Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Podsumowanie

Zestawy do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowoczesne, gotowe kombinacje starterów i sond qPCR, opracowane w celu uproszczenia procesu qPCR bez utraty specyficzności i odporności analizy.

Streszczenie

Zestaw do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowatorski rodzaj zestawu starterów i sond, zaprojektowany w celu uproszczenia procesu qPCR przy zachowaniu czułości i dokładności analizy. Zestawy te zostały opracowane w taki sposób, aby objąć >98% genomów ludzkich i mysich, a w porównaniu z wcześniej dostępnymi technologiami oferują one znaczące ulepszenia. Usprawnienia te stały się możliwe dzięki zastosowaniu nowatorskiego algorytmu projektowania, opracowanego przez ekspertów z zakresu bioinformatyki w Thermo Scientific.

W zestawie Solaris qPCR Assay zastosowano kilka praktycznych rozwiązań, aby usprawnić proces przeprowadzania ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Po pierwsze, protokół jest zbliżony do powszechnie stosowanych alternatyw, dzięki czemu metody wykorzystywane podczas qPCR są prawdopodobnie znane użytkownikowi. Po drugie, master mix ma niebieski kolor, co ułatwia monitorowanie przygotowywania reakcji qPCR. Po trzecie, warunki cykli termicznych są identyczne dla wszystkich testów (genów), co umożliwia jednoczesne badanie wielu próbek i zmniejsza ryzyko wystąpienia błędów. Wreszcie, dostarczone zostały informacje o sekwencjach sond i starterów, co upraszcza proces publikacji wyników.

W niniejszym materiale demonstrujemy, jak uzyskać odpowiednie odczynniki Solaris, korzystając z funkcji wyszukiwania produktów GENEius dostępnej na stronie zamówień (www.thermo.com/solaris), oraz jak wykorzystać odczynniki Solaris do przeprowadzenia qPCR z zastosowaniem metody krzywej standardowej.

Protokół

1. Algorytm projektowania testów qPCR Thermo Scientific Solaris

1. Algorytm stosowany w projektowaniu par sond i starterów Solaris qPCR dostosowuje Tm każdego komponentu, co umożliwia stosowanie uniwersalnych warunków cyklicznych. Wprowadzenie do sondy grupy MGB (minor groove binding – wiążącej się z małym rowkiem) zwiększa Tm i pozwala na projektowanie krótszych sond, co zapewnia większą elastyczność i wydajność testu. Jak wynika z nazwy, MGB to klasa antybiotyków, które mogą dopasować się do małego rowka helisy DNA. MGB są przyłączane do końca 3' lub 5' sondy DNA. W roztworze fluorescencja reportera FAM sondy jest wygaszana przez Eclipse Dark Quencher. Gdy sonda wiąże się z sekwencją docelową, wynikająca z tego zmiana konformacji 3D sondy umożliwia uzyskanie silnego sygnału fluorescencyjnego. Wiązanie sondy DNA z sekwencją docelową jest stabilizowane przez MGB, co pozwala na stosowanie wysoce specyficznych, krótszych sond przy zachowaniu odpowiedniej temperatury topnienia dla PCR. W związku z tym detekcja sygnału zachodzi podczas fazy przyłączania (annealing) amplifikacji celu. W etapie elongacji sonda MGB dysocjuje, a fluorescencja jest ponownie wygaszana. Ponieważ sonda dysocjuje, nie wpływa ona na wydajność PCR.
2. Kolejną cechą algorytmu Solaris jest wykorzystanie Superbaz. Superbazy to zmodyfikowane zasady o zwiększonych zdolnościach wiązania, które poprawiają stabilność wiązań A-T i eliminują samoasocjację G-G w sekwencjach bogatych w guaninę. Co więcej, nie wygaszają one sąsiednich fluoroforów przyłączonych do terminu 5'. Zasady te są rozmieszczane selektywnie, zgodnie z algorytmem, aby rozszerzyć dostępność sekwencji docelowych. Umożliwia to wykorzystanie sekwencji, takich jak regiony bogate w G-C, których w przeciwnym razie unikano by przy projektowaniu starterów i sond.
3. Ilekroć jest to możliwe, algorytm Solaris uwzględnia regiony obejmujące złącza eksonowe w miejscu docelowym. Zwiększa to specyficzność poprzez zapobieganie amplifikacji zanieczyszczającego genomowego DNA.
4. Co istotne, algorytm identyfikuje również sekwencję konsensusową dla wszystkich znanych wariantów splicingowych, tak aby wszystkie były objęte jednym zestawem sonda/starter. Dzięki temu do analizy konkretnego genu zainteresowania potrzebny jest tylko jeden test.
5. Wreszcie, algorytm projektowania testów Solaris qPCR wykorzystuje bardzo rygorystyczne parametry w kluczowych kwestiach projektowych, w tym zawartość GC, długość, Tm oraz odcinki jednorodnych nukleotydów. Wynikowe sekwencje są analizowane za pomocą BLAST pod kątem specyficzności przy użyciu trzech różnych baz danych: genomowej, transkryptomowej i pseudogenowej.

2. Pozyskiwanie odczynników Solaris

1. Aby uzyskać odpowiednie odczynniki Solaris, odwiedź stronę www.thermo.com/solaris
2. Po wejściu na stronę kliknij „GENEius Product Search”. Aby przejść bezpośrednio do wyszukiwania produktów GENEius, wejdź na www.thermo.com/SolarisSearch
3. Kliknij w polu wyszukiwania i wybierz odpowiedny organizm docelowy.
4. Wyszukiwarka produktów GENEius może przetwarzać wiele różnych identyfikatorów genów. W tym miejscu wprowadź jeden z sugerowanych terminów wyszukiwania, aby znaleźć interesujący Cię gen, np. numer dostępu Ref Seq, Gene ID, symbol genu, opis genu, numer Sanger ID lub numer dostępu, lub numer katalogowy. Następnie kliknij „Search”.
5. Zidentyfikuj interesujący Cię gen i kliknij „Select” po lewej stronie. Otworzy się okno wyświetlające dostępne produkty Thermo Scientific dla wybranego genu. W sekcji „Products” wybierz zakładkę „qPCR Detection”.
6. W sekcji „Solaris Gene Expression Assay” zobaczysz jeden optymalnie zaprojektowany zestaw sondy i starterów Solaris. Ten jeden zestaw obejmuje wszystkie znane warianty splicingowe Twojego genu docelowego. Wybierz żądaną ilość. Dostępne są opakowania po 100, 200, 400 oraz
   1000 X 25 μl reakcji (jeśli zestaw jest oznaczony jako wykonywany na zamówienie, opakowanie 100 sztuk nie będzie dostępne). Kliknij „Add to Cart”.
7. Następnie wybierz odpowiedni master mix do termocyklera, który zostanie użyty. Aby ustalić, który master mix będzie najlepiej współpracował z dostępnym urządzeniem, kliknij „Find out which Master Mix works best with your PCR Cycler!”.
8. Znajdź w menu używany cykler qPCR, aby określić, którego mieszaniny należy użyć.
9. Wróć do okna wyszukiwania produktów GENEius i wybierz odpowiedni master mix. Master mix jest dostępny w rozmiarach 100, 200, 400 i 1000 reakcji. Kliknij „Add to Cart”.
10. Do przeprowadzenia pełnej analizy qRT-PCR można zamówić również sugerowane geny referencyjne oraz zestawy do syntezy cDNA verso.
11. Po otrzymaniu odczynników Solaris qPCR przechowuj je w temperaturze -20°C do momentu użycia. Powinny zostać otrzymane następujące odczynniki: roztwór 20X zawierający dwa startery w stężeniu 800 nM każdy oraz jedną sondę specyficzną dla genu w stężeniu 200 nm, informacje o sekwencji sondy i starterów oraz Solaris qPCR Gene Expression Master Mix w stężeniu 2X. Zestawy Solaris qPCR Gene Expression Assays są stabilne przez minimum 12 miesięcy. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

3. Przygotowanie do qPCR

1. Protokół qPCR należy rozpocząć od cDNA. Całkowity RNA powinien zostać wyekstrahowany metodą kolumnową. Do odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA zaleca się zestaw do syntezy cDNA Thermo Scientific Verso.
2. W celu przygotowania do qPCR rozmrozić primery, sondy i master mix na lodzie. Należy również przygotować wodę klasy PCR oraz nieprzezroczyste białe płytki do qPCR, które mogą poprawić czułość PCR w czasie rzeczywistym.
3. Master mix zawiera wszystkie komponenty do PCR w czasie rzeczywistym, w tym: 1) polimerazę DNA Thermo-Start, wersję hot-start polimerazy DNA Thermoprime. Ten rodzaj polimerazy jest stosowany w celu zapobiegania niespecyficznej amplifikacji podczas przygotowania reakcji i wymaga etapu aktywacji w 95°C przez 15 min. 2) dNTP w Solaris Master mix, gdzie dTTP zastępuje dUTP w celu maksymalizacji wydajności amplifikacji. 3) Autorski bufor reakcyjny, zoptymalizowany do pracy z zestawami primer/sonda Solaris. Bufor reakcyjny ten zawiera niebieski barwnik w celu zwiększenia kontrastu między odczynnikiem a plastikiem. 4) ROX, jeśli instrument do qPCR wymaga zastosowania ROX.
4. Po rozmrożeniu roztworów wymieszać je poprzez delikatne potrząsanie probówką (nie używać wirówki typu vortex). Odwirować próbki, aby zapobiec utracie odczynnika.
5. Następnie przygotować sterylną probówkę Falcon 15 mL do przygotowania mieszaniny reakcyjnej dla genu docelowego oraz jedną dla genu referencyjnego, skalując objętość w zależności od liczby próbek. Przygotować ilość umożliwiającą wykonanie trzech powtórzeń dla każdej próbki, w tym kontroli bez matrycy (NTC) oraz próbek do krzywej standardowej, jeśli do analizy zostanie zastosowana metoda krzywej standardowej.
6. Dla każdej próbki na płytce 96-dołkowej wymieszać następujące składniki: 5 μL 2X Solaris qPCR Master Mix, 0,5 μl zestawu Solaris Primer/Probe (20X) oraz wodę klasy PCR w taki sposób, aby końcowa objętość reakcji po dodaniu cDNA wynosiła 25 μL. Dla każdej próbki na płytce 384-dołkowej wymieszać: 12,5 μL 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 μl zestawu Solaris Primer/Probe (20X) oraz wodę klasy PCR w taki sposób, aby końcowa objętość reakcji po dodaniu cDNA wynosiła 10 μL.
7. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść master mix do odpowiednich dołków płytki. Niebieski barwnik zawarty w master mixie ułatwi monitorowanie postępu pipetowania na białych płytkach. Następnie dodać 1-5 μL matrycy cDNA (dla płytki 96-dołkowej) lub 1-2 μL matrycy cDNA (dla płytki 384-dołkowej). Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Umieścić płytkę w wirówce i odwirować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać odczyty fluorescencji.
8. Zaprogramować termocykler: enzym musi zostać aktywowany w 95°C przez 15 min (1 cykl). Następnie wykonać 40 cykli: denaturacja w 95°C przez 15 sekund oraz przyłączanie i elongacja w 60°C przez 60 sekund.
9. Umieścić płytkę w urządzeniu do qPCR. Uruchomić program.

Reprezentatywne wyniki qPCR z wykorzystaniem Solaris

Rysunek 1. Testy Solaris zapewniają wiarygodną detekcję nawet przy bardzo niskich stężeniach wejściowych, co potwierdzają wartości wydajności PCR oraz r2. Dziesięć 10-krotnych rozcieńczeń cDNA syntetyzowanego z syntetycznej sekwencji amplikonu RNA lub sekwencji amplikonu DNA zostało namnożone na urządzeniu ABI 7900HT przy użyciu odpowiednio Solaris qPCR Gene Expression Assay dla F2RL1 lub CDC20. Przedstawiono krzywe amplifikacji w skali logarytmicznej oraz krzywe wzorcowe wraz z parametrami każdego testu, w tym wydajnością, wartością r2, zakresem dynamicznym z 10 rozcieńczeń log10 oraz dolną granicą detekcji.

Rysunek 2. Testy Solaris dają spójne wyniki nawet w przypadku różnych badaczy i laboratoriów. siRNA nakierowane na ALDOA i PPIB, a także kontrola nietargetująca (NTC), zostały przetransfekowane do komórek HeLa w końcowych stężeniach 100, 10, 1 i 0,1 nM. Komórki zebrały i wyizolowano całkowite RNA 48 h po obróbce. cDNA zsyntezowano przy użyciu zestawu Thermo Scientific Verso cDNA Synthesis Kit. Alikwot cDNA poddano amplifikacji w dwóch geograficznie oddzielnych laboratoriach, stosując testy Solaris qPCR Gene Expression Assays do detekcji ALDOA, PPIB oraz GAPDH na platformie Roche LightCycler 480 (384-dołkowej). Poziom wyciszenia (knockdown) obliczono metodą ΔΔCq (z normalizacją względem genu referencyjnego GAPDH i komórek traktowanych NTC). Dla obu genów docelowych wykazano te same poziomy wyciszenia u obu badaczy w obu ośrodkach.

Dyskusja

Zestawy qPCR Thermo Scientific Solaris zapewniają prostą i ulepszoną metodę przeprowadzania analiz qPCR. Dzięki zastosowaniu algorytmu o wysokiej rygorystyczności, technologii MGB oraz superbaz (Superbases), zestawy starterów i sond te maksymalizują wierność i powtarzalność eksperymentów qPCR. Jeden zestaw startera i sondy rozpoznaje wszystkie znane warianty splicingowe danego genu. Miejsce docelowe, whenever possible, obejmuje regiony obejmujące złącza eksonów, aby zapewnić, że DNA genomiczne nie zostanie amplifikowane. Cechy te umożliwiają jednoczesne badanie licznych próbek, co znacznie skraca czas potrzebny na przeprowadzenie złożonych eksperymentów. Ponieważ master mix jest niebieski, możliwe jest stosowanie białych nieprzezroczystych płytek, które zwiększają czułość qPCR, bez ryzyka pomylenia próbek podczas pipetowania.

Podsumowując, cechy konstrukcyjne testu Solaris qPCR sprawiają, że ten nowatorski test qPCR jest prostym, a jednocześnie wysokowydajnym narzędziem, które charakteryzuje się zarówno specyficznością, jak i odpornością.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (rozmiar zestawu wprowadzającego)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL reakcji
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL reakcji
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL reakcji
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL reakcji
Zestawy Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 reakcji (1 x 125 μL) 200 reakcji (2 x 125 μL) 400 reakcji (4 x 125 μL) lub 1000 reakcji (10 x 125 μL)
Zestaw Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL reakcji 100 x 20 μL reakcji
Płytka 96-dołkowa ABgene (ze spodem, niski profil, biała) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 płytek
Płytka PCR 384-dołkowa ABgene Diamond Ultra, biała **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 płytek
Klejowa folia uszczelniająca Absolute qPCR	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 arkuszy
*Numer katalogowy zależy od produktu. W celu wybrania odpowiedniego zestawu prosimy odwiedzić stronę www.thermo.com/solaris
**W celu sprawdzenia kompatybilności z termocyklerem oraz dostępnych kolorów należy zapoznać się z naszym aktualnym katalogiem lub odwiedzić stronę www.thermo.com/pcrplastics