Przedstawiono bezsoczewkową obrazowanie i charakterystykę komórek na chipie. To podejście do obrazowania komórek na chipie zapewnia kompaktowe i kosztowo efektywne narzędzie do diagnostyki medycznej oraz wysokoprzepustowych zastosowań w biologii komórki, co czyni je szczególnie odpowiednim dla obszarów o ograniczonych zasobach.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konwencjonalne mikroskopy optyczne obrazują komórki za pomocą obiektywów, które współpracują z innymi soczewkami i komponentami optycznymi. Choć podejście to jest dość skuteczne, posiada pewne ograniczenia w zakresie miniaturyzacji platformy obrazowania, co utrudnia jej dostosowanie do zaawansowanego stanu techniki w mikrofluidyce. W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegóły eksperymentalne koncepcji bezsoczewkowego obrazowania na chipie, nazwanej LUCAS (LnieskończonyUultraszerokie pole widzeniaCmonitorowanie komórekAplatforma macierzowa oparta naSobrazowanie w ciemnym polu), które nie wymaga zastosowania żadnych obiektywów mikroskopowych ani innych masywnych komponentów optycznych do obrazowania heterogenicznej zawiesiny komórek w ultra-szerokim polu widzenia, które może osiągać rozmiar do ~18 cm2Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych mikroskopów, LUCAS umożliwia obrazowanie heterogenicznego roztworu komórek w interesie w głębi ostrości wynoszącej ~5 mm bez konieczności ponownego ustawiania ostrości, co odpowiada objętości próbki do ~9 mL. Ta platforma obrazowania rejestruje cienie (tj. bezsoczewkowe hologramy cyfrowe) każdej analizowanej komórki w polu widzenia, a zautomatyzowane cyfrowe przetwarzanie tych cieni pozwala określić typ, liczbę oraz względne położenie komórek w roztworze. Ponieważ system nie wymaga zastosowania rozbudowanych komponentów optycznych ani mechanicznych stołów skanujących, oferuje on znacznie zminiaturyzowaną platformę, co jednocześnie redukuje koszty, co jest szczególnie istotne w przypadku narzędzi diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care). Co więcej, przepustowość obrazowania tej platformy jest o rzędy wielkości większa niż w przypadku konwencjonalnych mikroskopów optycznych, co może być niezwykle cenne w wysokoprzepustowych eksperymentach z zakresu biologii komórki.
Protokół
W niniejszym materiale omawiamy procedury eksperymentalne stosowane w metodzie LUCAS [1-3]. Aby zilustrować dowód koncepcji LUCAS, opiszemy proces obrazowania dla próbki krwi pełnej.
A. Konfiguracja obrazowania
Platforma obrazowania LUCAS wykazuje istotne zalety, stanowiąc kosztowo efektywną i kompaktową alternatywę dla istniejących narzędzi diagnostyki medycznej i cytometrii w punkcie opieki (point-of-care), szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów. Zamiast wykrywania obrazu komórek, system LUCAS rejestruje cyfrowe hologramy komórek, które powstają w wyniku interferencji światła rozproszonego przez każdą komórkę ze światłem tła. Precyzyjna kontrola częściowej spójności przestrzennej oświetlenia jest kluczowa dla umożliwienia rejestracji holograficznej.
1. Cyfrowa macierz czujników
Platforma LUCAS wykorzystuje optoelektroniczną macierz czujników do cyfrowego rejestrowania hologramów poszczególnych komórek. W tym celu można zastosować urządzenia sprzężonego ładunku (CCD; przykładowe modele: KAI-11002, KAF-39000 firmy Kodak) lub chipy CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor, przykładowy model: MT9P031 firmy Micron). Rozmiary pikseli dla urządzeń CCD firmy Kodak (KAI-11002, KAF-39000) oraz czujników obrazu CMOS firmy Micron wynoszą odpowiednio 9 μm, 6.8 μm i 2.2 μm, przy aktywnym polu widzenia (FOV) wynoszącym odpowiednio 10 cm2, 18 cm2 i 24.4 mm2 [1-2].
2. Źródło światła
W przeciwieństwie do większości innych metod obrazowania mikroskopowego, system LUCAS nie wymaga użycia lasera, dzięki czemu do oświetlenia można wykorzystać nawet prostą diodę emitującą światło (LED). Aby umożliwić oświetlenie o regulowanej długości fali, można również zastosować monochromator z lampą ksenonową (Cornerstone T260, Newport Corp.) wraz ze standardowym światłowodem z topionego kwarcu, który składa się z wiązki włókien (77564, Newport) i otworu你说 (pinhole) o średnicy ~100 μm znajdującego się w odległości ~5-10 cm nad powierzchnią sensora. Ta konfiguracja oświetlenia o regulowanej długości fali zapewnia elastyczną platformę, na której można dostosować sygnatury holograficzne komórek oraz syntetyzować hybrydowe sygnatury cyfrowe w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, co pozwala na uzyskanie lepszej dokładności i swoistości charakterystyki. [3]
B. Przygotowanie próbek i obrazowanie
Koncepcja LUCAS oparta na obrazowaniu na chipie zostanie zademonstrowana przy użyciu roztworu heterogenicznego, zgodnie z opisem poniżej. Podobny protokół można zastosować dla różnych innych typów komórek [1-3].
1. Rozcieńczanie krwi pełnej i przygotowanie roztworu heterogenicznego
- Aby rozpocząć proces, należy pobrać próbkę krwi pełnej oraz polistyrenowe mikrokulki o różnych średnicach (5, 10 i 20 μm, Duke Scientific), a następnie doprowadzić wszystkie materiały do temperatury pokojowej.
- Do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 5 mL dodać 2 mL klasycznej pożywki płynnej RPMI 1640 (Fisher Scientific) jako rozcieńczalnik.
- Po inkubowaniu próbki krwi pełnej przez 30 minut, odpipetować 10 μL osadu erytrocytów i przenieść go do roztworu RPMI.
- Do rozcieńczenia erytrocytów w RPMI dodać łącznie 20 μL polistyrenowych mikrokulek, a następnie wymieszać zawiesinę komórkową poprzez delikatne pipetowanie lub przy użyciu mieszadła magnetycznego z mieszadełkiem.
- Na szkiełko nakrywkowe nanieść łącznie od 5 do 15 μL heterogenicznego roztworu, a następnie za pomocą pęsety nałożyć na niego drugie, identyczne szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna być równomiernie uwięziona pomiędzy dwoma szkiełkami.
- Następnie, używając próżniowego pióra (NT57-636, Edmund Optics), nanieść próbkę na obszar aktywny macierzy czujników w celu obrazowania.
2. Barwienie krwi pełnej
- Rozpocznij od przygotowania mieszaniny 0,1% buforowanej eozyny Y oraz rozcieńczonego roztworu nowego błękitu metylenowego, wykorzystując czystą eozynę Y w proszku (MW=691.85, Acros Organics), czysty barwnik nowy błękit metylenowy bez zawartości cynku (MW=347.90, Acros Organics) oraz monohydrat szczawianu potasu (99.0% Reagent ACS, Acros Organics); każdy roztwór należy przefiltrować przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm (Whatman) do barwienia leukocytów w próbkach wodnych.
- Następnie delikatnie wymieszaj rozpuszczony wodny odczyn barwiący z próbką krwi pełnej w stosunku objętościowym 1:1 w zlewce polipropylenowej za pomocą mieszadła magnetycznego przez 2 minuty, a następnie inkubuj przez 10 minut.
- Przenieś 50 μL zbarwionego roztworu krwi do polipropylenowej probówki o pojemności 5 mL i rozcieńcz 1,95 mL klasycznego roztworu RPMI 1640 (Fisher Scientific), aby uzyskać stosunek objętościowy 1:200. Następnie mieszaj rozcieńczenie w wortexie przez 30 sekund. Na tym etapie można zastosować inny stopień rozcieńczenia.
- Nanieś pipetą 10-100 μL roztworu zbarwionych komórek pomiędzy szkiełka nakrywkowe lub do zbiornika mikroprzepływowego. Następnie, używając pióra próżniowego (NT57-636, Edmund Optics), umieść próbkę na obszarze aktywnym matrycy czujników.
REPREZENTATYWNE WYNIKI
Rycina 1: LUCAS umożliwia dokładne zliczanie i cyfrową różnicację różnych komórek i mikroobiektów na podstawie ich dwuwymiarowych sygnatur holograficznych bez użycia soczewek, laserów ani innych rozbudowanych komponentów optycznych. Na tej rycinie przedstawiono charakterystyczne sygnatury LUCAS różnych mikroobiektów i porównano je z konwencjonalnym obrazem mikroskopowym uzyskanym za pomocą obiektywu 40X. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
Rysunek 2: (Lewo) Surowy obraz heterogenicznej mieszaniny zawierającej erytrocyty oraz cząstki o rozmiarach 10 µm, 5 µm i 3 µm. (Prawo) Przedstawiono w pełni zautomatyzowane wyniki charakterystyki LUCAS dla tego samego pola widzenia. Należy zauważyć, że algorytm decyzyjny jest skuteczny w charakteryzowaniu obszarów o wysokiej gęstości, jak również cząstek o niskim stosunku sygnału do szumu, takich jak kule 3 µm.
Rycina 3: Przedstawiono niestandardowy interfejs LUCAS. Oprogramowanie LUCAS oparte na języku Java umożliwia wprowadzanie parametrów dla różnych warunków eksperymentalnych, takich jak rozmiar piksela sensora czy długość fali światła. Możliwy jest również wybór konkretnego pola widzenia na obrazie, a użytkownik może zdefiniować wzorce komórek docelowych w celu budowy statystycznej biblioteki cieni komórkowych. Uzyskany obraz z systemu LUCAS może następnie zostać scharakteryzowany na podstawie tych danych treningowych (tj. biblioteki cieni komórkowych), a użytkownikowi wyświetlany jest obraz z zaznaczonymi (policzonymi) obiektami. Statystyki z wyników zliczania są również zapisywane w pliku XML do dalszej analizy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykazaliśmy, że platforma LUCAS potrafi precyzyjnie zliczać i identyfikować różne mikroobiekty/komórki na chipie na podstawie ich sygnatur holograficznych, stanowiąc obiecujące narzędzie dla diagnostyki medycznej w punkcie opieki (point-of-care) oraz wysokoprzepustowej biologii komórki. W celu dokładnego przetwarzania zarejestrowanych wzorów holograficznych wdrożyliśmy dedykowane oprogramowanie decyzyjne LUCAS. Algorytm ten, wykorzystujący statystyczną bazę danych obrazów dyfrakcyjnych utworzoną poprzez trenowanie obrazó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Urządzenie o ładunku sprzężonym (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Urządzenie o ładunku sprzężonym (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Lampa ksenonowa | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Próżniowy chwytak (Vacuum pen) | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| Mikrokule 5, 10 i 20 μm | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Czysta eozyna Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| Barwnik Nowy Błękit Metylenowy (NMB) | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Szczawian potasu monohydrat | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
Bibliografia
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie