Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Podsumowanie

Koncepcja, wykonanie i walidacja platformy dodatkowej, która zapewnia zwiększoną kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie jest dostosowane do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie ran.

Streszczenie

Tlen jest kluczowym modulatorem wielu szlaków komórkowych, jednak obecne urządzenia umożliwiającein vitromodulacja poziomu tlenu nie spełnia potrzeb badawczych w dziedzinie biomedycyny. Komora hipoksyczna oferuje prosty system kontroli natlenienia w standardowych naczyniach hodowlanych, ale brakuje w niej precyzyjnej kontroli czasowej i przestrzennej nad stężeniem tlenu na powierzchni komórek, co uniemożliwia jej zastosowanie w badaniu wielu zjawisk fizjologicznych. Inne systemy usprawniły działanie komory hipoksycznej, lecz wymagają one specjalistycznej wiedzy i sprzętu do obsługi, co czyni je onieślającymi dla przeciętnego badacza. Opracowano mikrofabrykowaną wkładkę do płytek wielodotykowych, która pozwala na skuteczniejszą kontrolę czasową i przestrzenną stężenia tlenu, aby lepiej modelować występujące zjawiska fizjologicznein vivoPlatforma składa się z wkładki z polidimetylosiloksanu, która jest osadzona w standardowej płytce wielodobowej i służy jako pasywna mikrofluidyczna sieć gazowa z membraną przepuszczalną dla gazów, mającą na celu modulowanie dostarczania tlenu do komórek adherentnych. Urządzenie jest proste w obsłudze i podłączone do butli z gazem, które zapewniają ciśnienie niezbędne do wprowadzenia pożądanej koncentracji tlenu do platformy. Produkcja obejmuje kombinację standardowej fotolitografii SU-8, odlewania replikacyjnego oraz precyzyjnego nanoszenia PDMS metodą spin-coatingu na waflu krzemowym. Komponenty urządzenia są łączone po obróbce powierzchniowej przy użyciu ręcznego systemu plazmowego. Walidację przeprowadzono za pomocą płaskiego fluorescencyjnego czujnika tlenu. Czas równoważenia wynosi od kilku minut, a dzięki konstrukcji urządzenia można uzyskać szeroką gamę profili tlenowych, takich jak profil cykliczny osiągnięty w niniejszym badaniu, a nawet gradienty tlenu naśladujące te występującein vivoUrządzenie można sterylizować do hodowli komórkowych za pomocą powszechnych metod bez utraty funkcjonalności. Możliwość zastosowania urządzenia do badaniain vitroreakcja gojenia rany zostanie zaprezentowana.

Protokół

1. Funkcja urządzenia

1. Urządzenie do generowania hipoksji składa się z 6 filarów, które są dopasowane do standardowej płytki 6-dołkowej. Gaz przepływa do filara, przez sieć mikroprzepływową u jego podstawy, a następnie wypływa z urządzenia. U podstawy filara, tworząc dolną ściankę mikrokanału, znajduje się przepuszczalna dla gazów membrana PDMS o grubości 100 μm, która umożliwia dyfuzję tlenu między mikrokanałem gazowym a pożywką hodowlaną. W ten sposób urządzenie działa poprzez ustanowienie gradientu stężeń, który dąży do osiągnięcia pożądanej wartości stężenia tlenu w pożywce.
2. Urządzenie oferuje szereg zalet w porównaniu do komór hipoksycznych i innych systemów natleniania komórek: 1) minimalizuje drogę dyfuzji tlenu, co umożliwia szybszą kontrolę czasową, 2) zwiększa przestrzenną kontrolę nad natlenianiem, zależnie od konstrukcji mikrokanału w filarze, 3) zajmuje mniej miejsca w laboratorium i zapewnia wyższą przepustowość, co zwiększa wydajność eksperymentalną, oraz 4) jest kompatybilne z powszechnymi narzędziami do hodowli komórkowych (np. płytkami wielodołkowymi) bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy i sprzętu.

2. Wytwarzanie urządzenia

1. W pierwszej kolejności macierz filarów jest odlewana z PDMS przy użyciu wcześniej wykonanej formy z materiału Delran.
2. Następnie mikrokanał gazowy u podstawy każdego filara jest wytwarzany przy użyciu standardowej fotolitografii z zastosowaniem SU-8 oraz odlewania z PDMS.
3. Membranę przepuszczalną dla gazów wykonuje się poprzez precyzyjne wirowanie PDMS na waflu krzemowym w celu uzyskania pożądanej grubości. W tym przykładzie zastosowano membranę o grubości 100 μm, którą wykonano poprzez wirowanie z prędkością 500 rpm przez 10 sekund, a następnie z prędkością 900 rpm przez 30 sekund.
4. Wszystkie elementy są ze sobą łączone po obróbce plazmą tlenową za pomocą przenośnego urządzenia plazmowego (Model BD-20, Electro-Technic Products).

3. Konfiguracja urządzenia

1. Ostrożnie włóż urządzenie do płytki, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Wprowadzanie urządzenia pod kątem pomaga usunąć pęcherzyki jedną ze stron. W przypadku rzeczywistych eksperymentów z wykorzystaniem komórek, ten etap musi zostać przeprowadzony w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ryzyko kontaminacji jest znacznie mniejsze po włożeniu urządzenia, więc zmontowany układ można przenieść do inkubatora w środowisku niesterylnym.
2. Podłącz rurki z butli z gazem źródłowym do wlotu i wylotu urządzenia. W przypadku eksperymentów z komórkami, inkubator do hodowli powinien posiadać otwór umożliwiający wprowadzenie rurek; rurki należy podłączyć po przeniesieniu urządzenia i umieszczeniu go w inkubatorze. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby odkształcić PDMS na tyle, by zmiażdżyć znajdujące się pod nim komórki.
3. Przed otwarciem regulatora butli upewnij się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty, aby zapobiec przepełnieniu urządzenia. Uruchom przepływ gazu. Powoli otwórz precyzyjny regulator przepływu do pożądanej wartości (50-100 mL/min). Przez następną godzinę uważnie obserwuj wartość i w razie potrzeby wprowadzaj korekty, ponieważ spadek ciśnienia będzie się zmieniać podczas równoważenia systemu, co wpłynie na szybkość przepływu. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków w pożywce, po początkowym 15-minutowym czasie równoważenia przy wyższym przepływie, zmniejsz szybkość przepływu do poziomu 10-20 mL/min.
4. Po pożądanym czasie trwania eksperymentu zatrzymaj przepływ gazu, wyjmij płytkę i odpowiednio przetwórz komórki (np. przeprowadź lizę, barwienie, zliczanie itp.).

4. Walidacja urządzenia

1. Kalibracja
   1. Wybierz liczbę i położenie punktów na szkiełku fluorescencyjnego czujnika tlenu
      (FOXY) (zależnie od wymagań walidacyjnych), które zostaną wykorzystane do pomiaru tlenu. Szkiełko pokryte jest fluorescencyjnym barwnikiem rutenowym, którego fluorescencja jest gaszona przez tlen.
   2. Naraź szkiełko bezpośrednio na działanie 0, 10 i 21% tlenu z butli gazowej i wykonaj zdjęcia po 5 minutach w celu zapewnienia odpowiedniej równowagi.
   3. Wyeksportuj średnią intensywność obrazu dla każdego punktu i wykreśl stężenie tlenu w funkcji intensywności fluorescencji.
   4. Wyznacz krzywą kalibracyjną poprzez dopasowanie krzywych liniowych do odcinka 0-10% oraz odcinka 10-21%.
2. Heterogeniczność
   1. Wyznacz wiele punktów obejmujących szerokość kanału w określonych odstępach (np. co 1 mm). Należy pamiętać, że w zależności od odstępów obrazy mogą na siebie nachodzić.
   2. Zmierz stężenie tlenu na powierzchni dołka w obrębie urządzenia.
3. Równowagowanie
   1. Wybierz trzy punkty na szkiełku FOXY, w których zmierzysz stężenie tlenu.
   2. Natychmiast po wykonaniu pierwszego zdjęcia przy poziomach tlenu otoczenia, otwórz precyzyjny regulator przepływu, aby rozpocząć przepływ gazu do urządzenia. Wykonuj zdjęcia w odpowiednich odstępach czasu, aby ocenić czas trwania i zakres równowagowania stężenia tlenu (np. co 10 sekund przez 30 min).

5. Zastosowania

1. Gojenie ran
   1. Dzień przed eksperymentem należy namoczyć wysterylizowany wkład z PDMS w medium bezsurowiczym, aby ograniczyć powstawanie pęcherzyków gazu w dołku.
   2. Hodować komórki do osiągnięcia 100% konfluencji w płytce 6-dołkowej.
   3. Za pomocą końcówki do pipety p200 wykonaj proste zarysowania w monowarstwach, aby zasymulować rany.
   4. Odssać pożywkę komórkową, przepłukać 5 ml pożywki, a następnie ponownie odessać. Ważne jest, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
   5. Napełnić ponownie dołki 4 ml pożywki bezsurowiczej, aby ograniczyć proliferację komórek.
   6. Umieść wkład w dołkach i połącz każdy dołek z odpowiadającą mu koncentracją tlenu.
   7. Umieść płytkę 6-dołkową z wkładką na podgrzewanym stoliku przy 37°C.
   8. Wykonaj zdjęcia poklatkowe komórek w wybranym odstępie czasu i całkowitym czasie trwania. Program MATLAB Test zadrapania, algorytm pomiaru rany, może być wykorzystany do analizy niezagojonego obszaru powierzchni.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Walidacja urządzenia
   Wkładka hipoksyczna wykazuje znaczną poprawę w porównaniu z komorą hipoksyczną pod względem czasu i zakresu wyrównania poziomu tlenu, wymagając mniej niż 2 minut do stabilizacji na poziomie 0,5% tlenu. Przerwa między membraną urządzenia a dnem dołka była krytycznym czynnikiem determinującym wydajność wyrównywania, przy czym większe przerwy wymagały więcej czasu do osiągnięcia stanu stacjonarnego stężeń tlenu. Urządzenie pozwala również na dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w obrębie jednego dołka, umożliwiając tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu natlenienia na powierzchni dołka.
2. Gojenie ran
   Monowarstwy komórek poddano działaniu 10% lub 21% tlenu, a powierzchnia rany była analizowana w czasie. Zadrapania wystawione na 21% tlenu goiły się najwolniej, a na 10% najszybciej. Rycina 1 przedstawia obrazy zadrapania w ciągu 17 godzin. Wykresy na Rycini 5 pokazują procent otwartej powierzchni rany dla obu stężeń tlenu w trakcie trwania eksperymentu.

Rycina 1. Schemat i diagramy ilustrujące cechy urządzenia. Urządzenie z wkładem tlenowym jest wytwarzane za pomocą konwencjonalnej fotolitografii (sieć mikrofluidyczna), odlewania replikacyjnego (sieć mikrofluidyczna i rusztowanie wkładu) oraz precyzyjnego wirowania PDMS (membrana przepuszczalna dla gazów). A) Urządzenie tlenowe umieszczone w płytce 6-dołkowej. B) Przykłady macierzy filarów w płytkach 24- i 96-dołkowych. C) Schemat przekroju poprzecznego filara. Tlen wpływa do urządzenia przez wlot i przemieszcza się przez sieć mikrofluidyczną u podstawy filara. Tlen może swobodnie dyfundować przez przepuszczalną dla gazów membranę PDMS u podstawy filara i rozpuszczać się w pożywce hodowlanej. D) Obraz mikroskopowy pokazujący różne cechy pojedynczego filara jednokanałowego widzianego z góry, z przyklejonymi szklanymi wspornikami do badań równowagowych.

Rysunek 2. Walidacja urządzenia za pomocą czujników tlenu. Napięcie tlenowe w każdym dołku scharakteryzowano przy użyciu planarnego rutenowego czujnika tlenu. Wszystkie mieszaniny tlenowe zawierały azot jako gaz wypełniający oraz 5% CO₂ w celu buforowania medium. A) Wykres ilustrujący wpływ wysokości wspornika, a tym samym odległości dyfuzji tlenu między membraną a komórkami, na czas i skuteczność równoważenia. Wysokości zostały określone przez szklane wsporniki przymocowane do dna urządzenia. Wszystkie trzy rozmiary wsporników zapewniają czasy równoważenia znacznie krótsze niż w komorze hipoksyjnej. Należy zauważyć, że czas przedstawiono w skali logarytmicznej. B) Wykres przedstawiający szybki czas odpowiedzi równoważenia tlenu w urządzeniu ze szczeliną 0,2 mm. C) Wykonano również wielopozycyjne skanowanie liniowe w poprzek dołka pod mikrokanałem, aby zapewnić homogeniczność stężenia tlenu wprowadzanego przez urządzenie. Wykres przedstawia stężenie tlenu zmierzone po infuzji 0%, 10% i 21% tlenu przez 10 min. D) Urządzenie skutecznie utrzymuje 10% tlenu przez 5 dni.

Rysunek 3. Eksperymenty z bardziej złożonymi konstrukcjami mikrokanałów tlenowych. A) Układ mikrokanałów o podwójnych warunkach zapewnia stabilny profil tlenowy 0% i 21% przez 14 dni. B) Przeplatany i kręty wzór mikrokanałów o szerokości 500 μm rozciągających się przez filar skutkuje cyklicznym profilem tlenowym. Należy zauważyć, że dane przedstawiają tylko jedną reprezentatywną próbę, ponieważ wyrównanie mikrokanałów było trudne.

Rycina 4. Obrazy timelapse zamykania rany w 0, 7 i 17 godzinach po początkowym zadrapaniu. Komórki otrzymywały 21% tlenu przez cały czas trwania eksperymentu.

Rycina 5. Wpływ stężenia tlenu na szybkość gojenia ran w teście zarysowania.

Dyskusja

Urządzenie jest wytwarzane standardową fotolitografią SU-8, odlewaniem replikacyjnym oraz definiowanym wirowaniem i składa się w całości z polidimetylosiloksanu. Gaz jest wprowadzany do urządzenia w celu ustanowienia gradientu stężeń między mikrokanałem filara a podłożem hodowlanym, co dąży do osiągnięcia pożądanego stanu równowagi stężenia tlenu. Wykazano, że urządzenie skutecznie moduluje czasową i przestrzenną oksygenację wewnątrz studzienki, a także odpowiednio modyfikuje zachowanie komórkowe. Przestrzenny wzór oksygenacji jest definiowany przez mikrokanał u podstawy filara, zatem podczas projektowania fotomaski można zaimplementować różne konfiguracje. Dodatkowo oczekuje się, że wprowadzenie pożądanego gazu do fazy gazowej studzienki poprawi czas wyrównywania stężeń oraz stopień hipoksji. Do urządzenia można by dostosować mikrofluidyczną sieć mieszającą, aby umożliwić wytwarzanie nowych mieszanin gazowych przy użyciu zaledwie kilku butli z gazami wzorcowymi. Wreszcie, mechanizm wymiany podłoża wyeliminowałby konieczność wyjmowania urządzenia z płytki wielodołkowej, na co komórki mogłyby zareagować.

Urządzenie to znajduje zastosowanie w każdym eksperymencie in vitro lub ex vivo, który wymaga kontroli nad stężeniem tlenu. Ponieważ tlen jest istotną zmienną fizjologiczną wpływającą na ogromną większość szlaków sygnalizacyjnych, obszary badań, które mogą odnieść korzyść z jego zastosowania, są ograniczone jedynie kreatywności badacza. Niektóre dziedziny, które skorzystałyby na usprawnionej kontroli czasowej stężenia tlenu, obejmują m.in. przerzuty nowotworowe, bezdech senny oraz uszkodzenia reperfuzyjne w niedokrwieniu mięśnia sercowego. Na przykład wykazano korelację między przerywaną hipoksją a bardziej inwazyjnymi nowotworami, co prowadzi do zwiększonej ekspresji szeregu genów związanych z przerzutowaniem w porównaniu z hipoksją ciągłą i normoksją. Istotna jest również kontrola przestrzenna, ponieważ gradienty tlenu mają krytyczne znaczenie w rozwoju, zonacji wątroby, toksyczności leków oraz w niszy komórek macierzystych. Urządzenie przedstawione w niniejszym artykule przyniesie korzyści wielu obszarom badań, zapewniając system zajmujący mniej miejsca w laboratorium, o stosunkowo prostych wymaganiach operacyjnych i znacznie większej kontroli nad ekspozycją komórek na tlen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
Planarny czujnik FOXY	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Powlekane szkiełko mikroskopowe
Regulator gazu	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
Gaz	Airgas	Mieszanki niestandardowe	Wszystkie zawierają 5% CO2
SU-8 2150	MicroChem Corp.
Pożywka do wzrostu MDCK z L-glutaminą	SAFC Global	M3803
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020
Trypsyna-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Roztwór L-glutaminy	Sigma-Aldrich	G7513