Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.
Artykuł metodologiczny
Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Agregacja płytek krwi zachodzi w odpowiedzi na uszkodzenie naczyniowe, w którym odsłonięta zostaje macierz zewnątrzkomórkowa znajdująca się pod śródbłonkiem. Kaskada adhezji płytek zachodzi w obecności przepływu ścinającego, który jest czynnikiem nieuwzględnianym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi z wykorzystaniem mikrofluidycznego formatu płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego. Białka zewnątrzkomórkowe, kolagen I lub czynnik von Willebranda, są osadzane w kanale mikrofluidycznym przy użyciu aktywnej perfuzji z pompą pneumatyczną. Następnie białka macierzy są płukane buforem i blokowane, aby przygotować kanał mikrofluidyczny do interakcji z płytkami krwi. Krew pełna oznakowana barwnikiem fluorescencyjnym jest perfundowana przez kanał z różnymi prędkościami przepływu w celu wywołania aktywacji i agregacji płytek. Przed eksperymentem w komorze przepływowej można dodać inhibitory agregacji płytek krwi w celu uzyskania danych dotyczących dawki i odpowiedzi IC50.
Protokół
Część 1: Przygotowanie kanałów mikroprzepływowych płytki BioFlux.
- Przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze przepływowej należy przygotować kanały mikroprzepływowe poprzez pokrycie ich odpowiednim białkiem. W tym przypadku zostanie użyty kolagen I. Każdy kanał posiada otwór wlotowy i wylotowy. W przypadku tej płytki otwór wlotowy znajduje się po lewej stronie i zasila kanał, a otwór wylotowy znajduje się po prawej stronie.
- Rozcieńczyć roztwór kolagenu I (stężenie zapasu 5mg/ml) do stężenia 200μg/ml w 0,02M kwasie octowym. Na każdy używany kanał będzie potrzebne 20μl. Wymieszać poprzez delikatne pipetowanie końcówką mikropipety.
- Dodać 20 μl roztworu pokrywającego do każdego z kanałów przeznaczonych do użycia. Należy nanieść ciecz do wewnętrznego otworu (inner punch) otworu wlotowego zasilającego wybrany kanał mikroprzepływowy za pomocą mikropipety. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza; nie należy wypychać powietrza z pipety. Jeden kanał należy pozostawić bez kolagenu jako kontrolę bez kolagenu (kontrola negatywna dla adhezji i agregacji).
- Przymocować interfejs do płytki, najpierw dokręcając ręcznie 4 śruby, a następnie, gdy wszystkie będą ustawione, użyć klucza dynamometrycznego do pełnego dokręcenia. Klucz dynamometryczny kliknie po osiągnięciu maksymalnej siły dokręcenia.
- Korzystając z trybu ręcznego w oprogramowaniu BioFlux, zastosować perfuzję w wybranych kanałach z wartością 2dyn/cm2 — z otworu wylotowego. Należy wówczas obserwować, aż przeciwległy wewnętrzny otwór zostanie wypełniony cieczą. Zajmie to kilka minut. Można to obserwować za pomocą mikroskopu z obiektywem o niskiej mocy (4X), lokalizując otwór wlotowy, lub trzymając płytkę i zaglądając do otworów wlotowych od dołu. Powinna pojawić się mała kropla cieczy, która powoli wypełnia wewnętrzny otwór. Gdy wewnętrzny otwór wlotowy zostanie wypełniony, należy natychmiast zatrzymać perfuzję, klikając stop w oprogramowaniu.
- Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
- Zdjąć interfejs i dodać 1 ml PBS (z dodatkiem Ca2+/Mg2+) do otworu wylotowego. Rozpocząć perfuzję z otworu wylotowego z wartością 2dyn/cm2. Kontynuować perfuzję przez 10 minut. Zatrzymać perfuzję i zdjąć interfejs.
- Usunąć nadmiar PBS z otworów wlotowych i wylotowych – nigdy nie usuwać cieczy wypełniającej wewnętrzne otwory. Zablokować kanały, używając roztworu blokującego (0,5% v/v BSA w PBS (z dodatkiem Ca2+/Mg2+)). Dodać 1 ml roztworu blokującego do każdego używanego otworu wylotowego i przeprowadzić perfuzję z otworu wylotowego z wartością 2dyn/cm2. Kontynuować perfuzję przez 10 minut. Zatrzymać perfuzję i zdjąć interfejs. Kanały przygotowane do tego etapu mogą być wykorzystywane przez cały dzień.
- Przed dodaniem krwi usunąć ciecz po obu stronach kanału, z wyjątkiem obszaru wewnętrznych otworów.
Część 2. Przygotowanie krwi z użyciem przeciwciała hamującego GPIIb/IIIa.
- Podczas inkubacji kolagenu w kanałach należy przygotować krew pełną. Podczas pracy z ludzką krwią należy przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w danej instytucji.
- Świeża ludzka krew (pobrana od osoby na czczo) z antykoagulantem cytrynianem sodu powinna zostać wykorzystana w ciągu 3 godzin od pobrania.
- Przygotować krew, dodając 4μM kalceiny AM. Przygotować roztwór zapasowy kalceiny AM o stężeniu 4mM w DMSO i dodać do krwi w rozcieńczeniu 1/1000 v/v. Wymieszać przez delikatne odwracanie probówek.
- Rozdzielić 1 ml krwi znakowanej kalceiną AM do 10 mikroprobówek o pojemności 1,5mL. Do każdej z nich dodać przeciwciało inhibitorowe GPIIb/IIIa w żądanym rozcieńczeniu (masa cząsteczkowa IgG wynosi ~150kDa). Przykład serii rozcieńczeń obejmuje zakres od 1200nM do 9nM, w tym kontrolę bez przeciwciał oraz kontrolę z niepowiązanym przeciwciałem. Doskonałą kontrolą pozytywną dla inhibicji byłby ReoPro (abciximab, Eli Lilly) w stężeniu 20ug/ml. Wymieszać przez delikatne odwracanie probówek.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Wymieszać przez delikatne odwracanie probówek co 10 minut.
Część 3: Przeprowadzanie eksperymentu w komorze przepływowej na stacji roboczej BF1000.
- W pierwszej kolejności należy skonfigurować zautomatyzowany protokół w module sterującym BioFlux. Dla kolagenu I należy ustawić protokół na 10dyn/cm2 przez 10 minut z otworu wylotowego. Na tym etapie należy również ustawić parametry akwizycji danych za pomocą stacji roboczej BF1000, w tym pozycje kanałów, rejestrację w długości fali FITC oraz informacje o odstępach czasowych (time-lapse). Zaleca się rejestrację 3 pól widzenia przy użyciu obiektywu 10x na kanał co 30 sekund przez łącznie 10 minut.
- Szybko należy wprowadzić 500ul przygotowanej krwi dla każdego wariantu do oddzielnych, przygotowanych kanałów. Krew kontrolną bez przeciwciał należy umieścić w kanale powleczonym kolagenem oraz w kanale jedynie zablokowanym.
- Należy nałożyć interfejs na płytkę.
- Płytkę należy umieścić w mikroskopie stacji roboczej BF1000. Następnie należy zamocować interfejs.
- Należy przeprowadzić regulację obciążenia płytki. Następnie należy przesunąć stoлик do jednego z otworów zawierających krew. Należy ustawić parametry rejestracji obrazu FITC (czas ekspozycji, wzmocnienie itp.).
- W oprogramowaniu BioFlux montage należy uruchomić akwizycję, aby jednocześnie rozpocząć przepływ i rejestrację danych.
- Należy wyjąć płytkę ze stacji roboczej BF1000 i zutylizować ją zgodnie z wytycznymi instytucji.
Część 4: Reprezentatywne wyniki.
W niniejszym materiale przedstawiono protokół adhezji i agregacji płytek krwi w kanałach mikrofluidycznych. Protokół obejmował również traktowanie inhibitorem agregacji płytek krwi, przeciwciałem anty-GPIIb/IIIa. Stosując kanały mikrofluidyczne systemu BioFlux powlekane kolagenem, należy spodziewać się agresywnego tworzenia zakrzepów w czasie w przypadku nieleczonej kontrolnej próbki krwi oraz braku tworzenia zakrzepów w kanale niepowlekanym. W jednym z niedawno przeprowadzonych eksperymentów średnia wielkość agregatów w warunkach kontrolnych wynosiła 2000μm2.
Rysunek 1.
Aktywowany kompleks GPIIb/IIIa jest silnym mediatorem oddziaływań między płytkami krwi oraz stabilizacji agregacji1. Adhezja do kolagenu aktywuje kompleks GPIIb/IIIa, wywołując tę odpowiedź 2. Po inkubacji z przeciwciałem anty-GPIIb/IIIa przez 1 godzinę przed narażeniem na siły ścinające, należy spodziewać się obserwacji zmniejszenia rozmiaru skrzepów, jak również spadku częstotliwości ich powstawania. Odpowiedź zależna od dawki jest zazwyczaj obserwowana przy 10dyn/cm2.
Rysunek 2.
Wartość IC50 dla tego konkretnego inhibitora wyniosła 17nM przy 10 dyn/cm2. Maksymalne hamowanie (dla tego dawcy) w porównaniu do kontroli bez przeciwciał wyniosło 11% przy 10 dyn/cm2.
Chociaż przedstawione tutaj metody zastosowano z użyciem konkretnego białka macierzy zewnątrzkomórkowej i konkretnego inhibitora agregacji płytek krwi, protokół ten można rozszerzyć na inne powłoki, inne typy komórek oraz inne inhibitory w testach adhezji komórkowej. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces takich doświadczeń są: unikanie pęcherzyków powietrza w kanałach mikroprzepływowych, prawidłowe rozcieńczanie wszystkich odczynników w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz zapewnienie właściwych warunków inkubacji dla wszystkich odczynników.
Dyskusja
Choć zaprezentowane tutaj metody wykorzystywały konkretne białko macierzy zewnątrzkomórkowej oraz specyficzny inhibitor agregacji płytek krwi, protokół ten można rozszerzyć na inne powłoki, inne typy komórek oraz inne inhibitory w testach adhezji komórkowej. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces takich eksperymentów są: unikanie pęcherzyków powietrza w kanałach mikroprzepływowych, prawidłowe rozcieńczenie wszystkich odczynników w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz zapewnienie właściwych warunków inkubacji dla wszystkich reagentów.
Oświadczenia
Współautorzy są pracownikami firmy Fluxion Biosciences.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| kolagen I, wołowy | Odczynnik | Invitrogen | A1064401 | można stosować inne źródła kolagenu I |
| PBS z dodatkiem Ca/Mg | Odczynnik | Invitrogen | 14040-117 | |
| Seryjowa albumina wołowa (BSA) | Odczynnik | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | Z VWR |
| kalceina AM | Odczynnik | Invitrogen | C1430 | Można również stosować kalceinę AM z BD |
| System BioFlux 1000 | Odczynnik | Fluxion Biosciences | Kontakt z firmą | |
| Płytka BioFlux | Odczynnik | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| anty-GPIIb/IIIa | Odczynnik | Abcam | ab33407 | alternatywny numer to ab15021 |
| ReoPro | Odczynnik | Eli Lilly | wyłącznie na receptę |
Bibliografia
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
Przedruki i uprawnienia
