Wytwarzanie i eksploatacja wkładu tlenowego do przylegających kultur komórkowych

Podsumowanie

Produkcja i walidacja dodatkowej platformy, która oferuje lepszą kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie można dostosować do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie się ran.

Streszczenie

Tlen jest kluczowym modulatorem wielu szlaków komórkowych, ale obecne urządzenia umożliwiające modulację tlenu in vitro nie spełniają potrzeb badań biomedycznych. Komora hipoksyjna oferuje prosty system do kontroli natlenienia w standardowych naczyniach hodowlanych, ale brakuje precyzyjnej czasowej i przestrzennej kontroli nad stężeniem tlenu na powierzchni komórki, co uniemożliwia jego zastosowanie w badaniu różnych zjawisk fizjologicznych. Inne systemy ulepszyły komorę hipoksyjną, ale wymagają specjalistycznej wiedzy i sprzętu do ich działania, co czyni je onieśmielającymi dla przeciętnego badacza. Opracowano mikroprefabrykowaną wkładkę do płytek wielodołkowych, aby skuteczniej kontrolować czasowe i przestrzenne stężenie tlenu w celu lepszego modelowania zjawisk fizjologicznych występujących in vivo. Platforma składa się z wkładki z polidimetylosiloksanu, która zagnieżdża się w standardowej płytce wielodołkowej i służy jako pasywna mikroprzepływowa sieć gazowa z membraną przepuszczającą gaz, której celem jest modulowanie dostarczania tlenu do przylegających komórek. Urządzenie jest proste w obsłudze i jest podłączone do butli gazowych, które zapewniają ciśnienie w celu wprowadzenia pożądanego stężenia tlenu do platformy. Produkcja polega na połączeniu standardowej fotolitografii SU-8, formowania replik i zdefiniowanego przędzenia PDMS na płytce krzemowej. Elementy urządzenia są łączone po obróbce powierzchni za pomocą ręcznego systemu plazmowego. Walidacja odbywa się za pomocą planarnego fluorescencyjnego czujnika tlenu. Czas równowagi jest rzędu minut, a w oparciu o konstrukcję urządzenia można uzyskać szeroką gamę profili tlenowych, takich jak profil cykliczny osiągnięty w tym badaniu, a nawet gradienty tlenu naśladujące te znalezione in vivo. Urządzenie może być sterylizowane w celu hodowli komórkowej przy użyciu popularnych metod bez utraty funkcji. Zademonstrowana zostanie przydatność urządzenia do badania reakcji na gojenie się ran in vitro.

Protokół

1. Funkcja urządzenia

1. Wkładka hipoksyjna zawiera 6 filarów, które zagnieżdżają się w standardowej płytce 6-dołkowej. Gaz przepływa do słupa, przez sieć mikroprzepływową u podstawy słupa i wypływa z powrotem z urządzenia. U podstawy filaru tworzącego dolną ścianę mikrokanału znajduje się przepuszczalna dla gazów membrana PDMS o grubości 100 μm, która umożliwia dyfuzję tlenu między mikrokanalikiem gazowym a pożywką hodowlaną. W ten sposób urządzenie działa poprzez ustanowienie gradientu stężenia, który napędza stężenie tlenu w medium do pożądanej wartości.
2. Urządzenie ma szereg zalet w porównaniu z komorą hipoksyjną i innymi systemami natleniania komórek: 1) minimalizuje ścieżkę dyfuzji tlenu, umożliwiając szybszą kontrolę czasową, 2) poprawia kontrolę przestrzenną nad natlenieniem, w zależności od konstrukcji mikrokanału filarowego, 3) zajmuje mniejszą powierzchnię laboratoryjną i ma wyższą przepustowość w celu zwiększenia wydajności eksperymentalnej, oraz 4) dostosowuje się do popularnych narzędzi do hodowli komórkowych (np. płytki wielodołkowej) bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy i sprzęt.

2. Produkcja urządzeń

1. Najpierw układ filarów jest replikowany za pomocą PDMS w wcześniej obrobionej formie Delran.
2. Następnie mikrokanał gazowy na dole każdego filaru jest wytwarzany przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8 i formowania replik PDMS.
3. Membrana przepuszczająca gaz jest wytwarzana przez zdefiniowane przędzenie PDMS na płytce krzemowej w celu uzyskania pożądanej grubości. W tym przykładzie używamy membrany o grubości 100 μm, która została wytworzona przez wirowanie z prędkością 500 obr./min przez 10 sekund, a następnie z prędkością 900 obr./min przez 30 sekund.
4. Wszystkie elementy są łączone ze sobą po obróbce plazmą tlenową za pomocą ręcznego urządzenia plazmowego (model BD-20, Electro-Technic Products).

3. Konfiguracja urządzenia

1. Delikatnie włóż urządzenie do płytki, uważając, aby nie powstały bąbelki. Ustawienie urządzenia pod kątem podczas wkładania pomaga usunąć bąbelki z jednej strony. W przypadku rzeczywistych eksperymentów na komórkach ten krok należy wykonać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym. Ryzyko zanieczyszczenia jest znacznie zmniejszone po włożeniu urządzenia, dzięki czemu zestaw można przenieść do inkubatora w niesterylnym środowisku.
2. Podłącz rurki ze zbiornika gazu źródłowego do portów wlotowych i wylotowych urządzenia. W przypadku eksperymentów komórkowych inkubator do hodowli powinien mieć otwór umożliwiający wprowadzenie rurki, a rurkę należy podłączyć po przeniesieniu urządzenia i umieszczeniu go w inkubatorze. Uważaj, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na urządzenie, co mogłoby zdeformować PDMS na tyle, aby zmiażdżyć leżące pod nim komórki.
3. Upewnij się, że precyzyjny regulator przepływu jest zamknięty przed otwarciem regulatora górnego zbiornika, aby uniknąć przepełnienia urządzenia. Uruchom przepływ gazu. Delikatnie otwórz precyzyjny regulator przepływu do żądanego natężenia przepływu (50-100 ml/min). Uważnie obserwuj wartość przez następną godzinę i dokonuj korekt w razie potrzeby, ponieważ spadek ciśnienia zmieni się, gdy system się zrównoważy, zmieniając natężenie przepływu. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w pożywce, należy zmniejszyć natężenie przepływu do 10-20 ml/min po początkowym 15-minutowym czasie równoważenia przy wyższym natężeniu przepływu.
4. Po pożądanym czasie trwania eksperymentu zatrzymaj przepływ gazu, wyjmij płytkę i odpowiednio przetwórz komórki (np. lizę, barwienie, liczenie itp.).

4. Walidacja urządzenia

1. wzorcowanie
   1. Wybierz liczbę i położenie pozycji na fluorescencyjnym tlenie
      (FOXY) suwak czujnika (w zależności od wymagań walidacji), który będzie używany do pomiaru tlenu. Szkiełko zawiera fluorescencyjną powłokę barwnika rutenowego, która jest gaszona tlenem.
   2. Wystaw szkiełko bezpośrednio na 0, 10 i 21% tlenu ze zbiornika gazu i uchwyć obrazy po 5 minutach, aby uzyskać odpowiednią równowagę.
   3. Eksportuj średnią intensywność obrazu dla każdej pozycji i wykreśl stężenie natlenienia w zależności od intensywności fluorescencji.
   4. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, dopasowując krzywe liniowe do linii 0-10% i linii 10-21%.
2. Różnorodności
   1. Ustal wiele punktów rozciągających się na całej szerokości kanału w określonych odstępach (np. co 1 mm). Należy pamiętać, że obrazy mogą się nakładać w zależności od odstępów.
   2. Zmierz stężenie tlenu na powierzchni studni za pomocą urządzenia
3. Równowagi
   1. Wybierz trzy punkty na szkiełku FOXY, w których chcesz zmierzyć stężenie tlenu.
   2. Natychmiast po wykonaniu pierwszego zdjęcia przy poziomie tlenu w otoczeniu otwórz precyzyjny regulator przepływu, aby rozpocząć przepływ gazu do urządzenia. Rejestruj obrazy w odpowiednich odstępach czasu, aby ocenić czas trwania i zakres równoważenia stężenia tlenu (np. co 10 sekund przez 30 minut).

5. Aplikacje

1. Gojenie
   1. Dzień przed eksperymentem namocz wysterylizowaną wkładkę PDMS w podłożu bez surowicy, aby zmniejszyć tworzenie się pęcherzyków gazu w studni.
   2. Hodowla komórek do 100% zbiegu w płytce 6-dołkowej.
   3. Twórz proste rysy w monowarstwach za pomocą końcówki do pipety p200, aby symulować rany.
   4. Odessać pożywkę komórkową, spłukać pożywką o pojemności 5 ml i ponownie odessać. Ważne jest, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
   5. Napełnij studzienki 4 ml pożywki bez surowicy, aby zmniejszyć proliferację komórek.
   6. Umieść wkładkę w studzienkach i podłącz każdą studzienkę do odpowiedniego stężenia tlenu.
   7. Umieścić płytkę 6-dołkową z wkładką na podgrzewanym stoliku w temperaturze 37°C.
   8. Przechwytuj obrazy poklatkowe komórek w żądanym interwale i całkowitym czasie trwania. T_Scratch MATLAB, algorytm pomiaru rany, może być używany do analizy niezagojonej powierzchni.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Walidacja urządzenia
   Urządzenie do wkładania hipoksyjnego wykazuje dużą poprawę w stosunku do komory hipoksyjnej pod względem czasu i zakresu równoważenia tlenu, wymagając mniej niż 2 minuty na ustabilizowanie się do 0,5% tlenu. Rozmiar dolnej szczeliny membrany urządzenia był krytycznym czynnikiem określającym wydajność równowagi, przy czym większe rozmiary szczelin wymagały więcej czasu na osiągnięcie wartości stężenia tlenu w stanie ustalonym. Urządzenie pozwala również na dużą kontrolę nad przestrzennym natlenieniem w pojedynczej studni, umożliwiając tworzenie wielu warunków, a nawet generowanie cyklicznego profilu tlenu na powierzchni studni.
2. Gojenie się ran
   Monowarstwy komórek wystawiono na działanie 10% lub 21% tlenu, a powierzchnia rany była analizowana w czasie. Zadrapania wystawione na działanie 21% tlenu zamykały się najwolniej, a 10% najszybciej. Rysunek 1 przedstawia obrazy zadrapań w ciągu 17 godzin. Wykresy na rysunku 5 pokazują procent powierzchni otwartej rany dla obu stężeń tlenu w czasie trwania eksperymentu.

Rysunek 1. Schematy i schematy ilustrujące cechy urządzenia. Urządzenie do wkładania tlenu jest wytwarzane przez konwencjonalną fotolitografię (sieć mikroprzepływowa), formowanie replik (sieć mikroprzepływowa i rusztowanie wkładki) oraz zdefiniowane przędzenie PDMS (membrana przepuszczalna dla gazu). A) Urządzenie tlenowe zagnieżdżone w płytce 6-dołkowej. B) Przykłady 24- i 96-dołkowych układów filarowych. C) Schemat przekrojowy słupa. Tlen przepływa do urządzenia przez wlot i przemieszcza się przez sieć mikroprzepływową w dolnej części słupa. Tlen może swobodnie dyfundować przez przepuszczalną dla gazów membranę PDMS na dnie filaru i rozpuszczać się w pożywce hodowlanej. D) Obraz mikroskopowy przedstawiający różne cechy jednokanałowego filaru od góry, z klejonymi szklanymi słupkami do badań równowagi.

Rysunek 2. Walidacja urządzenia z czujnikami tlenu. Napięcie tlenu w każdej studzience scharakteryzowano za pomocą planarnego czujnika tlenu rutenowego. Wszystkie mieszaniny tlenu zawierały zrównoważony azot i 5% CO₂ do buforowania pożywki. A) Wykres ilustrujący wpływ wysokości słupka, a tym samym odległości dyfuzji tlenu między błoną a komórkami, na czas równowagi i skuteczność. Wysokość wyznaczano za pomocą słupków z ciętego szkła przymocowanych do spodu urządzenia. Wszystkie trzy rozmiary słupków zapewniają znacznie lepsze czasy równoważenia w porównaniu z komorą hipoksyjną. Należy pamiętać, że czas jest w skali logarytmicznej. B) Wykres przedstawiający szybki czas reakcji równoważenia tlenu przez urządzenie z przerwą 0,2 mm. C) W poprzek studni pod mikrokanałem przeprowadzono również wielopozycyjne kanty liniowe, aby zapewnić jednorodność stężenia tlenu wprowadzanego przez urządzenie. Wykres przedstawia stężenie tlenu mierzone po zaparzeniu 0%, 10% i 21% tlenu przez 10 minut. D) Urządzenie skutecznie utrzymuje 10% tlenu przez 5 dni.

Rysunek 3. Eksperymentowanie z bardziej złożonymi projektami mikrokanalików tlenowych. A) Dwustanowa konfiguracja mikrokanałów zapewnia stabilny profil tlenu 0% i 21% przez 14 dni. B) Międzypalcowy i kręty wzór mikrokanałów o szerokości 500 μm rozciągających się w poprzek filaru powoduje cykliczny profil tlenowy. Należy pamiętać, że dane przedstawiają tylko jedno reprezentatywne badanie, ponieważ dostosowanie mikrokanałów było trudne.

Rysunek 4. Zdjęcia poklatkowe zamykania rany 0, 7 i 17 godzin po początkowym zadrapaniu. Komórkom dostarczano 21% tlenu przez cały czas trwania eksperymentu.

Rysunek 5. Wpływ stężenia tlenu na szybkość gojenia się ran w teście zadrapań.

Dyskusja

Urządzenie jest wytwarzane metodą standardowej fotolitografii SU-8, formowania replik i zdefiniowanego przędzenia i jest wykonane w całości z polidimetylosiloksanu. Gaz jest wprowadzany do urządzenia w celu ustanowienia gradientu stężeń między mikrokanalikiem filarowym a pożywką hodowlaną, prowadząc system do pożądanego stężenia tlenu w równowadze. Wykazano, że urządzenie skutecznie moduluje czasowe i przestrzenne natlenienie wewnątrz studni, a także odpowiednio moduluje zachowanie komórek. Przestrzenny wzór natlenienia jest zdefiniowany przez mikrokanał u podstawy filaru, więc przy tworzeniu fotomaski można zastosować różne projekty. Ponadto oczekuje się, że wprowadzenie pożądanego gazu do fazy gazowej odwiertu poprawi czas równowagi i stopień hipoksji. Do urządzenia można by zaadaptować mikroprzepływową sieć mieszania, aby zapewnić środki do produkcji nowych mieszanin gazów z zaledwie kilku zbiorników gazu. Wreszcie, mechanizm wymiany pożywki wyeliminowałby potrzebę wyjmowania urządzenia z płytki wielodołkowej, na co komórki mogą zareagować.

Urządzenie znajduje zastosowanie w każdym eksperymencie in vitro lub ex vivo wymagającym kontroli nad stężeniem tlenu. Ponieważ tlen jest ważną zmienną fizjologiczną wpływającą na zdecydowaną większość szlaków sygnałowych, obszary badań, które mogłyby odnieść korzyści, są ograniczone przez kreatywność badacza. Niektóre dziedziny, które skorzystałyby na ulepszonej czasowej kontroli stężenia tlenu, obejmują między innymi przerzuty raka, bezdech senny i uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne serca. Na przykład przerywane niedotlenienie zostało skorelowane z bardziej inwazyjnymi nowotworami, zwiększając liczbę genów związanych z przerzutami w stosunku do ciągłego niedotlenienia i normoksji. Kontrola przestrzenna jest również ważna, ponieważ gradienty tlenu mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, podziału na strefy wątroby, toksyczności leków i niszy komórek macierzystych. Urządzenie przedstawione w tym artykule przyniesie korzyści wielu obszarom badań, zapewniając system o mniejszej powierzchni laboratoryjnej, stosunkowo prostych wymaganiach operacyjnych i znacznie większej kontroli nad ekspozycją komórek na tlen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
Planar Czujnik FOXY	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Powlekane szkiełko mikroskopowe
Reduktor gazu	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
Gas	Airgas	Niestandardowe mieszanki	Wszystkie zawierają 5% CO2
SU-8 2150	MicroChem Corp.
MDCK Growth Medium z L-Glutaminą	SAFC Global	M3803
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Roztwór L-glutaminy	Sigma-Aldrich	G7513