Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Podsumowanie

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Streszczenie

Fotoreceptory pręcikowe i czopkowe w siatkówce są odpowiedzialne za detekcję światła. W ciemności kanały sterowane cyklicznymi nukleotydami (CNG) w segmencie zewnętrznym pozostają otwarte, co umożliwia stały napływ kationów przez błonę, prowadząc do depolaryzacji komórki. Ekspozycja na światło wywołuje zamknięcie kanałów CNG, co blokuje dopływ kationów i w konsekwencji prowadzi do hiperpolaryzacji komórki. Wykorzystując polarność fotoreceptorów, w latach 70. opracowano metodę rejestracji ssącej, która w przeciwieństwie do klasycznej techniki patch-clamp nie wymaga penetracji błony plazmatycznej.¹Wciągnięcie segmentu zewnętrznego do ściśle dopasowanej szklanej pipety wypełnionej roztworem pozakomórkowym umożliwia rejestrację zmian prądu w pojedynczych komórkach po naświetleniu błyskiem testowym. Jednak ta dobrze ugruntowana metoda rejestracji ssącej z segmentem zewnętrznym wewnątrz (OS-in) nie nadaje się do rejestracji z czopków mysich ze względu na niski odsetek czopków w siatkówce myszy (3%) oraz trudności w identyfikacji segmentów zewnętrznych czopków. Niedawno opracowano konfigurację rejestracji z segmentem wewnętrznym wewnątrz (IS-in), aby wciągnąć segment wewnętrzny/obszar jądrowy fotoreceptora do pipety rejestrującej.^2,3W tym filmie pokażemy, jak rejestrować odpowiedzi świetlne pojedynczych czopków myszy przy użyciu ssącej elektrody jednokomórkowej.

Protokół

Wykonanie elektrod

1. Wykonaj elektrody rejestrujące za pomocą wyciągarki do mikropipet i wypoleruj je za pomocą włókna grzewczego pod mikroskopem. Dla rejestracji z zasysaniem pojedynczych komórek czopkowych myszy średnica wewnętrzna końcówki elektrody powinna wynosić około 6-7 μm.
2. Przygotuj elektrody odniesienia. Odważ 1% agar w wodzie destylowanej. Rozpuść roztwór agaru w łaźni wodnej. Wypełnij pipety szklane (L = 100 mm, OD/ID = 1/0.75 mm) 1% agarem za pomocą strzykawki. Pozostaw agar do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Przetnij pipety na pół za pomocą noża diamentowego.
4. Namocz elektrody odniesienia w roztworze odniesienia przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C.

Przygotowanie eksperymentu

5. Poddać mysz adaptacji do ciemności w czarnej klatce przez noc.
6. Przygotować 100 mL roztworu referencyjnego oraz 1 L roztworu perfuzyjnego (patrz poniżej), a następnie przefiltrować roztwór.
7. Rozpuścić 0,1% BSA oraz 10 mM glukozy w 20 mL roztworu referencyjnego.
8. Zkalibrować natężenie światła stymulatora optycznego za pomocą fotometru.
9. Zamocować komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu odwróconego.
10. Napowietrzyć roztwór perfuzyjny mieszanką 95% O₂/5% CO₂ i inkubować go w kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C, aby zwiększyć rozpuszczalność CO₂. Roztwór przepływa z butelki do komory rejestracyjnej przez ceramiczny rezystor grzejny, który ogrzewa go do 36-38 °C. Grzejnik powinien znajdować się jak najbliżej komory rejestracyjnej, idealnie na stoliku mikroskopu.
11. Ustawić regulator przepływu na wartość około 1-1,5 mL/min.
12. Napełnić elektrodę rejestrującą roztworem referencyjnym. Umieścić elektrodę w uchwycie do elektrod. Upewnić się, że w elektrodzie nie ma pęcherzyków powietrza. Zamocować uchwyt na przedwzmacniaczu (headstage) wzmacniacza. Podłączyć uchwyt do urządzenia ssącego, zbudowanego poprzez połączenie rurki częściowo wypełnionej olejem mineralnym z portem bocznym uchwytu elektrody. Drugi koniec rurki jest połączony z małym zbiorniczkiem oleju mineralnego, do którego można przyłożyć ciśnienie ustami.
13. Podłączyć elektrodę referencyjną do drugiego bieguna przedwzmacniacza. Przymocować termoparę (TC) do elektrody referencyjnej. Upewnić się, że końcówki elektrody i termopary znajdują się blisko siebie, aby pomiar temperatury odbywał się jak najbliżej komórki.
14. Włączyć podświetlenie podczerwienią, aby zwizualizować elektrodę. Elektrodę obserwuje się za pomocą kamery podczerwieni podłączonej do monitora. Wycentrować obraz elektrody w polu widzenia monitora za pomocą mikromanipulatora.
15. Ustawić końcówkę elektrody referencyjnej blisko (2-4 mm) końcówki elektrody rejestrującej.
16. Dostosować napięcie DC grzałki tak, aby temperatura roztworu wynosiła około 36-38 °C.
17. Przeprowadzić test szczelności (seal test), aby sprawdzić oporność elektrody rejestrującej, która normalnie wynosi około 900 kΩ.

Izolacja siatkówki mysiej

18. W słabym czerwonym świetle uśmierć mysz zaadaptowaną do ciemności za pomocą CO₂ i zwichnięcia szyjnego. Zaznacz gałki oczne, lekko przypalając najbardziej grzbietowy punkt twardówki końcówką rozgrzanej metalowej wypalarki. Wyciśnij gałki oczne za pomocą nożyczek. Wszystkie kolejne procedury wykonuje się w świetle podczerwonym.
19. Przecięcie gałek ocznych na pół wykonaj pod mikroskopem z oświetleniem podczerwonym i konwerterami obrazu.
20. Usuń rogówkę i soczewkę. Usuń jak największą ilość ciała szklistego.
21. Aby zarejestrować odpowiedzi czopków typu M, usuń brzuszną część oczodołu ⁴ za pomocą żyletki, orientując się na podstawie znaku wypalenia.
22. Oddziel siatkówkę od warstwy nabłonka pigmentowego.
23. Rozprostuj siatkówkę i umieść ją na dnie szalki Petriego wypełnionej 1-2 mL roztworu referencyjnego.
24. Pokrój siatkówkę na małe, cienkie kawałki za pomocą żyletki i inkubuj preparat w szczelnym pudełku odpornym na światło, nasyconym czystym tlenem.

Nagrania

25. Wyłączyć tymczasowo podgrzewacz. Przekierować przepływ perfuzyjny do przewodu obejściowego, aby zapobiec wyschnięciu komory.
26. Odessać większość roztworu z komory za pomocą chusteczki Kimwipe. Przenieść zawiesinę siatkówki do komory rejestracyjnej przy użyciu szklanej pipety.
27. Odczekać około 2 minut, aż skrawki siatkówki osiądą. Przywrócić perfuzję. Włączyć podgrzewacz.
28. Włączyć oświetlenie podczerwone, aby zwizualizować preparat. Odnaleźć fragment siatkówki leżący w komorze, w którym zewnętrzne segmenty fotoreceptorów wystają na zewnątrz (patrz rycina przykładu). Delikatnie wciągnąć segmenty wewnętrzne do elektrody za pomocą ssania. W tej konfiguracji do elektrody powinny zostać wciągnięte kilka jąder oraz segmenty wewnętrzne. Zarejestrować odpowiedź na jasny błysk, aby sprawdzić, czy w elektrodzie znajduje się segment wewnętrzny czopka oraz czy komórka jest zdrowa, oceniając to po kinetyce i amplitudzie odpowiedzi.
29. Obniżyć rezerwuar mineralny, aby przyłożyć lekkie podciśnienie do końcówki elektrody, co pomoże utrzymać segment wewnętrzny w elektrodzie.
30. Po znalezieniu odpowiedniej komórki zarejestrować odpowiedzi na błyski testowe o natężeniu od słabego do silnego. Błyski testowe są generowane przez skalibrowany stymulator optyczny ⁵. Natężenie błysku i długość fali są kontrolowane odpowiednio przez zestaw filtrów neutralnych oraz filtrów interferencyjnych wąskopasmowych. Czas trwania błysku testowego (20 ms) jest kontrolowany przez sterowane komputerowo migawki.

Roztwory

1. Roztwór do perfuzji myszy: 112.5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl₂, 1.2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES (pH 7.4), 20 mM NaHCO₃, 3 mM bursztynianu sodu, 0.5 mM glutaminianu sodu, 0.02 mM EDTA oraz 10 mM glukozy.
2. Roztwór do elektrody rejestrującej u myszy: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl₂, 1.2 mM CaCl₂, 3 mM HEPES (pH 7.4), 0.02 mM EDTA.

Dyskusja

Metoda rejestracji prądów za pomocą ssania pojedynczej komórki z fotoreceptorów została opracowana 3 dekady temu. Umożliwia ona rejestrację zmian prądu błonowego indukowanych stymulacją świetlną bez penetrowania błony komórkowej. Ze względu na silną adhezję międzykomórkową, izolacja zdrowych pojedynczych pręcików i czopków z siatkówki myszy jest trudniejsza niż w przypadku siatkówki płazów, a odnalezienie poszczególnych czopków jest utrudnione z powodu ich niskiego odsetka (3%) i niewielkiego rozmiaru. Metoda rejestracji...