Sekcja na żywo zarodków Drosophila: uproszczone metody badań przesiewowych kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Podsumowanie

Opisujemy uproszczony protokół generowania preparatów "filetowych" z zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten pozwala na efektywne wykonywanie różnych badań genetycznych. Pozwala również na doskonałą wizualizację struktur w późnym zarodku.

Streszczenie

Zarodki Drosophila między 14 a 17 etapem rozwoju embrionalnego mogą być łatwo rozbiorowane w celu wytworzenia preparatów "filetowych". W tych preparatach ośrodkowy układ nerwowy biegnie środkiem i jest otoczony ścianami ciała. Przy użyciu takich preparatów przebadano wiele różnych fenotypów. W większości przypadków filety były generowane przez preparację barwionych przeciwciałami utrwalonych zarodków w całości. Te "stałe sekcje" mają jednak pewne wady. Ich wykonanie jest czasochłonne i trudno jest oddzielić zmutowane (GFP-ujemne) zarodki od stad, w których mutacje są utrzymywane na chromosomach równoważących GFP. Od 2002 roku nasza grupa przeprowadza badania przesiewowe niedoboru i ekspresji ektopowej w celu identyfikacji ligandów dla receptorów sierocych. W tym celu opracowaliśmy uproszczone protokoły sekcji żywych zarodków i barwienia przeciwciał w kolekcjach zawierających setki zrównoważonych linii. Doszliśmy do wniosku, że znacznie bardziej efektywne jest badanie fenotypów w dużych zbiorach stad za pomocą sekcji żywej niż przez sekcję ustaloną. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, jedna wyszkolona osoba może przebadać do 10 linii dziennie pod kątem fenotypów, badając 4-7 zmutowanych zarodków z każdej linii pod mikroskopem złożonym. Pozwala to na identyfikację mutacji nadających subtelne fenotypy o niskiej penetracji, ponieważ do 70 półsegmentów na linię jest ocenianych przy dużym powiększeniu za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie.

Protokół

Wprowadzenie

Zarodki Drosophila między 14 a 17 etapem rozwoju embrionalnego mogą być łatwo rozbiorowane w celu wytworzenia preparatów "filetowych". W tych preparatach ośrodkowy układ nerwowy (OUN) biegnie środkiem i jest otoczony ścianami ciała. Jelito jest usuwane. Po zabarwieniu przeciwciałami filety umożliwiają znacznie lepszą wizualizację struktur OUN i ścian ciała (np. aksonów ruchowych, mięśni, neuronów czuciowych obwodowych (PNS), tchawicy) niż zarodki w całości, ponieważ między preparatem a szkiełkiem nakrywkowym nie ma tkanki, a także dlatego, że filety są płaskie, co pozwala na wizualizację struktur rozciągających się w poprzek ściany ciała w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Przy użyciu takich preparatów przebadano wiele różnych fenotypów. W większości przypadków filety są generowane przez rozbiory utrwalonych, wybarwionych przeciwciałami zarodków w całości. Te utrwalone preparaty są generowane w następujących krokach: 1) usunięcie kosmówki za pomocą wybielacza; 2) utrwalanie za pomocą paraformaldehydu/heptanu; 3) usunięcie błony witelinowej za pomocą metanolu; 4) barwienie przeciwciał za pomocą immunohistochemii lub immunofluorescencji; 5) oczyszczanie glicerolu; 6) Rozwarstwienie za pomocą igieł wolframowych. Szczegółowe protokoły barwienia tych "stałych sekcji" znajdują się w odnośniku [1].

Poprawione sekcje mają jednak pewne wady. Po pierwsze, często trudno jest oddzielić utrwalone, wybarwione zmutowane zarodki (GFP-ujemne) od stad lub krzyżówek, w których mutacje są zrównoważone w stosunku do równoważników GFP, nawet jeśli do wykrywania stosuje się anty-GFP. Wynika to z wielu czynników, w tym z matczynej ekspresji GFP. Na przykład odkryliśmy, że prawie niemożliwe jest sortowanie stałych, barwionych homozygotycznych zmutowanych zarodków ze zrównoważonych stad trzeciego chromosomu przy użyciu równoważników aktyna-GFP lub pancernika (ramię)-GFP. Po drugie, generowanie wysokiej jakości stałych sekcji jest dość czasochłonne. 10-15 na godzinę to mniej więcej tyle czasu, ile większość ludzi może to zrobić. Po trzecie, niektóre przeciwciała nie barwią się dobrze w utrwalonych sekcjach, albo dlatego, że epitopy przeciwciał są wrażliwe na utrwalenie, albo dlatego, że przeciwciało, które barwi zarówno struktury wewnętrzne, jak i zewnętrzne, jest "wchłaniane" przez struktury zewnętrzne i nie przenika do struktur wewnętrznych (np. przeciwciała przeciwko fasciclin III (Fas3)). Po czwarte, barwienie na żywo białkami fuzyjnymi receptorów w celu wykrycia ekspresji ligandów nie może być wykonane na utrwalonych preparatach.

Od 2002 roku nasza grupa przeprowadza badania przesiewowe niedoboru (Df) i ekspresji ektopowej w celu identyfikacji ligandów RPTP. W tym celu opracowaliśmy uproszczone protokoły sekcji żywych zarodków i barwienia kolekcji zawierających setki zrównoważonych linii. Barwienie ligandów receptorów sierocych białkami fuzyjnymi receptora jest specjalistycznym zastosowaniem, które nie jest stosowane przez wiele grup. Jednak wiele grup stosuje barwienie filetów przeciwciałami w celu wizualizacji fenotypów embrionalnych. Dzięki naszemu rozwojowi tych metod doszliśmy do wniosku, że znacznie bardziej efektywne jest badanie fenotypów w dużych zbiorach stad przez preparację żywą niż przez sekcję ustaloną. Wykorzystaliśmy żywą sekcję do scharakteryzowania fenotypów aksonów ruchowych, OUN i mięśni w ponad 600 Dfs, a także scharakteryzowaliśmy fenotypy układu nerwowego wytwarzane przez ektopową ekspresję ponad 400 różnych powierzchni komórek i wydzielanych białek (A.W. i wsp. w przygotowaniu; H-K. L. i wsp., w przygotowaniu).

Protokoły sekcji na żywo, których używaliśmy, ewoluowały przez lata. Jeden z autorów (K.Z.) został po raz pierwszy wprowadzony do sekcji na żywo ponad 20 lat temu przez Nipama Patela, który był wtedy doktorantem w laboratorium Coreya Goodmana. W ostatnich latach stosowaliśmy tę metodę do barwienia OUN anty-Fas3 [2], ale we wszystkich innych eksperymentach stosowaliśmy stałe sekcje. W 1999 roku Aloisia Schmid, wówczas postdoc w naszej grupie, wprowadziła nas w proces preparacji na żywo za pomocą szklanych igieł, których używała do badania fenotypów w dwuniciowych zarodkach z wstrzyknięciem RNA [3, 4]. Kiedy kilka lat później zaczęliśmy wykonywać badania przesiewowe ligandów RPTP, zmodyfikowaliśmy jej protokoły, aby umożliwić szybką analizę dużych zbiorów zapasów utrzymywanych za pomocą równoważników GFP. Odkryliśmy, że zarodki z ujemnym wynikiem GFP można łatwo oddzielić od stad zrównoważonych GFP, nawet jeśli występuje znaczna ekspresja GFP u matki (np. w przypadku równoważnika TM3armGFP), ponieważ zarodki są sortowane żywe i można łatwo wykryć subtelne różnice w ekspresji GFP. Nasz udany ekran Df dla ligandu Lar jest opisany w[5].

Korzystając z naszych obecnych protokołów, pojedynczy wyszkolony osobnik może przebadać 5-10 linii dziennie pod kątem fenotypów, badając 4-7 zmutowanych zarodków z każdej linii pod mikroskopem złożonym. Po wybraniu i ułożeniu zarodków, wypreparowanie 50 zarodków zajmuje około godziny. Ta metoda pozwala nam zidentyfikować mutacje nadające subtelne fenotypy o niskiej penetracji, ponieważ do 70 półsegmentów na linię jest ocenianych przy dużym powiększeniu za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie. Takie fenotypy byłyby trudne lub niemożliwe do wykrycia w ekranach barwionych zarodków w całości pod mikroskopem preparacyjnym.

Zdefiniowaliśmy zestaw Df do badań fenotypowych, który zawiera około 250 linii i reprezentuje około połowy genomu (A.W. et al., w przygotowaniu). Rozwój tego zestawu został rozpoczęty jako część naszego badania przesiewowego zestawu Bloomington Df, ponieważ istniał on w latach 2002-2003 dla genów wymaganych do syntezy ligandów RPTP [5]. W trakcie tego badania przesiewowego zastąpiliśmy zestaw Bloomington Dfs, dla którego homozygoty Df / Df nie rozwinęły OUN (a zatem nie mogły być przebadane pod kątem ekspresji liganda OUN) mniejszymi Dfs, najlepiej mapowanymi molekularnie, które miały lepszy rozwój.

Df/Df homozygoty z linii w naszym fenotypowym zestawie przesiewowym mają normalną ogólną morfologię na etapie 16, co pozwala badaczowi na systematyczne badania przesiewowe genów wpływających na rozwój OUN, PNS, włókien mięśniowych, sieci tchawicy i wielu innych tkanek. Każda struktura, wzorzec ekspresji lub wzorzec lokalizacji subkomórkowej, który można uwidocznić za pomocą specyficznego przeciwciała lub markera GFP na etapach 14-16, można przebadać pod kątem fenotypów za pomocą tego zestawu. Oznacza to, że korzystając z opisanego tutaj protokołu, jedna osoba poświęcająca około połowy swojego czasu na ten projekt mogłaby systematycznie badać połowę wszystkich genów Drosophila pod kątem dowolnego pożądanego fenotypu embrionalnego w ciągu sześciu miesięcy do jednego roku.

A. Kolekcja zarodków Drosophila

1. Przygotuj "Pięciobeczkowe" komory do zbierania jaj

Te komory oszczędzają czas i wysiłek podczas badania dużej liczby linii muchowych.

1. Ułóż pięć stożkowych probówek o pojemności 50 ml do góry nogami na dolnej części plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i sklej probówki za pomocą kleju z kauczuku silikonowego.
2. Gdy klej stwardnieje, przyklej dolną część szalki Petriego do stożkowych końców rurek. Pięć stożkowych rurek stanie wewnątrz szalki Petriego.
3. Za pomocą gorącej igły wykonaj otwory w rurkach zapewniających cyrkulację powietrza.

2. Przygotuj talerze do zbierania jaj

1. Wlej około 7 ml żelu z agaru winogronowego (1%) do każdej plastikowej szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm. Idealna grubość żelu to około 3-4 mm, aby uszczelnić każdą stożkową tubkę i zapewnić wilgoć przez 24 godziny. Jeśli żel będzie zbyt gęsty, może spaść, gdy zmienimy płytkę.
2. Po schłodzeniu płytki żelowe przykryj je i włóż do oryginalnej plastikowej torebki na szalki Petriego. Szczelnie zamknij worek i przechowuj w temperaturze 4°C.

3. Przygotuj muchy

1. W celu uzyskania wystarczającej liczby komórek jajowych do łatwej selekcji zarodków w odpowiednim stadium, staramy się umieścić w krzyżówce >50 dziewic wraz z >20 samcami.
2. Jeśli krzyżówka ma być przesiana, wymieszaj samce i samice much i trzymaj je w fiolce z pokarmem dla much z dużą ilością suchych granulek drożdży na dnie i cienkim paskiem papieru (10 x 100 mm, złożonym na pół) umieszczonym w środku pokarmu. Pasek papieru zapewni większą powierzchnię i ochroni muchy przed nadmierną wilgocią.
3. Fiolki z muchami należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 dni.
4. Jeśli wywar z butelki ma zostać przesiany, po prostu przenieś muchy do komory zbiorczej.

4. Przenieś muchy do pięciobeczkowych komór do zbierania jaj.

1. Oznacz każdą beczkę komór do zbierania jaj.
2. Umieść pastę drożdżową na talerzu do zbierania jajek dla każdej beczki.
3. Przygotuj taśmę do etykietowania o długości 20 cali, aby utrzymać komorę i płytkę razem. Złóż 10 mm z każdego końca, aby ułatwić wymianę płyty.
4. Wstrzyknąć gaz CO₂ do fiolek muchowych i przenieść muchy do oznaczonych beczek.
5. Przykryj komorę płytką do zbierania jaj i dociśnij.
6. Owiń taśmą wokół komory i płytki, zaczynając od środka płytki agarowej. Taśma zachodzi na talerz do zbierania jaj.

5. Zbieraj zarodki

1. Przygotuj talerz do zbierania jajek: Umieść pastę drożdżową na talerzu do zbierania jaj dla każdej beczki.
2. Spukaj muchy w komory na jaja i usuń taśmę wokół komór (mocno trzymaj starą płytkę).
3. Ponownie opuknij muchy i wymień starą płytkę na nową.
4. Zbieraj zarodki w pozycji skośnej przez 2-4 godziny.
5. Wymień talerz do zbierania jaj w żądanym czasie.

6. Wiek zarodków

Umieść talerz do zbierania jaj do góry nogami na przykrytej płytce Petriego mokrą bibułą filtracyjną o średnicy 90 mm i utrzymuj w żądanej temperaturze. W przypadku sekcji zarodków w stadium 16 ze zrównoważonych linii zmutowanych, zazwyczaj pobieramy je późnym rankiem, a następnie inkubujemy zarodki przez >22 godziny w temperaturze 19°C. W przypadku badań przyrostu funkcji z wykorzystaniem systemu UAS/GAL4 pobieramy zarodki w RT po południu i inkubujemy przez 16 godzin w temperaturze 19°C. Następnego dnia przenosimy zarodki do inkubatora w temperaturze 29°C, aby aktywować system UAS/GAL4 na 1 lub 2 godziny. Po upływie tego czasu zarodki są w większości w stadium 15, co daje wystarczająco dużo czasu na posortowanie zarodków pod kątem ekspresji GFP i ustawienie ich tak, aby po zakończeniu sekcji znajdowały się na etapie 16.

7. Klasyfikacja zarodków i sortowanie pod kątem ekspresji GFP.

Aby rozróżnić genotypy embrionów, używamy równoważników GFP. Badamy zarodki z odkorówką na podwójnej taśmie klejącej (patrz następna sekcja) pod lunetą preparacyjną Olympus GFP i jednocześnie selekcjonujemy je pod kątem wieku i ekspresji GFP.

a) Sortowanie GFP:

1. Używany przez nas równoważnik drugiego chromosomu (CyOarmGFP) ma GFP napędzany przez promotor pancernika, który ulega ekspresji w całej ektodermie. Heterozygoty CyOarmGFP są oliwkowozielone, a homozygoty CyOarmGFP są jasnozielone. W stadzie CyoarmGFP zarodki, które nie mają równoważnika, są łatwe do odróżnienia, ponieważ prawie nie mają ekspresji GFP (wyglądają jak zarodki z puli bez GFP).
2. Trzeci chromosom równoważący (TM3armGFP) jest trudniejszy w użyciu do sortowania, ponieważ ma bardziej matczyną ekspresję GFP. W rezultacie zarodki dzielą się na mniej i bardziej zielone kategorie. Przy odrobinie wprawy zwykle łatwo jest oddzielić od siebie mniej i bardziej zielone zarodki, ale konieczne jest również uciekanie się do nich poprzez grupowanie ich i wybieranie sporadycznych zarodków, które są bardziej zielone niż inne (heterozygoty TM3armGFP) po przeniesieniu na płytkę agarową. W przeciwnym razie na pewno pojawią się zarodki o nieprawidłowym genotypie.
3. Wyważarka X to FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Jest to wyrażone we wzorcu specyficznym dla tkanki. Wzorce, które są istotne dla sortowania na etapach 15-16, to amnioserosa i dwa punkty ekspresji w głowie, które są komórkami narządów Bolwiga. Niestety, na etapie, w którym chce się sortować zarodki, amnioserosa zanika, a narządy Bolwiga nie zaczęły jeszcze świecić. W związku z tym konieczne jest bardzo dokładne przyjrzenie się zarodkom na taśmie, często przetaczając je na drugą stronę, aby ocenić je pod kątem GFP, a także konieczne jest umieszczenie ich na płytce agarowej. Zazwyczaj robimy to dwukrotnie: raz bezpośrednio po przeniesieniu wszystkich zarodków z taśmy na płytkę, a drugi raz po dojrzewaniu do odpowiedniego etapu, tuż przed ustawieniem ich w rzędzie w ramach przygotowań do sekcji. Czasami ponownie badamy szkiełko w zakresie GFP po transferze zarodków do puli PBS (patrz poniżej), ponieważ wizualizacja GFP jest lepsza w tych warunkach. Następnie możemy zniszczyć zarodki, które mają GFP tuż przed rozpoczęciem sekcji.

b) Inscenizacja

Podstawowym narzędziem do oceny zarodków w okolicach st. 14-16 jest morfologia jelit. Jelito świeci autofluorescencją pod zakresem GFP. Przed przystąpieniem do oceny zarodków należy zapoznać się z podręcznikami lub stronami internetowymi, które zawierają zdjęcia i schematy embrionów (np. Zielona Księga Hartensteina i Camposa-Ortegi), aby zrozumieć, jak powinny one wyglądać. Idealnym etapem rozwarstwienia jest moment, w którym jelito podzieli się na trzy pasma. Wcześniej jelito pojawia się jako pojedyncza plama. Często sortuje się zarodki na etapie kropelki, a następnie starzeje je, aż osiągną najlepszy etap do sekcji. Po etapie trzypasmowym jelito zaczyna rozwijać ukośne pasma w pobliżu ogona, a następnie zwija się, a zarodek staje się jaśniejszy. W tym okresie zarodek staje się trudny do wypreparowania, ponieważ nie przykleja się do szkiełka. Jeśli ktoś chce przeprowadzić sekcję zarodków w późnym stadium 16/wczesnym stadium 17, konieczne jest przeanalizowanie wielu zarodków i ocena, które morfologie jelit są związane z zarodkami, które się sklejają lub nie sklejają. Różni się to również nieco w zależności od genotypu.

B. Sekcja żywego zarodka Drosophila

1. Dechorionacja zarodka
   1. Przygotuj dwustronną taśmę klejącą i płytę z winogron na szkiełku
   2. Przenieś stare zarodki z płytki zbiorczej na dwustronną taśmę klejącą za pomocą mokrego pędzla. Rozłóż zarodki równomiernie.
   3. Zdechorionuj zarodki na dwustronnej taśmie klejącej, delikatnie przewijając je po niej igłą preparacyjną. Po dechorionacji zarodki będą mocniej przylegać do końca igły niż do innych zarodków lub do kosmówki, ale nie tak mocno jak do taśmy; W ten sposób zwija się zarodki na kosmówkę lub na inne zarodki, a następnie podnosi je i przenosi na płytę z winogronami. Genotypowanie i ocena stopnia zaawansowania (szczegółowy opis powyżej) odbywa się podczas procesu dechorionacji i transferu do igły.
   4. Po zwróceniu się o genotyp i wiek, przenieś zarodki na mniejszy prostokątny kawałek agaru, o wystarczającej szerokości, aby umożliwić ułożenie 10-15 zarodków w rzędzie. Ustaw zdekorionowane zarodki na tej płycie: grzbietem do dołu do płyty agarowej, a tylne końce skierowane do siebie. Zwykle tworzymy rzędy po 5-10 zarodków.
2. Przygotuj szkiełko i przenieś zarodki do żywej sekcji
   1. Wytnij mały prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej i umieść go w pobliżu jednego końca szkiełka Super Frost/Plus (Fisher Scientific, Cat#12-550-15).
   2. Narysuj prostokąt (o długości 30-40 mm i pełnej szerokości szkiełka) wokół taśmy za pomocą pisaka woskowego, tak aby między woskiem a taśmą było ~3 mm wolnej przestrzeni (Super HT Pap Pen, www.rpicorp.com) i przenieś zarodki z płyty winogronowej na taśmę, odwracając szkiełko i delikatnie opuszczając je na zarodki, tak, aby taśma stykała się z ułożonymi w kolejce zarodkami (wykonane pod lunetą sekcyjną). Zarodki powinny być ustawione tak, aby tylny koniec był skierowany w twoją stronę. Będą teraz na zjeżdżalni grzbietowo do góry.
   3. Natychmiast dodaj 1X PBS (przepis Gibco) na zarodki, aby wypełnić prostokąt woskowy.
3. Sekcja żywych zarodków
   1. Za pomocą szklanej igły do rozwarstwiania (wykonanej z igły do wstrzykiwań) przeciąć wzdłuż grzbietowej linii środkowej, zaczynając od tylnego końca zarodka.
   2. Szturchnij przedni koniec zarodka, podnieś i przenieś zarodek na szkiełko, aż się przyklei. Przechowywać zarodki w buforze. Wykonaj uporządkowaną linię zarodków na szkiełku, która pasuje do każdego rzędu na płycie agarowej. Uporządkuj wiersze tak, aby wszystkie zmieściły się na slajdzie.
   3. Istnieje wiele możliwych sekwencji rozwarstwiania, które można wykorzystać do generowania zaokrągleń. Ludzie zazwyczaj opracowują własne, zoptymalizowane procedury poprzez samodzielne przeprowadzanie sekcji. Film pokazuje sekwencję, w której na tylnym końcu zarodka wykonuje się małe nacięcie, aby oddzielić od siebie dwie strony ściany ciała. W razie potrzeby można również przerwać połączenie jelita środkowego / tylnego za pomocą tego cięcia i w tym czasie wysunąć jelito tylne na suwak (na filmie przemieszczenie jelita tylnego odbywa się później). Następnie wykonuje się nacięcia z każdej strony, tuż za płatami mózgu, w celu oddzielenia ścian ciała od mózgu. W zależności od wieku zarodka może być również konieczne wykonanie płytkiego cięcia grzbietowej linii środkowej, aby przeciąć połączenie amnioserosalne między ścianami ciała.
   4. Następnie delikatnie przyklej klapy ścianki korpusu na szkiełko, unikając ich rozciągania lub usuwania materiału z ich powierzchni. Najlepiej jest to zrobić, pozwalając igle stykać się tylko z przednim i tylnym rogiem na grzbietowych krawędziach ściany ciała. Aksony motoryczne nie rozciągają się tak daleko grzbietowo, więc w najlepszym przypadku powstanie zarodek z całkowicie nienaruszonymi gałęziami ISN. W niektórych przypadkach ISN zostanie obcięty, nawet przy użyciu najlepszej techniki, ponieważ zarodek nie zawsze rozdziela się dokładnie wzdłuż grzbietowej linii środkowej. Jeśli zostanie wykonana poprawnie, ta metoda zachowa struktury ścian ciała w segmentach T3-A6 (w przybliżeniu).
   5. Można pozostawić jelito środkowe na wierzchu zarodka, a następnie usunąć je ze wszystkich wypreparowanych zarodków po zakończeniu wszystkich sekcji. Odbywa się to poprzez szturchanie jelita, przesuwanie go z dala od zarodka i rozciąganie, aby przerwać jego połączenie z jelitem przednim, które znajduje się pod płatami mózgu. Można też usunąć jelito z każdej sekcji, gdy się ją kończy. W przypadku mutantów, które mają nieprawidłowy rozwój jelit, korzystne jest usunięcie wszystkich wnętrzności naraz po zakończeniu sekcji, ponieważ uwolnione żółtko z jelita może utrudnić przyklejenie później przeniesionych zarodków do szkiełka po transferze z taśmy dwusztyftowej. Czasami pomocne jest przeniesienie zarodków zaczynając od dołu szkiełka (w kierunku Ciebie), a nie od góry, ponieważ żółtko ma tendencję do rozprzestrzeniania się w kierunku Ciebie z powodu typowych ruchów igły.
4. Utrwalenie i immunofluorescencja/immunohistochemia
   1. W tym momencie można albo natychmiast naprawić zarodki, jeśli jest się barwionym przeciwciałami, albo usunąć PBS i zastąpić go supernatantem białka fuzyjnego, jeśli przeprowadza się eksperyment barwienia na żywo w celu wykrycia ekspresji liganda. Ten aspekt eksperymentu jest szczegółowo opisany w sekcjach Metody i Metody uzupełniające w odnośniku [5].
   2. Tutaj opisujemy protokół utrwalania, który wykonuje się natychmiast lub po barwieniu białek fuzyjnych. Używając dwóch pipet Pasteura, zastąp PBS 5% paraformaldehydem w PBS (EMS, Cat. #15713-S, www.emsdiasum.com). Trzykrotnie wymienić w roztworze utrwalającym, co wiąże się z użyciem ~6 ml roztworu utrwalającego, ponieważ pipeta Pasteura mieści 1,5-2 ml roztworu. Poprawka na 45'.
   3. Usunąć roztwór utrwalający, zastąpić PBS (3 zmiany), następnie PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg/ml frakcji V BSA; 3 zmiany), następnie zastąpić PBT roztworem blokowym ~ 200 μl (PBT + 5% normalna surowica kozia poddana obróbce cieplnej), a następnie pożądanym przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokowym. Bardzo ważne jest, aby łąkotka nie mogła kontaktować się z zarodkami, szczególnie gdy znajdują się one w PBS, ponieważ zniszczy to rozwarstwienia. Po dodaniu detergentu zarodki stają się mniej wrażliwe na łąkotkę. W ten sposób można zastąpić PBT blokiem, przechylając szkiełko i ocierając większość roztworu, dotykając krótko Kimwipe w róg obszaru zamkniętego woskiem. Tę samą metodę można zastosować do zastąpienia bloku roztworem przeciwciał. Minimalizuje to przenoszenie rozwiązań.
   4. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C, następnie przemyć 3X PBT (>15 minut/pranie) na tacy na platformie bujanej (upewnić się, że jest wystarczająco dużo PBT, aby szkiełko było zawsze całkowicie zanurzone podczas kołysania), ponownie zablokować zgodnie z powyższym opisem, dodać 200 μl przeciwciała drugorzędowego, inkubować 2 godziny w temperaturze pokojowej, ponownie przemyć PBT. W razie potrzeby sprawdzić barwienie (jeśli stosowana jest zielona fluorescencja) w zakresie preparacyjnym GFP.
   5. Przemyć 2X PBS (5'), następnie dodać 500 μl 70% glicerolu/1X PBS (otrzymanego przez zmieszanie 35 ml glicerolu, 5 ml 10X PBS i 10 ml wody w probówce o pojemności 50 ml) i klarować przez noc w temperaturze 4°C (lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej). Usuń glicerol i nałóż szkiełko nakrywkowe #1.

Dyskusja

Mamy nadzieję, że ta demonstracja wideo pokazała nasze metody sekcji i barwienia żywych zarodków na tyle szczegółowo, że mogą być teraz łatwo wykonane przez każdą osobę, która ma pewne doświadczenie w genetyce i embriologii Drosophila . Oczywiście, nadal wymagana będzie znaczna praktyka, przede wszystkim w przypadku samych sekcji. Z naszego doświadczenia wynika, że każda osoba, która nauczy się metod sekcji na żywo, stworzy subtelnie inny protokół sekcji, który pozwoli jej najszybciej wygenerować wysokiej jako...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki borokrzemianowe z filamentem	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Ściągacz igłowy Narishige model PC-10	Narishige International		Rurki ciągnięte przy użyciu poziomu grzałki 58,9