Przedstawiono bezsoczewkową obrazowanie i charakterystykę komórek na chipie. To podejście do obrazowania komórek na chipie zapewnia kompaktowe i kosztowo efektywne narzędzie do diagnostyki medycznej oraz wysokoprzepustowych zastosowań w biologii komórki, co czyni je szczególnie odpowiednim dla obszarów o ograniczonych zasobach.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konwencjonalne mikroskopy optyczne obrazują komórki za pomocą obiektywów, które współpracują z innymi soczewkami i komponentami optycznymi. Choć podejście to jest dość skuteczne, posiada pewne ograniczenia w zakresie miniaturyzacji platformy obrazowania, co utrudnia jej dostosowanie do zaawansowanego stanu techniki w mikrofluidyce. W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegóły eksperymentalne koncepcji bezsoczewkowego obrazowania na chipie, nazwanej LUCAS (LnieskończonyUultraszerokie pole widzeniaCmonitorowanie komórekAplatforma macierzowa oparta naSobrazowanie w ciemnym polu), które nie wymaga zastosowania żadnych obiektywów mikroskopowych ani innych masywnych komponentów optycznych do obrazowania heterogenicznej zawiesiny komórek w ultra-szerokim polu widzenia, które może osiągać rozmiar do ~18 cm2Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych mikroskopów, LUCAS umożliwia obrazowanie heterogenicznego roztworu komórek w interesie w głębi ostrości wynoszącej ~5 mm bez konieczności ponownego ustawiania ostrości, co odpowiada objętości próbki do ~9 mL. Ta platforma obrazowania rejestruje cienie (tj. bezsoczewkowe hologramy cyfrowe) każdej analizowanej komórki w polu widzenia, a zautomatyzowane cyfrowe przetwarzanie tych cieni pozwala określić typ, liczbę oraz względne położenie komórek w roztworze. Ponieważ system nie wymaga zastosowania rozbudowanych komponentów optycznych ani mechanicznych stołów skanujących, oferuje on znacznie zminiaturyzowaną platformę, co jednocześnie redukuje koszty, co jest szczególnie istotne w przypadku narzędzi diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care). Co więcej, przepustowość obrazowania tej platformy jest o rzędy wielkości większa niż w przypadku konwencjonalnych mikroskopów optycznych, co może być niezwykle cenne w wysokoprzepustowych eksperymentach z zakresu biologii komórki.
Protokół
W niniejszym rozdziale omawiamy procedury eksperymentalne stosowane w metodzie LUCAS [1-3]. Aby zilustrować dowód koncepcji (proof of concept) metody LUCAS, opiszemy proces obrazowania dla próbki krwi pełnej.
A. Konfiguracja obrazowania
Platforma obrazowania LUCAS wykazuje istotne zalety, stanowiąc kostuktywną i kompaktową alternatywę dla istniejących narzędzi do diagnostyki medycznej i cytometrii w miejscu opieki nad pacjentem (point-of-care), szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów. Zamiast wykrywać obraz komórek, system LUCAS rejestruje cyfrowe hologramy komórek, które powstają w wyniku interferencji światła rozproszonego przez każdą komórkę ze światłem tła. Precyzyjna kontrola częściowej spójności przestrzennej oświetlenia jest kluczowa dla umożliwienia zapisu holograficznego.
1. Cyfrowa matryca czujników
Platforma LUCAS wykorzystuje optoelektroniczny układ czujników do cyfrowego rejestrowania hologramów poszczególnych komórek. W tym celu można zastosować urządzenia sprzężonego ładunku (CCD; przykładowe modele: KAI-11002, KAF-39000, firmy Kodak) lub układy CMOS (komplementarne półprzewodniki tlenku metalu, przykładowy model: MT9P031, Micron). Wielkości pikseli dla urządzeń CCD firmy Kodak (KAI-11002, KAF-39000) oraz czujników obrazu CMOS firmy Micron wynoszą odpowiednio 9 μm, 6.8 μm i 2.2 μm, przy aktywnym polu widzenia (FOV) wynoszącym 10 cm2, 18 cm2 i 24.4 mm2 [1-2].
2. Źródło światła
W przeciwieństwie do większości innych metod obrazowania mikroskopowego, LUCAS nie wymaga użycia lasera, zatem do oświetlenia można wykorzystać nawet prostą diodę elektroluminescencyjną (LED). Aby umożliwić oświetlanie o regulowanej długości fali, można również zastosować monochromator z lampą ksenonową (Cornerstone T260, Newport Corp.) wraz ze standardowym światłowodem z topionego kwarcu, składającym się z wiązki włókien (77564, Newport), oraz otworem otworkowym o średnicy ~100 μm umieszczonym ok. 5-10 cm nad powierzchnią sensora. Ta konfiguracja oświetlenia o regulowanej długości fali stanowi elastyczną platformę, na której można dostosować sygnatury holograficzne komórek oraz syntetyzować hybrydowe sygnatury cyfrowe w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, co pozwala na uzyskanie lepszej dokładności i specyficzności charakterystyki. [3]
B. Przygotowanie próbek i obrazowanie
Koncepcja LUCAS oparta na obrazowaniu na chipie zostanie zademonstrowana przy użyciu roztworu heterogenicznego, zgodnie z opisem poniżej. Podobny protokół można zastosować dla różnych innych typów komórek [1-3].
1. Rozcieńczanie krwi pełnej i przygotowanie roztworu heterogenicznego
- Aby rozpocząć proces, należy pobrać próbkę krwi pełnej oraz polistyrenowe mikrokulki o różnych średnicach (5, 10 i 20 μm, Duke Scientific) i doprowadzić je do temperatury pokojowej.
- Do sterylnej probówki z polipropylenu o pojemności 5 mL należy dodać 2 mL klasycznej pożywki ciekłej RPMI 1640 (Fisher Scientific) jako rozcieńczalnik.
- Po inkubowaniu próbki krwi pełnej przez 30 minut, należy pobrać pipetą 10 μL osadu erytrocytów i przenieść go do roztworu RPMI.
- Do rozcieńczenia erytrocytów w RPMI należy dodać łącznie 20 μL polistyrenowych mikrokulek, a następnie wymieszać zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując lub korzystając z mieszadła magnetycznego z mieszadełkiem.
- Na szkiełko nakrywkowe należy nanieść łącznie 5-15 μL heterogenicznego roztworu, a następnie przy pomocy pęsety nałożyć na niego drugie, identyczne szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna znajdować się równomiernie pomiędzy dwoma szkiełkami.
- Następnie, używając pióra próżniowego (NT57-636, Edmund Optics), należy nanieść próbkę na obszar aktywny matrycy czujnika w celu obrazowania.
2. Barwienie krwi pełnej
- Rozpocznij od przygotowania mieszaniny 0,1% buforowanej eozyny Y oraz rozcieńczonego roztworu błękitu metylenowego, wykorzystując czystą eozynę Y w formie proszku (MW=691.85, Acros Organics), czysty barwnik błękit metylenowy bez zawartości cynku (MW=347.90, Acros Organics) oraz monohydrat szczawianu potasu (99.0% Reagent ACS, Acros Organics); każdy roztwór należy oczyścić za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze porów 0,45 μm (Whatman) do wodnego barwienia leukocytów.
- Następnie delikatnie wymieszaj rozpuszczony wodny odczynnik barwiący z próbką krwi pełnej w stosunku objętościowym 1:1 w zlewce polipropylenowej, używając mieszadła magnetycznego przez 2 minuty, a następnie inkubuj przez 10 minut.
- Przenieś 50 μL zbarwionego roztworu krwi do polipropylenowej probówki o pojemności 5 mL i rozcieńcz 1,95 mL klasycznym roztworem płynnym RPMI 1640 (Fisher Scientific), aby uzyskać stosunek objętościowy 1:200. Następnie mieszaj rozcieńczenie w wortexie przez 30 sekund. Na tym etapie można zastosować inny stopień rozcieńczenia.
- Pipetuj 10-100 μL roztworu zbarwionych komórek pomiędzy szkiełka podstawowe lub do zbiornika mikrofluidycznego. Następnie, używając pióra próżniowego (NT57-636, Edmund Optics), umieść próbkę na obszarze aktywnym macierzy czujników.
REPREZENTATYWNE WYNIKI
Rycina 1: LUCAS umożliwia dokładne zliczanie i cyfrową różnicację różnych komórek oraz mikroobiektów na podstawie ich dwuwymiarowych sygnatur holograficznych bez użycia soczewek, laserów czy innych nieporęcznych komponentów optycznych. Na rycini przedstawiono charakterystyczne sygnatury LUCAS dla różnych mikroobiektów i zestawiono je z konwencjonalnym obrazem mikroskopowym uzyskanym za pomocą obiektywu 40X. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
Rycina 2: (Lewo) Surowy obraz heterogenicznej mieszaniny zawierającej erytrocyty oraz cząstki o rozmiarach 10um, 5um i 3um. (Prawo) Przedstawiono w pełni zautomatyzowane wyniki charakterystyki LUCAS dla tego samego pola widzenia. Należy zauważyć, że algorytm decyzyjny skutecznie charakteryzuje obszary o wysokiej gęstości, a także cząstki o niskim stosunku sygnału do szumu, takie jak kuleczki 3um.
Rysunek 3: Przedstawiono niestandardowy interfejs programu LUCAS. Oprogramowanie LUCAS oparte na języku Java umożliwia wprowadzanie różnych warunków eksperymentalnych, takich jak rozmiar piksela sensora lub długość fali światła. Możliwy jest również wybór konkretnego pola widzenia na obrazie, a użytkownik może zdefiniować wzorce komórek docelowych w celu zbudowania statystycznej biblioteki cieni komórkowych. Uzyskany obraz z systemu LUCAS może być następnie charakteryzowany na podstawie tych danych treningowych (tj. biblioteki cieni komórkowych), a użytkownikowi wyświetlany jest obraz z zaznaczonymi (policzonymi) obiektami. Statystyki wyników zliczania są również zapisywane w pliku XML do dalszej analizy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykazaliśmy, że platforma LUCAS potrafi precyzyjnie zliczać i identyfikować różne mikroobiekty/komórki na chipie na podstawie ich sygnatur holograficznych, stanowiąc obiecujące narzędzie dla diagnostyki medycznej w punkcie opieki (point-of-care) oraz wysokoprzepustowej biologii komórki. W celu dokładnego przetwarzania zarejestrowanych wzorów holograficznych wdrożyliśmy dedykowane oprogramowanie decyzyjne LUCAS. Algorytm ten, wykorzystujący statystyczną bazę danych obrazów dyfrakcyjnych utworzoną poprzez trenowanie obrazó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Urządzenie o ładunku sprzężonym (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Urządzenie o ładunku sprzężonym (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Lampa ksenonowa | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Próżniowy chwytak (Vacuum pen) | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| Mikrokule 5, 10 i 20 μm | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Czysta eozyna Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| Barwnik Nowy Błękit Metylenowy (NMB) | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Szczawian potasu monohydrat | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
Bibliografia
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie