Adhezja i agregacja płytek krwi pod przepływem przy użyciu mikroprzepływowych komórek przepływowych

Summary

Kaskada adhezji płytek krwi odbywa się w obecności przepływu ścinającego, czynnika nieuwzględnianego w konwencjonalnych (statycznych) testach płytek studziennych. W tym artykule opisano test agregacji płytek krwi wykorzystujący format płytki mikroprzepływowej do naśladowania fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Abstract

Agregacja płytek krwi występuje w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń krwionośnych, w którym odsłonięta została macierz zewnątrzkomórkowa poniżej śródbłonka. Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w obecności przepływu ścinającego, czynnika nieuwzględnianego w konwencjonalnych (statycznych) testach płytek dołkowych. W tym artykule opisano test agregacji płytek krwi wykorzystujący format płytki mikroprzepływowej do naśladowania fizjologicznych warunków przepływu ścinającego. Białka zewnątrzkomórkowe, kolagen I lub czynnik von Willebranda odkładają się w kanale mikroprzepływowym za pomocą aktywnej perfuzji z pompą pneumatyczną. Białka macierzy są następnie przemywane buforem i blokowane w celu przygotowania kanału mikroprzepływowego do interakcji płytek krwi. Krew pełna znakowana barwnikiem fluorescencyjnym jest perfundowana przez kanał z różnymi prędkościami przepływu w celu uzyskania aktywacji i agregacji płytek krwi. Inhibitory agregacji płytek krwi można dodać przed eksperymentem z komórkami przepływowymi w celu wygenerowania danych dotyczących odpowiedzi na dawkę IC50.

Protocol

Część 1: Przygotowanie kanałów mikroprzepływowych płytki BioFlux.

1. Przed przeprowadzeniem eksperymentu z komórką przepływową należy przygotować kanały mikroprzepływowe z powłoką białkową, która jest przedmiotem zainteresowania. W tym przypadku zostanie użyty kolagen I. Każdy kanał ma studnię wlotową i wylotową. W przypadku tej płyty studzienka wlotowa to lewa studnia zasilająca kanał, a studnia wylotowa znajduje się po prawej stronie.
2. Rozcieńczyć powłokę kolagenu I (5 mg / ml bulionu) do stężenia 200 μg / ml w 0,02 M kwasie octowym. Na każdy używany kanał potrzeba 20 μl. Wymieszać przez delikatne triterowanie za pomocą końcówki do mikropipety.
3. Dodać 20 μl powłoki do każdego odpowiedniego kanału, który ma być użyty. Należy dozować ciecz do wewnętrznego stempla studni wylotowej, zasilając interesujący nas kanał mikroprzepływowy za pomocą mikropipety. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, nie wypychaj powietrza z pipety. Uwzględnij jeden kanał bez kolagenu, aby uzyskać kontrolę bez kolagenu (kontrola ujemna dla adhezji i agregacji).
4. Przymocuj interfejs do płyty, najpierw dokręcając palcami 4, a następnie, gdy wszystkie są już ustawione, użyj wkrętaka dynamometrycznego, aby całkowicie dokręcić. Sterownik momentu obrotowego kliknie, gdy osiągnie maksymalną szczelność.
5. Korzystając z trybu ręcznego w oprogramowaniu BioFlux, zastosuj perfuzję do interesujących kanałów z prędkością 2dyn/^cm2 - od studzienki wylotowej. Tutaj należy uważać, aby przeciwny wewnętrzny stempel został wypełniony płynem. Zajmie to kilka minut. Można to obserwować za pomocą obiektywu o małej mocy w mikroskopie (4X) i znajdując studnię wlotową lub trzymając płytkę i patrząc na studzienki wlotowe od dołu. Najpierw należy zobaczyć maleńką kroplę płynu, która powoli wypełnia wewnętrzny stempel. Po napełnieniu wewnętrznego stempla wlotowego natychmiast zatrzymaj perfuzję, naciskając stop w oprogramowaniu.
6. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę.
7. Usunąć granicę faz i dodać 1 ml PBS (plus Ca²⁺/Mg²⁺) do studzienki wylotowej. Rozpocznij perfuzję od studzienki wylotowej przy 2dyn/cm². Kontynuuj perfuzję przez 10 minut. Zatrzymaj perfuzję i usuń interfejs.
8. Usuń nadmiar PBS zarówno ze studzienki wlotowej, jak i wylotowej – nigdy nie usuwaj płynu, który wypełnia wewnętrzny stempel. Zablokuj kanały za pomocą roztworu blokującego (0,5% v/v BSA w PBS (plus Ca^{2 +} / Mg^{2 +})). Dodać 1 ml roztworu blokującego do każdego studzienki wylotowej, która ma być użyta, i perfekować ze studzienki wylotowej z prędkością 2dyn/^cm2. Kontynuuj perfuzję przez 10 minut. Zatrzymaj perfuzję i usuń interfejs. Kanały przygotowane do tego kroku mogą być używane przez cały dzień.
9. Przed dodaniem krwi usuń płyn po obu stronach kanału, z wyjątkiem wewnętrznych stempli.

Część 2. Przygotowanie krwi z przeciwciałem hamującym GPIIb/IIIa.

1. Podczas gdy kolagen inkubuje się w kanałach, należy przygotować krew pełną. Podczas obchodzenia się z krwią ludzką należy przestrzegać przepisów bezpieczeństwa biologicznego narzuconych przez instytut
.
2. Świeżą krew ludzką (od osoby na czczo) pobraną do antykoagulantu cytrynianu sodu należy zużyć w ciągu 3 godzin od pobrania.
3. Przygotuj krew, dodając 4 μM kalceiny AM. Przygotować 4 mM zapasu kalceiny AM w DMSO i dodać do krwi w rozcieńczeniu 1/1000 v/v. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.
4. Dozuj 1 ml krwi znakowanej kalceiną AM do 10 - 1,5 ml mikroprobówek. Dodaj przeciwciało inhibitora GPIIb/IIIa do każdego w żądanym rozcieńczeniu (masa cząsteczkowa IgG wynosi ~150 kDa). Przykładowa seria rozcieńczeń wynosi od 1200 nM do 9 nM i obejmuje kontrolę bez przeciwciał i kontrolę przeciwciał niepowiązanych. Doskonałym pozytywnym środkiem kontrolnym do inhibicji byłby ReoPro (abciximab, Eli Lilly) w stężeniu 20ug/ml. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.
5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaj przez delikatne odwrócenie co 10 minut.

Część 3: Przeprowadzanie eksperymentu z komórką przepływową na stacji roboczej BF1000.

1. Po pierwsze, należy skonfigurować zautomatyzowany protokół w module sterującym BioFlux. W przypadku kolagenu I należy ustalić protokół, aby uruchomić 10dyn/cm² przez 10 minut od studni wylotowej. W tym miejscu należy również ustawić parametry akwizycji danych za pomocą stacji roboczej BF1000, w tym pozycje kanałów, przechwytywanie w długości fali FITC oraz informacje poklatkowe. Zaleca się rejestrowanie 3 pól widzenia za pomocą obiektywu 10x na kanał co 30 sekund przez łącznie 10 minut.
2. Pracując szybko, umieść 500ul przygotowanej krwi każdego stanu w oddzielnych przygotowanych kanałach. Nie umieszczaj krwi kontrolnej przeciwciał w kanale, który jest pokryty kolagenem i takim, który jest po prostu zablokowany.
3. Umieść interfejs na talerzu.
4. Umieść płytkę na mikroskopie stacji roboczej BF1000. Clamp na interfejsie.
5. Wykonaj regulację obciążenia płyty. Przenieś również etap do jednej studzienki zawierającej krew. Ustaw parametry przechwytywania obrazu FTIC (czas ekspozycji, wzmocnienie itp.).
6. W oprogramowaniu montażowym BioFlux rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć przepływ i akwizycję jednocześnie.
7. Wyjmij płytkę ze stacji roboczej BF1000, zutylizuj płytę zgodnie z wytycznymi instytucji.

Część 4: Reprezentatywne wyniki.

Tutaj przedstawiono protokół adhezji i agregacji płytek krwi w kanałach mikroprzepływowych. W protokole uwzględniono również leczenie inhibitorem agregacji płytek krwi, anty-GPIIb/IIIa. Korzystając z pokrytych kolagenem kanałów mikroprzepływowych systemu BioFlux, należy spodziewać się agresywnego tworzenia się skrzepliny w miarę upływu czasu w nieleczonej próbce krwi kontrolnej i braku tworzenia się skrzepliny w kanale niepowlekanym. W jednym z niedawno przeprowadzonych doświadczeń średnia wielkość agregatów w warunkach kontrolnych wynosiła 2000 μm²,
Rysunek 1.

Aktywowany GPIIb/IIIa jest silnym mediatorem interakcji płytki-płytki krwi i stabilizacji agregacji¹. Adhezja do kolagenu aktywuje kompleks GPIIb/IIIa w celu wywołania tej odpowiedzi ². Po inkubacji z anty-GPIIb/IIIa przez 1 godzinę przed ekspozycją na ścinanie należy spodziewać się zmniejszenia wielkości skrzeplin, a także zmniejszenia częstości tworzenia się skrzeplin. Odpowiedź zależną od dawki można zwykle zaobserwować przy 10 dyn/^cm2.
Rysunek 2.

Wartość IC₅₀ dla tego konkretnego inhibitora wynosiła 17nM przy 10 dyn/cm². Maksymalne zahamowanie (dla tego dawcy) w porównaniu z grupą kontrolną bez przeciwciał wynosiło 11% przy 10 dyn/^cm2.

Chociaż przedstawione tutaj metody zostały przedstawione przy użyciu specyficznego białka macierzy zewnątrzkomórkowej i specyficznego inhibitora agregacji płytek krwi, protokół jest rozszerzalny na inne powłoki, inne typy komórek i inne inhibitory do testów adhezji komórek. Kluczowymi składnikami sukcesu takich eksperymentów są unikanie pęcherzyków w kanałach mikroprzepływowych, prawidłowe rozcieńczenie wszystkich odczynników w odpowiednich rozcieńczalnikach oraz odpowiednie warunki inkubacji dla wszystkich odczynników.

Discussion

Chociaż przedstawione tutaj metody zostały przedstawione przy użyciu specyficznego białka macierzy zewnątrzkomórkowej i specyficznego inhibitora agregacji płytek krwi, protokół można rozszerzyć na inne powłoki, inne typy komórek i inne inhibitory do testów adhezji komórek. Kluczowymi składnikami sukcesu takich eksperymentów są unikanie pęcherzyków w kanałach mikroprzepływowych, prawidłowe rozcieńczenie wszystkich odczynników w odpowiednich rozcieńczalnikach oraz odpowiednie warunki inkubacji dla wszystkich odczynników.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
kolagen I, odczynnik bydlęcy		Invitrogen	A1064401	inne źródła kolagenu I mogą być używane
PBS plus Odczynnik Ca/Mg		Invitrogen	14040-117
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Odczynnik	EMD Millipore	EM-2930 Dno formy
odczynnika	VWR calcein AM	Invitrogen	C1430	Calceina AM z puszki BD można również użyć
Odczynnik systemu BioFlux 1000		Fluxion Biosciences	Skontaktuj się z firmą
Odczynnik BioFlux Plate		Fluxion Biosciences	900013
odczynnik	antyGPIIb/IIIa	Abcam	ab33407	alternatywą # jest ab15021
Odczynnik ReoPro		Eli Lilly		tylko przez Rx