Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Podsumowanie

Koncepcja, wykonanie i walidacja platformy dodatkowej, która zapewnia zwiększoną kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie jest dostosowane do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie ran.

Streszczenie

Tlen jest kluczowym modulatorem wielu szlaków komórkowych, jednak obecne urządzenia umożliwiającein vitromodulacja poziomu tlenu nie spełnia potrzeb badawczych w dziedzinie biomedycyny. Komora hipoksyczna oferuje prosty system kontroli natlenienia w standardowych naczyniach hodowlanych, ale brakuje w niej precyzyjnej kontroli czasowej i przestrzennej nad stężeniem tlenu na powierzchni komórek, co uniemożliwia jej zastosowanie w badaniu wielu zjawisk fizjologicznych. Inne systemy usprawniły działanie komory hipoksycznej, lecz wymagają one specjalistycznej wiedzy i sprzętu do obsługi, co czyni je onieślającymi dla przeciętnego badacza. Opracowano mikrofabrykowaną wkładkę do płytek wielodotykowych, która pozwala na skuteczniejszą kontrolę czasową i przestrzenną stężenia tlenu, aby lepiej modelować występujące zjawiska fizjologicznein vivoPlatforma składa się z wkładki z polidimetylosiloksanu, która jest osadzona w standardowej płytce wielodobowej i służy jako pasywna mikrofluidyczna sieć gazowa z membraną przepuszczalną dla gazów, mającą na celu modulowanie dostarczania tlenu do komórek adherentnych. Urządzenie jest proste w obsłudze i podłączone do butli z gazem, które zapewniają ciśnienie niezbędne do wprowadzenia pożądanej koncentracji tlenu do platformy. Produkcja obejmuje kombinację standardowej fotolitografii SU-8, odlewania replikacyjnego oraz precyzyjnego nanoszenia PDMS metodą spin-coatingu na waflu krzemowym. Komponenty urządzenia są łączone po obróbce powierzchniowej przy użyciu ręcznego systemu plazmowego. Walidację przeprowadzono za pomocą płaskiego fluorescencyjnego czujnika tlenu. Czas równoważenia wynosi od kilku minut, a dzięki konstrukcji urządzenia można uzyskać szeroką gamę profili tlenowych, takich jak profil cykliczny osiągnięty w niniejszym badaniu, a nawet gradienty tlenu naśladujące te występującein vivoUrządzenie można sterylizować do hodowli komórkowych za pomocą powszechnych metod bez utraty funkcjonalności. Możliwość zastosowania urządzenia do badaniain vitroreakcja gojenia rany zostanie zaprezentowana.

Protokół

1. Funkcja urządzenia

1. Urządzenie z wkładką hipoksyczną zawiera 6 filarów, które mieszczą się w standardowej płytce 6-dołkowej. Gaz wpływa do filara, przepływa przez sieć mikrofluidyczną u podstawy filara, a następnie wypływa z urządzenia. U podstawy filara, tworząc dolną ściankę mikrokanału, znajduje się przepuszczalna dla gazów membrana PDMS o grubości 100 μm, która umożliwia dyfuzję tlenu między mikrokanałem gazowym a pożywką hodowlaną. W ten sposób urządzenie działa poprzez wytworzenie gradientu stężeń, który dąży do osiągnięcia pożądanej wartości stężenia tlenu w pożywce.
2. Urządzenie oferuje szereg zalet w porównaniu z komorą hipoksyczną i innymi systemami natleniania komórek: 1) minimalizuje drogę dyfuzji tlenu, co pozwala na szybszą kontrolę czasową, 2) zwiększa przestrzenną kontrolę nad natlenianiem, w zależności od konstrukcji mikrokanału filara, 3) zajmuje mniej miejsca w laboratorium i charakteryzuje się wyższą przepustowością, co zwiększa efektywność eksperymentów, oraz 4) jest dostosowane do powszechnie stosowanych narzędzi do hodowli komórek (np. płytek wielodołkowych) bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy i sprzętu.

2. Wytwarzanie urządzenia

1. W pierwszej kolejności macierz filarów jest odlewana metodą replikacji z PDMS w uprzednio wykonanej formie z Delranu.
2. Następnie mikrokanał gazowy u podstawy każdego filara jest wytwarzany przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8 oraz odlewania replik z PDMS.
3. Membrana przepuszczalna dla gazów jest wytwarzana poprzez kontrolowane wirowanie PDMS na waflu krzemowym w celu uzyskania pożądanej grubości. W tym przykładzie zastosowano membranę o grubości 100 μm, wykonaną poprzez wirowanie z prędkością 500 rpm przez 10 sekund, a następnie 900 rpm przez 30 sekund.
4. Wszystkie komponenty są ze sobą łączone po obróbce plazmą tlenową za pomocą ręcznego urządzenia plazmowego (Model BD-20, Electro-Technic Products).

3. Konfiguracja urządzenia

1. Ostrożnie wsuń urządzenie do płytki, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Wprowadzanie urządzenia pod kątem pomaga wypchnąć pęcherzyki jedną z jego stron. W przypadku rzeczywistych eksperymentów z komórkami ten etap musi być wykonany w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ryzyko kontaminacji jest znacznie mniejsze po włożeniu urządzenia, więc zestaw można przenieść do inkubatora w środowisku niesterylnym.
2. Podłącz przewody z butli z gazem źródłowym do portów wlotowego i wylotowego urządzenia. W eksperymentach z komórkami inkubator powinien posiadać otwór umożliwiający wprowadzenie przewodów, a podłączenie powinno nastąpić po przeniesieniu urządzenia i umieszczeniu go w inkubatorze. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby doprowadzić do odkształcenia PDMS i zmiażdżenia znajdujących się pod nim komórek.
3. Przed otwarciem regulatora na butli upewnij się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty, aby zapobiec przelaniu treści z urządzenia. Uruchom przepływ gazu. Powoli otwórz precyzyjny regulator przepływu do pożądanego natężenia (50-100 mL/min). Przez kolejną godzinę uważnie obserwuj wartość i w razie potrzeby dokonuj korekt, ponieważ spadek ciśnienia zmieni się podczas stabilizacji systemu, co wpłynie na natężenie przepływu. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w medium, po początkowym 15-minutowym okresie stabilizacji przy wyższym przepływie zredukuj natężenie przepływu do poziomu 10-20 mL/min.
4. Po upływie pożądanego czasu trwania eksperymentu zatrzymaj przepływ gazu, wyjmij płytkę i przetraktuj komórki zgodnie z procedurą (np. lizacja, barwienie, liczenie itp.).

4. Walidacja urządzenia

1. Kalibracja
   1. Wybierz liczbę i położenie punktów na szkiełku z fluorescencyjnym czujnikiem tlenu
      (FOXY), które zostaną wykorzystane do pomiaru tlenu (zależnie od wymogów walidacji). Szkiełko pokryte jest fluorescencyjnym barwnikiem rutenowym, który ulega wygaszeniu w obecności tlenu.
   2. Naraź szkiełko bezpośrednio na działanie tlenu o stężeniu 0, 10 i 21% z butli z gazem i wykonaj zdjęcia po 5 minutach w celu zapewnienia odpowiedniej równowagi.
   3. Wyeksportuj średnią intensywność obrazu dla każdego punktu i nanieś na wykres stężenie tlenu w zależności od intensywności fluorescencji.
   4. Wygeneruj krzywą kalibracyjną poprzez dopasowanie krzywych liniowych do odcinka 0-10% oraz odcinka 10-21%.
2. Heterogeniczność
   1. Wyznacz wiele punktów obejmujących szerokość kanału w określonych odstępach (np. co 1 mm). Należy pamiętać, że w zależności od rozstawu może dojść do nakładania się obrazów.
   2. Zmierz stężenie tlenu na powierzchni studzienki w całym urządzeniu.
3. Równoważenie
   1. Wybierz trzy punkty na szkiełku FOXY, w których mierzona będzie koncentracja tlenu.
   2. Bezpośrednio po wykonaniu pierwszego zdjęcia przy poziomie tlenu otoczenia otwórz precyzyjny regulator przepływu, aby rozpocząć dopływ gazu do urządzenia. Wykonuj zdjęcia w odpowiednich odstępach czasu, aby ocenić czas trwania i zakres równoważenia stężenia tlenu (np. co 10 sekund przez 30 min).

5. Zastosowania

1. Gojenie ran
   1. Dzień przed eksperymentem namocz sterylną wkładkę z PDMS w medium bezsurowiczym, aby ograniczyć powstawanie pęcherzyków gazu w dołku.
   2. Hoduj komórki do osiągnięcia 100% konfluencji w płytce 6-dołkowej.
   3. Wykonaj proste zadrapania w monowarstwach za pomocą końcówki pipety p200, aby zasymulować rany.
   4. Odsącz medium komórkowe, przepłucz 5 mL medium i ponownie odsącz. Ważne jest, aby nie zakłócić monowarstwy komórek.
   5. Wypełnij dołki 4 mL medium bezsurowiczego, aby ograniczyć proliferację komórek.
   6. Umieść wkładki w dołkach i podłącz każdy dołek do odpowiadającego mu stężenia tlenu.
   7. Umieść płytkę 6-dołkową z wkładkami na podgrzewanym stoliku w temperaturze 37°C.
   8. Wykonaj zdjęcia time-lapse komórek w pożądanym odstępie czasu i przez całkowity czas trwania eksperymentu. Do analizy niezagojonej powierzchni można wykorzystać algorytm pomiaru ran T_Scratch w programie MATLAB.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Walidacja urządzenia
   Urządzenie z wkładką hipoksyczną wykazuje znaczną poprawę w stosunku do komory hipoksycznej pod względem czasu i stopnia wyrównania poziomu tlenu, wymagając mniej niż 2 minut dla stabilizacji na poziomie 0,5% tlenu. Wielkość szczeliny między membraną urządzenia a dnem studzienki była kluczowym czynnikiem determinującym wydajność wyrównywania, przy czym większe szczeliny wymagały więcej czasu do osiągnięcia stanu stacjonarnego stężeń tlenu. Urządzenie umożliwia również dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w pojedynczej studzience, co pozwala na tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu tlenowego na powierzchni studzienki.
2. Gojenie ran
   Monowarstwy komórkowe poddano działaniu 10% lub 21% tlenu, a następnie analizowano w czasie powierzchnię rany. Zadrapania wystawione na 21% tlenu zamykały się najwolniej, a te przy 10% – najszybciej. Rycina 1 przedstawia obrazy zadrapania w ciągu 17 godzin. Wykresy na Rycini 5 pokazują procent otwartej powierzchni rany dla obu stężeń tlenu przez cały czas trwania eksperymentu.

Rycina 1. Schematy i diagramy przedstawiające cechy urządzenia. Urządzenie z wkładem tlenowym zostało wykonane za pomocą konwencjonalnej fotolitografii (sieć mikroprzepływowa), odlewania z repliką (sieć mikroprzepływowa i rusztowanie wkładu) oraz precyzyjnego wirowania PDMS (membrana przepuszczalna dla gazów). A) Urządzenie tlenowe umieszczone w płytce 6-dołkowej. B) Przykłady macierzy filarów dla płytek 24- i 96-dołkowych. C) Schemat przekroju poprzecznego filara. Tlen wpływa do urządzenia przez wlot i przepływa przez sieć mikroprzepływową u podstawy filara. Tlen może swobodnie dyfundować przez przepuszczalną dla gazów membranę PDMS na dnie filara i rozpuszczać się w pożywce hodowlanej. D) Obraz mikroskopowy przedstawiający z góry poszczególne cechy filara jednokanałowego, z przyklejonymi szklanymi wspornikami do badań równowagowych.

Rysunek 2. Walidacja urządzenia za pomocą czujników tlenu. Napięcie tlenu w każdym dołku scharakteryzowano przy użyciu planarnego rutenowego czujnika tlenu. Wszystkie mieszaniny tlenowe zawierały azot jako gaz bilansujący oraz 5% CO₂ w celu buforowania pożywki. A) Wykres obrazujący wpływ wysokości słupka, a tym samym odległości dyfuzji tlenu między membraną a komórkami, na czas i skuteczność wyrównywania stężeń. Wysokości ustalono za pomocą szklanych słupków przymocowanych do dna urządzenia. Wszystkie trzy rozmiary słupków zapewniają czasy wyrównywania znacznie krótsze niż w komorze hipoksyjnej. Należy zwrócić uwagę, że czas przedstawiono w skali logarytmicznej. B) Wykres przedstawiający szybki czas odpowiedzi wyrównywania tlenu w urządzeniu ze szczeliną 0,2 mm. C) Wykonano również wielopozycyjne skany liniowe w obrębie dołka pod mikrokanałem, aby zapewnić jednorodność stężenia tlenu wprowadzanego przez urządzenie. Wykres przedstawia stężenie tlenu zmierzone po infuzji 0%, 10% i 21% tlenu przez 10 min. D) Urządzenie skutecznie utrzymuje 10% tlenu przez 5 dni.

Rysunek 3. Eksperymenty z bardziej złożonymi projektami mikrokanałów tlenowych. A) Układ mikrokanałów o dwóch warunkach zapewnia stabilny profil tlenowy 0% i 21% przez 14 dni. B) Przeplatany i kręty wzór mikrokanałów o szerokości 500 μm rozciągających się przez filar skutkuje cyklicznym profilem tlenowym. Należy zauważyć, że dane przedstawiają tylko jedną reprezentatywną próbę, ponieważ wyrównanie mikrokanałów było trudne.

Rysunek 4. Obrazy z lapse-time przedstawiające zamykanie rany 0, 7 i 17 godzin po początkowym zadrapaniu. Przez cały czas trwania eksperymentu komórki były dostarczane z 21% tlenem.

Rysunek 5. Wpływ stężenia tlenu na tempo gojenia rany w teście scratch assay.

Dyskusja

Urządzenie jest wytwarzane standardową fotolitografią SU-8, odlewaniem replikacyjnym oraz definiowanym wirowaniem i składa się w całości z polidimetylosiloksanu. Gaz jest wprowadzany do urządzenia w celu ustanowienia gradientu stężeń między mikrokanałem filara a podłożem hodowlanym, co dąży do osiągnięcia pożądanego stanu równowagi stężenia tlenu. Wykazano, że urządzenie skutecznie moduluje czasową i przestrzenną oksygenację wewnątrz studzienki, a także odpowiednio modyfikuje zachowanie komórkowe. Przestrzenny wzór oksygenacji jest definiowany przez mikrokanał u podstawy filara, zatem podczas projektowania fotomaski można zaimplementować różne konfiguracje. Dodatkowo oczekuje się, że wprowadzenie pożądanego gazu do fazy gazowej studzienki poprawi czas wyrównywania stężeń oraz stopień hipoksji. Do urządzenia można by dostosować mikrofluidyczną sieć mieszającą, aby umożliwić wytwarzanie nowych mieszanin gazowych przy użyciu zaledwie kilku butli z gazami wzorcowymi. Wreszcie, mechanizm wymiany podłoża wyeliminowałby konieczność wyjmowania urządzenia z płytki wielodołkowej, na co komórki mogłyby zareagować.

Urządzenie to znajduje zastosowanie w każdym eksperymencie in vitro lub ex vivo, który wymaga kontroli nad stężeniem tlenu. Ponieważ tlen jest istotną zmienną fizjologiczną wpływającą na ogromną większość szlaków sygnalizacyjnych, obszary badań, które mogą odnieść korzyść z jego zastosowania, są ograniczone jedynie kreatywności badacza. Niektóre dziedziny, które skorzystałyby na usprawnionej kontroli czasowej stężenia tlenu, obejmują m.in. przerzuty nowotworowe, bezdech senny oraz uszkodzenia reperfuzyjne w niedokrwieniu mięśnia sercowego. Na przykład wykazano korelację między przerywaną hipoksją a bardziej inwazyjnymi nowotworami, co prowadzi do zwiększonej ekspresji szeregu genów związanych z przerzutowaniem w porównaniu z hipoksją ciągłą i normoksją. Istotna jest również kontrola przestrzenna, ponieważ gradienty tlenu mają krytyczne znaczenie w rozwoju, zonacji wątroby, toksyczności leków oraz w niszy komórek macierzystych. Urządzenie przedstawione w niniejszym artykule przyniesie korzyści wielu obszarom badań, zapewniając system zajmujący mniej miejsca w laboratorium, o stosunkowo prostych wymaganiach operacyjnych i znacznie większej kontroli nad ekspozycją komórek na tlen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
Planarny czujnik FOXY	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Powlekane szkiełko mikroskopowe
Regulator gazu	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
Gaz	Airgas	Mieszanki niestandardowe	Wszystkie zawierają 5% CO2
SU-8 2150	MicroChem Corp.
Pożywka do wzrostu MDCK z L-glutaminą	SAFC Global	M3803
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020
Trypsyna-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Roztwór L-glutaminy	Sigma-Aldrich	G7513