Żywa dyssekcja zarodków Drosophila: Usprawnione metody przesiewania kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Podsumowanie

Opisujemy usprawniony protokół przygotowywania preparatów typu „fillet” (filetowanie) zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten umożliwia efektywne przeprowadzanie różnorodnych przesiewów genetycznych. Pozwala on również na doskonałą wizualizację struktur w późnym stadium rozwoju zarodka.

Streszczenie

DrosophilaZarodki między 14 a 17 stadium rozwoju embrionalnego można łatwo poddać sekcji w celu przygotowania preparatów typu „fillet”. W takich preparatach układ nerwowy przebiega przez środek, a po jego bokach znajdują się ściany ciała. Z wykorzystaniem takich preparatów zbadano wiele różnych fenotypów. W większości przypadków preparaty te uzyskiwano poprzez sekcję utrwalonych zarodków całych, zabarwionych przeciwciałami. „Sekcje utrwalone” mają jednak pewne wady. Ich wykonanie jest czasochłonne, a oddzielenie zarodków mutantów (negatywnych pod kątem GFP) od linii, w których mutacje są utrzymywane na chromosomach balancer z GFP, jest trudne. Od 2002 roku nasza grupa prowadzi przesiewy deficyjne i ektopowej ekspresji w celu identyfikacji ligandów dla receptorów sierocych. Aby to osiągnąć, opracowaliśmy usprawnione protokoły sekcji żywych zarodków oraz barwienia przeciwciałami kolekcji zawierających setki zbalansowanych linii. Stwierdziliśmy, że badanie fenotypów w dużych kolekcjach linii za pomocą sekcji na żywo jest znacznie bardziej efektywne niż sekcja utrwalona. Stosując opisany tutaj protokół, jedna przeszkolona osoba może przesiewać pod kątem fenotypów do 10 linii dziennie, badając 4–7 zarodków mutantów z każdej linii pod mikroskopem złożonym. Pozwala to na identyfikację mutacji nadających subtelne fenotypy o niskiej penetracji, ponieważ przy dużym powiększeniu, z użyciem obiektywu imersyjnego wodnego 40X, ocenia się do 70 hemisegmentów na linię.

Protokół

Wstęp

Drosophila embriony pomiędzy stadiami 14 a 17 rozwoju embrionalnego można łatwo poddać preparatyce w celu uzyskania preparatów typu „filet”. W takich preparatach centralny układ nerwowy (CNS) biegnie przez środek, a z obu stron ograniczają go ściany ciała. Jelito zostaje usunięte. Po barwieniu przeciwciałami preparaty typu filet umożliwiają znacznie lepszą wizualizację struktur CNS i ścian ciała (np. aksonów ruchowych, mięśni, obwodowych neuronów sensorycznych (PNS), tchawki) niż w przypadku całych embrionów, ponieważ między preparatem a szkiełkiem nakrywkowym nie ma tkanki pośredniczącej, a same filety są płaskie, co pozwala na wizualizację struktur rozciągających się przez ścianę ciała w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Przy użyciu takich preparatów zbadano wiele różnych fenotypów. W większości przypadków filety uzyskuje się poprzez sekcję utrwalonych, zabarwionych przeciwciałami całych embrionów. Te utrwalone preparaty przygotowuje się w następujących krokach: 1) usuwanie chorionu za pomocą wybielacza; 2) utrwalanie paraformaldehydem/heptanem; 3) usuwanie błony witelinowej metanolem; 4) barwienie przeciwciałami z wykorzystaniem immunohistochemii lub immunofluorescencji; 5) klarowanie w glicerolu; 6) sekcja za pomocą igieł wolframowych. Szczegółowe protokoły barwienia tych „utrwalonych sekcji” znajdują się w ref. [1].

Preparaty utrwalone mają jednak pewne wady. Po pierwsze, często trudno jest wyodrębnić utrwalone i barwione embriony mutantów (GFP-ujemne) z linii lub krzyżówek, w których mutacje są zrównoważone za pomocą balancerów GFP, nawet przy zastosowaniu przeciwciał anty-GFP do detekcji. Wynika to z szeregu czynników, w tym z ekspresji GFP pochodzącej od matki. Na przykład stwierdziliśmy, że niemal niemożliwe jest wyodrębnienie utrwalonych i barwionych homozygotycznych embrionów mutantów z linii zrównoważonych na trzecim chromosomie przy użyciu balancerów actin-GFP lub armadillo (arm)-GFP. Po drugie, przygotowanie wysokiej jakości utrwalonych preparatów jest bardzo czasochłonne. Tempo 10-15 preparatów na godzinę jest bliskie maksymalnym możliwościom większości osób. Po trzecie, niektóre przeciwciała nie barwią prawidłowo w preparatach utrwalonych, albo dlatego, że epitopy przeciwciał są wrażliwe na utrwalanie, albo dlatego, że przeciwciało barwiące zarówno struktury wewnętrzne, jak i zewnętrzne jest „pochłaniane” przez struktury zewnętrzne i nie przenika do wnętrza (np. przeciwciała przeciwko fascylinie III (Fas3)). Po czwarte, barwienie żywych organizmów za pomocą białek fuzyjnych receptorów w celu wykrycia ekspresji ligandów nie jest możliwe w przypadku preparatów utrwalonych.

Od 2002 roku nasza grupa prowadzi badania przesiewowe w zakresie deficytów (Df) oraz ekspresji ektopowej w celu identyfikacji ligandów RPTP. Aby to osiągnąć, opracowaliśmy usprawnione protokoły sekcji żywych embrionów i barwienia kolekcji zawierających setki linii zbalansowanych. Barwienie ligandów receptorów osieroconych z użyciem białek fuzyjnych receptora jest specjalistycznym zastosowaniem, które nie jest wykorzystywane przez wiele grup. Jednak wiele grup stosuje barwienie przeciwciałami preparatów typu „fillet” w celu wizualizacji fenotypów embrionalnych. Dzięki opracowaniu tych metod doszliśmy do wniosku, że badanie fenotypów w dużych kolekcjach szczepów poprzez sekcję na żywo jest znacznie bardziej efektywne niż sekcja na utrwalonych próbkach. Wykorzystaliśmy sekcję na żywo do charakterystyki fenotypów aksonów ruchowych, OUN i mięśni w ponad 600 Df, a także scharakteryzowaliśmy fenotypy układu nerwowego wywołane ektopową ekspresją ponad 400 różnych białek powierzchniowych i wydzielniczych (A.W. et al. w przygotowaniu; H-K. L. et al., w przygotowaniu).

Stosowane przez nas protokoły sekcji na żywo ewoluowały na przestrzeni lat. Jeden z autorów (K.Z.) został zapoznany z techniką sekcji na żywo ponad 20 lat temu przez Nipama Patela, który był wówczas doktorantem w laboratorium Coreya Goodmana. W późniejszych latach wykorzystywaliśmy tę metodę do barwienia OUN przeciwciałami anty-Fas3 [2], jednak we wszystkich pozostałych eksperymentach stosowaliśmy sekcje utrwalonych tkanek. W 1999 roku Aloisia Schmid, wówczas stażystka podoktorska w naszej grupie, wprowadziła nas do techniki sekcji na żywo z użyciem szklanych igieł, której używała do badania fenotypów w embrionach wstrzykniętych dwuniciowym RNA[3, 4]. Kiedy kilka lat później rozpoczęliśmy badania przesiewowe ligandów RPTP, zmodyfikowaliśmy jej protokoły, aby umożliwić szybką analizę dużych kolekcji linii utrzymywanych na balancerach GFP. Stwierdziliśmy, że embriony GFP-ujemne można łatwo wyselekcjonować z linii z balancerem GFP, nawet przy znacznej maternej ekspresji GFP (np. dla balancera TM3armGFP), ponieważ embriony są sortowane na żywo, a subtelne różnice w ekspresji GFP mogą zostać łatwo wykryte. Nasz udany screening Df w poszukiwaniu liganda Lar został opisany w[5].

Stosując nasze aktualne protokoły, jedna przeszkolona osoba może przeprowadzić przesiew 5-10 linii dziennie pod kątem fenotypów, badając od 4 do 7 embrionów mutantów z każdej linii pod mikroskopem złożonym. Po wyselekcjonowaniu i uporządkowaniu embrionów, preparatyka 50 embrionów zajmuje około jednej godziny. Metoda ta pozwala nam zidentyfikować mutacje nadające subtelne fenotypy o niskiej penetracji, ponieważ w każdej linii ocenia się do 70 hemisegmentów przy dużym powiększeniu, używając obiektywu imersyjnego z wodą 40X. Takie fenotypy byłyby trudne lub niemożliwe do wykrycia w przesiewach barwionych embrionów w całości pod mikroskopem stereoskopowym.

Zdefiniowaliśmy zestaw Df do przesiewania fenotypowego, który zawiera około 250 linii i reprezentuje około połowy genomu (A.W. et al., w przygotowaniu). Opracowanie tego zestawu rozpoczęto w ramach naszych badań przesiewowych zestawu Bloomington Df w stanie z lat 2002-2003 pod kątem genów niezbędnych do syntezy ligandów RPTP[5]. W trakcie tego przesiewania zastąpiliśmy linie Df z zestawu Bloomington, w których homozygoty Df/Df nie rozwijały OUN (a w konsekwencji nie mogły być badane pod kątem ekspresji ligandów w OUN), mniejszymi liniami Df, najlepiej zmapowanymi molekularnie, które wykazywały lepszy rozwój.

Homozygoty Df/Df z linii w naszym zestawie do przesiewania fenotypowego wykazują prawidłową morfologię ogólną w stadium 16, co pozwala badaczowi na systematyczne poszukiwanie genów wpływających na rozwój OUN, obwodowego układu nerwowego, włókien mięśniowych, sieci tchawkowych oraz wielu innych tkanek. Każda struktura, wzorzec ekspresji lub wzorzec lokalizacji subkomórkowej, które można zwizualizować za pomocą specyficznego przeciwciała lub markera GFP w stadiach 14-16, mogą zostać poddane przesiewaniu fenotypowemu przy użyciu tego zestawu. Oznacza to, że stosując opisany tutaj protokół, jedna osoba poświęcająca na ten projekt około połowy swojego czasu pracy mogłaby systematycznie przesiewać połowę wszystkich genów Drosophila pod kątem dowolnego pożądanego fenotypu embrionalnego w ciągu od sześciu miesięcy do roku.

A. Zbieranie zarodków Drosophila

1. Przygotuj pięcioodcinkowe komory do zbierania jaj

Komory te pozwalają oszczędzić czas i wysiłek podczas badania dużej liczby linii much.

1. Ustaw pięć probówek stożkowych o pojemności 50 mL dnem do góry na dnie plastikowej płytki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i sklej probówki ze sobą, używając silikonowego kleju uszczelniającego.
2. Po utwardzeniu kleju przyklej dno płytki Petriego do stożkowych końców probówek. Pięć probówek stożkowych powinno znajdować się wewnątrz płytki Petriego.
3. Za pomocą rozgrzanej igły wykonaj w probówkach otwory w celu zapewnienia cyrkulacji powietrza.

2. Przygotuj płytki do zbierania jaj

1. Wlej około 7 mL żelu z agaru winogronowego (1%) do każdej plastikowej płytki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm. Idealna grubość żelu wynosi około 3-4 mm, co pozwala na uszczelnienie każdej probówki stożkowej i zapewnienie wilgotności przez 24 godziny. Jeśli żel będzie zbyt gruby, może opaść podczas zmiany płytki.
2. Po ostygnięciu płytek z żelem przykryj je i włóż do oryginalnej plastikowej torebki na płytki Petriego. Szczelnie zamknij torebkę i przechowuj w temperaturze 4°C.

3. Przygotuj muchy

1. Aby uzyskać wystarczającą liczbę jaj do łatwego wyboru embrionów na właściwym stadium, staramy się umieścić w krzyżówce >50 dziewic oraz >20 samców.
2. W przypadku konieczności przesiewania krzyżówki, należy zmieszać muchy płci męskiej i żeńskiej i utrzymać je w fiolce z pożywką dla much, z dużą ilością suchych granulek drożdży na dnie oraz cienkim paskiem papieru (10 X 100 mm, złożonym na pół) umieszczonym na środku pożywki. Pasek papieru zapewni większą powierzchnię i uchroni muchy przed nadmierną wilgocią.
3. Fiolki z muchami należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 dni.
4. Jeśli przesiewaniu podlega materiał z butelki, należy po prostu przenieść muchy do komory zbiorczej.

4. Przenieś muchy do pięciokomorowych komór do zbierania jaj.

1. Oznacz każdą beczkę komór do zbierania jajeczek.
2. Nałóż pastę drożdżową na płytkę do zbierania jajeczek dla każdej beczki.
3. Przygotuj 20-calową taśmę etykietującą do połączenia komory z płytką. Zegnij 10 mm każdego końca, aby ułatwić wymianę płytki.
4. Wprowadź gaz CO₂ do fiolek z muchami i przenieś muchy do oznakowanych beczek.
5. Przykryj komorę płytką do zbierania jajeczek i dociśnij ją.
6. Owiń taśmą komorę i płytkę, zaczynając od środka płytki z agarem. Taśma powinna nachodzić na płytkę do zbierania jajeczek.

5. Zbierz zarodki

1. Przygotowanie płytki do zbierania jaj: Nanieść pastę drożdżową na płytkę do zbierania jaj dla każdego pojemnika.
2. Opukać muchy w komorach do zbierania jaj i usunąć taśmę wokół komór (mocno trzymając starą płytkę).
3. Ponownie opukać muchy i zastąpić starą płytkę nową.
4. Zbierać embriony w pozycji skośnej przez 2-4 godziny.
5. Wymienić płytkę do zbierania jaj w wyznaczonym czasie.

6. Określenie wieku embrionów

Umieść płytkę do zbierania jaj odwróconą do góry dnem na przykrytej szalce Petriego z wilgotnym, 90 mm okrągłym papierem filtrowanym i przechowuj w pożądanej temperaturze. W przypadku sekcji embrionów w stadium 16 z zbilansowanych linii mutantów, zazwyczaj przeprowadzamy zbiór późnym rankiem, a następnie inkubujemy embriony przez >22 hr w 19° C. Do badań funkcji wzmocnionej (gain-of-function) z wykorzystaniem systemu UAS/GAL4, zbieramy embriony w temperaturze pokojowej po południu i inkubujemy przez 16 hr w 19°C. Następnego dnia przenosimy embriony do inkubatora w 29°C, aby aktywować system UAS/GAL4 na 1 lub 2 hr. Po tym czasie embriony znajdują się głównie w stadium 15, co zapewnia wystarczająco dużo czasu na wyselekcjonowanie embrionów wykazujących ekspresję GFP i ich ustawienie, tak aby osiągnęły stadium 16 w momencie wykonywania sekcji.

7. Określanie stadium rozwoju zarodków i sortowanie pod kątem ekspresji GFP.

Aby rozróżnić genotypy embrionów, stosujemy balansery GFP. Badamy zdechorionowane embriony na taśmie dwustronnej (patrz następna sekcja) pod stereomikroskopem Olympus GFP, jednocześnie wybierając je pod kątem wieku i ekspresji GFP.

a) sortowanie GFP:

1. Stosowany przez nas balancer drugiej chromosomy (CyOarmGFP) posiada GFP sterowany przez promotor armadillo, który wykazuje ekspresję w całej ektodermie. Heterozygoty CyOarmGFP mają oliwkowy kolor, a homozygoty CyOarmGFP są intensywnie zielone. W linii CyOarmGFP zarodki pozbawione balansera są łatwo rozróżnialne, ponieważ niemal nie wykazują ekspresji GFP (wyglądają jak zarodki z linii bez balansera GFP).
2. Balancer trzeciej chromosomy (TM3armGFP) jest trudniejszy w sortowaniu, ponieważ wykazuje silniejszą ekspresję GFP sterowaną przez matkę. W rezultacie zarodki dzielą się na kategorie bardziej i mniej zielone. Przy pewnej wprawie zazwyczaj proste jest oddzielenie zarodków mniej zielonych od bardziej zielonych, jednak po przeniesieniu na płytkę agarową konieczne jest ponowne sortowanie poprzez grupowanie ich i wyłapywanie pojedynczych zarodków, które są bardziej zielone od pozostałych (heterozygoty TM3armGFP). W przeciwnym razie z pewnością pojawią się zarodki o błędnym genotypie.
3. Balancer X to FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Jest on wyrażany w sposób tkankowo specyficzny. Wzory istotne dla sortowania w stadiach 15-16 to amnioserosa oraz dwa punkty ekspresji w głowie, którymi są komórki organu Bolwiga. Niestety w stadium, w którym dokonuje się sortowania zarodków, amnioserosa zanika, a organy Bolwiga nie zaczęły jeszcze świecić. Niezbędne jest zatem bardzo uważne oglądanie zarodków na taśmie, często przez ich obracanie, aby ocenić obecność GFP, a następnie konieczne jest ponowne sortowanie na płytce agarowej. Zazwyczaj robimy to dwukrotnie: raz bezpośrednio po przeniesieniu wszystkich zarodków z taśmy na płytkę, a ponownie po ich dojściu do odpowiedniego stadium, tuż przed ustawieniem ich w rzędzie w przygotowaniu do sekcji. Czasami ponownie badamy preparat pod mikroskopem GFP po przeniesieniu zarodków do puli PBS (patrz poniżej), ponieważ w tych warunkach wizualizacja GFP jest lepsza. Wtedy możemy usunąć zarodki wykazujące GFP tuż przed rozpoczęciem sekcji.

b) Określanie stopnia zaawansowania

Podstawowym narzędziem do określania stadium rozwoju embrionów w przedziale st. 14-16 jest morfologia jelita. Jelito wykazuje autofluorescencję pod mikroskopem GFP. Przed próbą określenia stadium rozwoju należy zapoznać się z książkami referencyjnymi lub stronami zawierającymi zdjęcia i schematy embrionów (np. zielona książka Hartensteina i Campos-Ortegi), aby zrozumieć, jak powinny one wyglądać. Idealnym momentem na przeprowadzenie sekcji jest etap, w którym jelito podzieliło się na trzy pasma. Wcześniej jelito przypomina pojedynczą plamę. Często embriony sortuje się na etapie „plamy”, a następnie inkubuje do momentu osiągnięcia optymalnego stadium do sekcji. Po etapie trzech pasm w pobliżu ogona zaczynają rozwijać się pasma ukośne, a następnie jelito zwija się, a embrion staje się bardziej przejrzysty. W tym okresie sekcja embrionu staje się trudna, ponieważ nie przylega on do szkiełka przedmiotowego. Jeśli planowana jest sekcja embrionów z późnego stadium 16 lub wczesnego stadium 17, konieczne jest przeprowadzenie sekcji wielu osobników i ocena, jakie morfologie jelita wiążą się z embrionami, które przylegają lub nie przylegają do szkiełka. Różni się to również w zależności od genotypu.

B. Żywa sekcja zarodka Drosophila

1. Dechorionizacja zarodków
   1. Przygotować dwustronną taśmę klejącą oraz płytkę z agarem (grape plate slab) na szkiełku przedmiotowym
   2. Przenieść dojrzałe zarodki z płytki zbiorczej na dwustronną taśmę klejącą za pomocą wilgotnego pędzla. Zarodki należy rozłożyć równomiernie.
   3. Odchorionizować zarodki na dwustronnej taśmie klejącej, delikatnie przesuwając je po niej za pomocą stępionego igły sekcyjnej. Po dechorionizacji zarodki będą przylegać mocniej do końcówki igły niż do innych zarodków lub do chorionu, ale nie tak mocno jak do taśmy; dlatego zarodki przetacza się po wierzchniej warstwie chorionu lub po innych zarodkach, następnie unosi i przenosi na płytkę z agarem. Genotypowanie i określanie stadium rozwoju (patrz szczegółowy opis powyżej) wykonuje się podczas procesu dechorionizacji i przenoszenia na igłę.
   4. Po ponownym posegregowaniu według genotypu i wieku, przenieść zarodki na mniejszą prostokątną płytkę z agarem o szerokości umożliwiającej ustawienie 10-15 zarodków w jednym rzędzie. Ustawić dechorionizowane zarodki na tej płytce: stroną grzbietową do dołu przeciwko agarowi, a końcami tylnymi skierowanymi w stronę operatora. Zazwyczaj tworzy się rzędy po 5-10 zarodków.
2. Przygotowanie szkiełka i przenoszenie zarodków do sekcji na żywo
   1. Wyciąć mały prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej i umieścić go blisko jednego z końców szkiełka Super Frost/Plus (Fisher Scientific, Cat#12-550-15).
   2. Obrysować prostokąt (30-40 mm długości, na całej szerokości szkiełka) wokół taśmy za pomocą pisaka woskowego, tak aby między woskiem a taśmą pozostało ok. 3 mm wolnej przestrzeni (Super HT Pap Pen, www.rpicorp.com), a następnie przenieść zarodki z płytki z agarem na taśmę, odwracając szkiełko i delikatnie opuszczając go na zarodki, tak aby taśma zetknęła się z ustawionymi w rzędzie zarodkami (czynność wykonuje się pod stereomikroskopem). Zarodki powinny być ustawione końcem tylnym w stronę operatora. Będą one teraz znajdować się na szkiełku stroną grzbietową do góry.
   3. Natychmiast dodać nad zarodki 1X PBS (według receptury Gibco), aby wypełnić prostokąt z wosku.
3. Sekcja zarodków na żywo
   1. Używając szklanej igły sekcyjnej (wykonanej z igły wstrzykiwalniczej), naciąć wzdłuż linii środkowej grzbietu, zaczynając od tylnego końca zarodka.
   2. Nakłuć przedni koniec zarodka, unieść go i przenieść na szkiełko, aż przylgnie. Zarodki należy utrzymywać w buforze. Ułożyć na szkiełku uporządkowaną linię zarodków odpowiadającą każdemu rzędowi na płytce z agarem. Zorganizować rzędy tak, aby wszystkie zmieściły się na szkiełku.
   3. Istnieje wiele możliwych sekwencji sekcji, które można zastosować przy przygotowywaniu preparatów typu „fillet”. Operatorzy zazwyczaj opracowują własne zoptymalizowane procedury poprzez praktykę sekcyjną. Na filmie zaprezentowano sekwencję, w której wykonuje się niewielkie cięcie na tylnym końcu zarodka, aby oddzielić od siebie dwie strony ściany ciała. W razie potrzeby tym cięciem można również przerwać połączenie jelita środkowego z jelitem końcowym i w tym momencie wysunąć jelito końcowe na szkiełko (na filmie wysunięcie jelita końcowego następuje później). Następnie wykonuje się cięcia po każdej stronie, tuż za płatami mózgu, aby oddzielić ściany ciała od mózgu. W zależności od wieku zarodka może być konieczne wykonanie płytkiego cięcia wzdłuż linii środkowej grzbietu, aby przeciąć połączenie amnio-serozalne między ścianami ciała.
   4. Następnie delikatnie przycisnąć płaty ściany ciała do szkiełka, unikając ich rozciągania lub usuwania materiału z ich powierzchni. Najlepiej zrobić to, pozwalając igle kontaktować się jedynie z przednimi i tylnymi narożnikami na brzegach grzbietowych ściany ciała. Aksony motoryczne nie sięgają tak daleko grzbietowo, więc w najlepszym przypadku pozwoli to uzyskać zarodek z całkowicie nienaruszonymi gałązkami ISN. W niektórych przypadkach ISN może zostać przycięte, nawet przy zastosowaniu najlepszej techniki, ponieważ zarodek nie zawsze rozdziela się dokładnie wzdłuż linii środkowej grzbietu. Jeśli zostanie wykonane poprawnie, metoda ta zachowa struktury ściany ciała w segmentach T3-A6 (w przybliżeniu).
   5. Jelito środkowe można pozostawić na wierzchu zarodka, a następnie usunąć je ze wszystkich sekcjonowanych zarodków po zakończeniu całej procedury. Robi się to poprzez nakłucie jelita, odsuniecie go od zarodka i rozciągnięcie w celu przerwania jego połączenia z jelitem przednim, które znajduje się pod płatami mózgu. Można również usuwać jelito z każdego preparatu na bieżąco po zakończeniu sekcji. W przypadku mutantów z abnormalnym rozwojem jelit korzystne jest usunięcie wszystkich jelit jednocześnie po zakończeniu sekcji, ponieważ uwolnione z jelita żółtko może utrudnić przyklejenie później przenoszonych zarodków do szkiełka. Czasami pomocne jest przenoszenie zarodków zaczynając od dołu szkiełka (w stronę operatora) zamiast od góry, ponieważ żółtko ma tendencję do rozprzestrzeniania się w stronę operatora ze względu na typowe ruchy igły.
4. Fiksacja i immunofluorescencja/immunohistochemia
   1. Na tym etapie można albo natychmiast utrwalić zarodki (jeśli planowane jest barwienie przeciwciałami), albo usunąć PBS i zastąpić go supernatorem białka fuzyjnego, jeśli przeprowadzany jest eksperyment z barwieniem na żywo w celu wykrycia ekspresji ligandu. Ten aspekt eksperymentu został szczegółowo opisany w sekcjach Metody i Metody Uzupełniające w ref. [5].
   2. Tutaj opisujemy protokół fiksacji, który wykonuje się albo natychmiast, albo po barwieniu białkiem fuzyjnym. Używając dwóch pipet Pasteura, zastąpić PBS 5% paraformaldehydem w PBS (EMS, Cat. #15713-S, www.emsdiasum.com). Roztwór utrwalający wymienić trzykrotnie, co wymaga użycia ok. 6 ml roztworu, ponieważ pipeta Pasteura mieści 1,5-2 ml roztworu. Utrawiać przez 45'.
   3. Usunąć roztwór utrwalający, zastąpić go PBS (3 zmiany), następnie PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg/ml BSA frakcji V; 3 zmiany), a następnie zastąpić PBT ok. 200 μl roztworu blokującego (PBT + 5% podgrzanego normalnego surowicy koziej), a następnie pożądanym przeciwciałem pierwotnym w roztworze blokującym. Bardzo ważne jest, aby nie dopuścić do kontaktu menisku z zarodkami, szczególnie gdy znajdują się one w PBS, ponieważ zniszczy to efekty sekcji. Po dodaniu detergentu zarodki stają się mniej wrażliwe na menisk. Zatem PBT można zastąpić roztworem blokującym, przechylając szkiełko i odsączając większość roztworu poprzez krótkie dotknięcie narożnika obszaru ogrodzonego woskiem chusteczką Kimwipe. Tę samą metodę można zastosować przy zastępowaniu bloku roztworem przeciwciał. Minimalizuje to przenoszenie pozostałości poprzednich roztworów.
   4. Inkubować przez noc w 4°C, następnie przemyć 3X w PBT (>15 minut/mycie) w kuwecie na platformie kołyszącej (upewnić się, że jest wystarczająca ilość PBT, aby szkiełko było zawsze całkowicie zanurzone podczas kołysania), ponownie zablokować jak opisano powyżej, dodać 200 μl przeciwciała wtórnego, inkubować 2 h w temperaturze pokojowej, ponownie przemyć w PBT. W razie potrzeby sprawdzić barwienie (jeśli użyto zielonej fluorescencji) pod stereomikroskopem do GFP.
   5. Przemyć 2X w PBS (5'), następnie dodać 500 μl 70% glicerolu/1X PBS (przygotowanego przez zmieszanie 35 ml glicerolu, 5 ml 10X PBS i 10 ml wody w probówce 50 ml) i klarować przez noc w 4°C (lub przez 2 h w temperaturze pokojowej). Usunąć glicerol i nałożyć szkiełko nakrywki nr 1.

Dyskusja

Mamy nadzieję, że ta demonstracja wideo przedstawiła nasze metody mikrodysekcji i barwienia żywych embrionów w stopniu wystarczająco szczegółowym, aby mogły być one teraz łatwo wykonane przez każdą osobę posiadającą doświadczenie w genetyce i embriologii Drosophila. Oczywiście nadal wymagana będzie znaczna praktyka, przede wszystkim w samym procesie mikrodysekcji. W naszym doświadczeniu każda osoba ucząca się metod mikrodysekcji na żywo wypracuje nieco inny protokół, który pozwoli jej na najszybsze uzyskanie wys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka borokrzemianowa z włóknem	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Wyciągacz mikroelektrod Narishige model PC-10	Narishige International		Rurki wyciągane przy poziomie grzania 58.9