporter może być wykorzystany do identyfikacji specyficznych typów komórek w obrębie dysku oka. Niniejszy protokół oraz zastosowanie reportera eye-RFP pomogą badaczom wykorzystującym tenDrosophilaoko, aby odpowiedzieć na fundamentalnie ważne pytania biologiczne.
Protokół
- Najpierw nanieś kroplę PBS na szalkę Sylgard pod mikroskopem stereoskopowym.
- Następnie za pomocą szpatułki wyjmij z fiolki lub butelki kilka wędrujących larw trzeciego stadium i umieść je w PBS.
- Aby rozpocząć sekcję, użyj pęsety w lewej ręce (jeśli jesteś praworęczny), aby chwycić larwę w dwóch trzecich długości w kierunku tylnym, a następnie użyj drugiej pęsety, aby przytrzymać ciemne haczyki gębowe na końcu przednim.
- Teraz delikatnie rozdziel larwę, odsuwając obie pęsety od siebie. Aparat gębowy powinien oddzielić się od reszty ciała wraz z kompleksem oko/mózg.
- Aby zabarwić krążki oka do immunofluorescencji, utrwal krążki na ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Disekcja krążka wyobraźniczego oka Drosophila jest prosta, ale jej opanowanie może wymagać czasu. Kluczowe etapy to identyfikacja krążka oka oraz jego oddzielenie od larwalnego mózgu. Identyfikacja krążka oka jest ułatwiona dzięki zastosowaniu linii eye-RFP opisanej w niniejszym materiale. Możliwe modyfikacje obejmują usunięcie krążka czuciwego lub błony peripodialnej, bądź pozostawienie przyłączonego płata optycznego w celu wizualizacji aksonów PR wchodzących do mózgu.
Linia eye-RFP.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez King’s College London oraz Royal Society.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).
- Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
