Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Streszczenie

MorfogenezaDrosophilazarodkowa rurka serca stała się cennym modelem badawczym do studiowania migracji komórek, adhezji międzykomórkowej oraz zmian kształtu komórek podczas rozwoju zarodkowego. Jednym z wyzwań w badaniu tej struktury jest fakt, że światło rurki serca, jak również cechy błonowe kluczowe dla formowania się rurki serca, są trudne do wizualizacji w całych zarodkach ze względu na niewielki rozmiar rurki serca i przestrzeni wewnątrzświatłowej w stosunku do zarodka. Zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej umożliwia większe powiększenie tych struktur i daje możliwość badania zarodków w przekroju poprzecznym, co pozwala łatwo określić rozmiar i kształt światła. W tym filmie szczegółowo opisujemy proces niezawodnej fiksacji, zatapiania i krojenia późnych stadiówDrosophilazarodki w celu wizualizacji światła rurki serca, a także istotnych struktur komórkowych, w tym połączeń międzykomórkowych i błony podstawnej.

Protokół

1. Przygotuj na świeżo 2ml roztworu utrwalającego zawierającego 12,5% glutaraldehydu w 50mM buforze kakodylanowym (pH7,4) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Dodaj 8ml n-heptanu i energicznie wstrząśnij. Pozostaw do rozdzielenia się dwóch faz. Usuń górną fazę zawierającą n-heptan nasycony glutaraldehydem, przelej ją do czystej fiolki scyntylacyjnej i odstaw. Będzie to roztwór utrwalający.
2. Zbierz embriony w wieku 0-20 godzin za pomocą komory do zbierania embrionów, która stanowi mały koszyczek z wyjmowanym wkładem siatkowym. Usuń zewnętrzną błonę chorionową, namaczając embriony w 50% roztworze wybielacza przez 2-3 minuty lub do momentu, aż embriony wypłyną na powierzchnię. Dokładnie wypłucz wodą ddH20 i osusz embriony na ręczniku papierowym.
3. Za pomocą pęsety chwyć wkład siatkowy pokryty zdechorionowanymi embrionami i umieść go w roztworze utrwalającym, pozwalając embrionom opaść z siatki. Pozostaw embriony do utrwalenia na 1,5 godziny w temperaturze 4°C, mieszając na nutatorze.
4. Przygotuj szalkę Petriego wyłożoną taśmą dwustronną. Usuń embriony z utrwalacza za pomocą pipety Pasteura i umieść je na klejącej powierzchni szalki Petriego. Przenieś embriony w minimalnej ilości roztworu utrwalającego, aby zapobiec rozpuszczeniu kleju taśmy przez heptan zawarty w utrwalaczu. Wstrząśnij szalką Petriego, aby utworzyć pojedynczą warstwę embrionów. Umieść szalkę Petriego w dygestorium do czasu odparowania heptanu. Dodaj odpowiednią ilość PBS + 0,1% Tween20, aby przykryć embriony. Przeprowadź ręczną dewitellinizację embrionów w późnej fazie 16 pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą tępej igły wolframowej. Zbierz embriony pipetą Pasteura do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml. Kroki 5-7 wykonuje się w tej probówce.
5. Wypłucz embriony w 0,1M buforze kakodylanowym o pH 7,4, a następnie przeprowadź postutrwalanie w roztworze zawierającym 1% czterotlenku osmu w 0,1M buforze kakodylanowym o pH 7,4 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wypłucz embriony 0,1M buforze kakodylanowym o pH 7,4.
6. Odwodnij embriony w stopniowanej serii etanolu i acetonu. Odwodnij embriony w 50% etanolu przez 10 minut, a następnie w 70% etanolu przez 10 minut. Następnie odwodnij w 90% acetonie przez 10 minut oraz w dwóch krokach w 100% acetonie po 10 minut każdy.
7. Usuń aceton, a następnie rozpocznij proces infiltracji, dodając do embrionów mieszaninę żywicy Epon-Spurr i acetonu w stosunku 1:1. Naświetlaj w mikrofalówce Pelco Biowave Pro przez trzy minuty, utrzymując próbkę pod ciśnieniem próżniowym. Stosuj ciśnienie próżniowe do próbki przez dodatkowe pięć minut po zakończeniu pracy mikrofalówki. Wymień mieszaninę żywicy i acetonu 1:1 na 100% żywicę Epon-Spurr i ponownie naświetlaj w mikrofalówce pod ciśnieniem próżniowym. Wymień 100% żywicę Epon-Spurr po raz ostatni i naświetlaj w mikrofalówce pod ciśnieniem próżniowym.
8. Za pomocą pipety Pasteura przenieś embriony z probówki mikrocentryfugowej do silikonowej formy do zatapiania. Ustaw embriony w rzędzie tak, aby koniec tylny embrionu był wyrównany z zwężonym brzegiem formy. Wygrzewaj w piecu w temperaturze 70°C przez noc.
9. Wyjmij próbkę i przygotuj ją do krojenia.
10. Rozpocznij wycinanie sekcji o grubości 1μm przy użyciu noża diamentowego Histo Knife i mikrotomu Richert Ultracut E. Odnotuj moment dotarcia do pierwszej sekcji embrionu. Od tego punktu wytnij 100μm w głąb próbki. Pobierz sekcję za pomocą pętli i umieść ją na szkiełku przedmiotowym. Krótko podgrzej sekcję na płytce grzejnej. Zabarw sekcję za pomocą kropli błękitu metylenowego. Pod mikroskopem świetlnym zidentyfikuj światło serca.
11. Wytnij sekcje o grubości 90nm przy użyciu noża diamentowego Ultra 45° i mikrotomu Richert Ultracut E. Pobierz wiele sekcji na siatkę miedzianą.
12. Siatki barwi się 3% octanem uranylu nasyconym w 50% etanolu przez dziesięć minut, a następnie płucze trzy razy w wodzie dwukrotnie destylowanej. Następnie siatki barwi się cytrynianem ołowiu (0,04g rozpuszczone w 10ml wody dwukrotnie destylowanej i 100ml 10M NaOH) przez 2,5 minuty w komorze zawierającej granulki NaOH w celu stworzenia środowiska wolnego od CO₂. Siatki płucze się trzy razy w wodzie dwukrotnie destylowanej.
13. Sekcje są badane za pomocą mikroskopu elektronowego JEOL 1200EX przy 80Kv i fotografowane cyfrową kamerą AMT.

Dyskusja

Morfogeneza embrionalnej rurki serca Drosophila stała się cennym systemem modelowym do badania adhezji komórek i zmian ich kształtu podczas rozwoju embrionalnego. Jednym z wyzwań w badaniu tej struktury jest trudność w wizualizacji światła rurki serca w całych embrionach. Technika zaprezentowana w tym filmie, zaadaptowana z wcześniej opisanych procedur ^1-2, okazała się skuteczna w wydajnej i niezawodnej analizie znacznej liczby genotypów pod kątem formowania się rurki serca i jej światła³.