Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Podsumowanie

Wizualizacja transportu RNA in vivo jest realizowana poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Lokalizacja RNA jest konserwatywnym mechanizmem ustalania polaryzacji komórkowej. mRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie wegetatywnym oocytów Xenopus laevis i służy do przestrzennego ograniczenia ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola rozkładu Vg1 w ten sposób jest niezbędna do prawidłowej specyfikacji warstw zarodkowych w rozwijającym się embrionie. Elementy sekwencji RNA w 3' UTR mRNA, czyli element lokalizacji Vg1 (VLE), są niezbędne i wystarczające do kierowania transportem. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która pozwala na szeroką analizę mechanizmów transportu kierowanego przez czynniki trans za pomocą prostego odczytu wizualnego.

Aby zwizualizować lokalizację RNA, syntetyzujemy znakowane fluorescencyjnie RNA VLE i mikroiniekujemy ten transkrypty do poszczególnych oocytów. Po hodowli oocytów w celu umożliwienia transportu wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA umożliwia monitorowanie pełnej ścieżki transportu RNA oraz identyfikację roli elementów cis-działających w obrębie transkryptu oraz czynników trans-działających wiążących się z VLE w kierowaniu transportem RNA (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi cząsteczkami RNA i białkami (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), a także w połączeniu z zaburzeniem białek motorowych i cytoszkieletu (Messitt et al., 2008), aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji mRNA.

Protokół

Część 1: Transkrypcja mRNA znakowanego fluorescencyjnie.

1. Zlinearyzuj DNA plazmidowe zawierające element lokalizacji RNA lub inną odpowiednią sekwencję i resuspenduj do stężenia 1 μg/μl w H₂O traktowanej DEPC. Matryca DNA musi posiadać w górze miejsca promotorowe dla transkrypcji przez polimerazę RNA T7, SP6 lub T3.
2. Do sterylnej probówki 1,5 ml dodaj następujące odczynniki:

   a. Bufor 10X Tx (patrz M&M)	2 μl
   b. Mieszanina 20X cap/NTP (patrz M&M)	1 μl
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 μl
   d. UTP, [α-32P](1 μCi/μl) (Perkin Elmer)	1 μl
   e. DEPC-H2O	1 μl
   f. 0,2 M DTT	1 μl
   g. RNasin (Promega)	1 μl
   h. liniowa matryca DNA	1 μl
   i. Polimeraza RNA (Promega)	1 μl

3. Delikatnie wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj (10 sek. w mikrocentryfudze).
4. Inkubuj przez 2-4 godziny w temperaturze 37° C, osłaniając probówkę folią aluminiową, aby zapobiec fotowyblakaniu fluoroforu.
5. Dodaj 1 μl 1 mg/ml DNazy wolnej od RNaz (Promega) w celu degradacji matrycy DNA.
6. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37° C.
7. Dodaj 79 μl 20 mM EDTA (pH 8,0), aby zatrzymać reakcję.
8. Pobierz 1 μl do osobnej probówki, oznakuj jako „input” i zachowaj.
9. Przepuść mieszaninę reakcyjną przez kolumnę G50 1 ml (patrz Materiały i Metody), co pozwoli na usunięcie niewbudowanych nukleotydów przy jednoczesnym zachowaniu pełnowymiarowego mRNA.
10. Skoncentruj RNA poprzez precypitację etanolem:
    1. Dodaj 250 μl 100% etanolu, 10 μl 7M CH₃COONH₄, 1 μl RNA nośnikowego (tRNA drożdżowe, 10 μg/μl) lub 1 μl glikogenu (20 mg/ml).
    2. Wymieszaj dokładnie i zamroź do stanu stałego w temperaturze -80° C przez >30 minut lub na suchym lodzie przez 15 minut.
    3. Wiruj z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze przez 15 minut, odlej nadosad.
    4. Przemyj 150 μl 75% etanolu.
    5. Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze, odlej nadosad.
    6. Osusz osad w temperaturze 37° C przez 3 minuty, upewniając się, że cały etanol odparował.
11. Resuspenduj w 1 μl DEPC-H₂O i pobierz 1 μl do osobnej probówki, oznakuj jako „incorporated”.
12. Wyznacz procent wbudowania i rozcieńcz RNA do stężenia 50 nM (patrz Materiały i Metody w celu obliczeń).
13. RNA należy zamrozić w aliquotach po 5 μl do jednorazowego użycia, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania; można je przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80° C.

Część 2: Przygotowanie do mikroiniekcji.

1. Przygotowanie RNA:
   Odmrozić alikwot RNA (50 nM) i denaturować RNA w temperaturze 70° C przez 3-5 minut. Wirować przez 10 minut w mikrocentryfudze w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością, aby usunąć wszelkie cząstki, a następnie przechowywać na lodzie.
2. Przygotowanie oocytów:
   1. Chirurgicznie usunąć jajnik od samic Xenopus laevis (Nasco).
   2. Pokroić fragmenty jajnika Xenopus laevis i umieścić w probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy (patrz Materiały i Metody).
   3. Wstrząsać delikatnie w temperaturze 18° C przez 15 minut lub do momentu, aż oocyty zostaną widocznie oddzielone od jajnika. Ze względu na zmienność między partiami, czas traktowania kolagenazą może się różnić i powinien być uważnie monitorowany poprzez inspekcję wizualną w celu zapewnienia defolikulacji.
   4. Pozwolić oocytom osiąść w probówce, usunąć roztwór i przemyć oocyty buforem MBSH (patrz Materiały i Metody).
   5. Powtórzyć przemywanie jeszcze dwukrotnie, łącznie trzy razy. Ten protokół izolacji oocytów jest podobny do opisanego w Cohen et al., 209.
   6. Ręcznie wyselekcjonować oocyty w stadium III/IV (Dumont, 1972) w buforze MBSH pod standardowym mikroskopie stereoskopowym. Oocyty w stadium III są całkowicie nieprzezroczyste, ale białe, podczas gdy oocyty w stadium IV są nieco większe i nakrapiane pigmentem. Oocyty, które są lekko przezroczyste, są zbyt młode, a oocyty w pełni spigmentowane lub wykazujące polaryzację rozkładu pigmentu są zbyt stare.
3. Przygotowanie igieł:
   Wytworzyć i ściąć końcówki igieł do średnicy zewnętrznej ok. 0.05 mm. (Używamy kapilar Drummond Scientific 3,5 cala (nr zamówienia 3-0-203-G/X), wyciągacza mikropipet Sutter Instrument Co. oraz ściągacza WPI Inc.).

Część 3: Mikroiniekcja

1. Skalibrować igłę za pomocą DEPC-H₂O, aby dostarczała 2 nl na jedną iniekcję. Wypełniamy igłę od strony przedniej, korzystając z mikrowstrzykiwacza sterowanego gazem (patrz Materiały i Metody), a wielkość kropli kalibrujemy za pomocą mikrometru.
2. Wprowadzić RNA do igły.
3. Umieścić wyselekcjonowane oocyty w naczyniu do iniekcji zawierającym bufor MBSH. Mikrowstrzykiwania przeprowadzamy w naczyniu z warstwą czarnej pianki gumowej. Blade oocyty są dobrze widoczne na białym tle.
4. Ostrożnie wstrzyknąć do każdego oocytu 2 nl RNA o stężeniu 50 nM.
5. Wypłukać pozostałe RNA, przemyć igłę za pomocą DEPC-H₂O i wprowadzić kolejną porcję RNA do iniekcji.

Część 4: Hodowla oocytów

1. Umieścić oocyty w studzience sterylnej płytki 24-dołkowej (Sigma Aldrich). Hodujemy do tysiąca oocytów na jedną studzienkę.
2. Usunąć bufor i zastąpić go 40 μl Oocyte Culture Medium (OCM; patrz Materiały i Metody) na studzienkę. Umieścić płytkę hodowlaną w szczelnym plastikowym pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotne środowisko podczas inkubacji.
3. Inkubować oocyty w temperaturze 18° C w przedziałach czasowych od 8 do 48 godzin.

Część 5: Fixacja, odwodnienie i przechowywanie oocytów

1. Oddziel martwe oocyty, a oocyty przeżywalne umieść w probówkach szklanych. Rutynowo obserwujemy przeżywalność >90%.
2. Umieść oocyty w fiksatywie MEMFA (patrz Materiały i Metody) i inkubuj przez 20 minut na kołysarce. Chroń oocyty przed światłem, owijając probówki folią aluminiową.
3. Przepłucz oocyty, usuwając fiksatyw i zastępując go równą objętością buforu MBSH. Powtórz to płukanie jeszcze raz, tak aby łącznie wykonać dwa płukania.
4. Przeprowadź odmywanie oocytów w bezwodnym metanolu:
   1. Usuń połowę objętości roztworu, zastępując ją metanolem.
   2. Powtórz krok „a” dwukrotnie.
   3. Usuń cały roztwór, zastępując go metanolem.
   4. Powtórz płukanie metanolem.
5. Oocyty można przechowywać w temperaturze -20° C do momentu obrazowania.

Część 6: Obrazowanie lokalizacji RNA za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Przed obrazowaniem należy dodać medium przejaśniające Murraya (2:1 benzożeniu benzylowy-alkohol benzylowy) do szklanego naczynia FluoroDish (WPI Inc.), aby pokryć powierzchnię obrazowania.
2. Ostrożnie przenieść oocyty z metanolu do naczynia FluoroDish, minimalizując objętość przeniesionego metanolu.
3. Wykonać obrazowanie przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego (pomyślnie zastosowano Zeiss LSM510 oraz Leica TCS SP2).

Rycina 1: Wizualizacja subkomórkowej lokalizacji RNA poprzez mikroiniekcję transkryptów znakowanych fluorescencyjnie.  A.  Po mikroiniekcji RNA znakowane Alexa Fluor 546 jest początkowo ograniczone do jądra komórkowego. B. Po ośmiu godzinach hodowli w cytoplazmie oocytu widoczne jest równomiernie rozmieszczone, znakowane fluorescencyjnie kontrolne RNA. C. Można jednak zaobserwować fluorescencyjnie znakowane RNA zawierające sekwencje rekrutujące aparat transportowy w procesie lokalizacji subkomórkowej w biegunie wegetatywnym oocytu (w kierunku dołu). Pasek skali = 50 μm.

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj protokół wizualizacji lokalizacji mRNA w oocytach Xenopus. Metoda ta, wykorzystująca fluorescencyjnie znakowane transkrypty RNA, charakteryzuje się wyższym stosunkiem sygnału do szumu niż uzyskiwany wcześniej przy użyciu transkryptów znakowanych digoksygeniną i jest prostsza oraz szybsza niż podejścia oparte na hybrydyzacji in situ (Mowry and Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Stosując tę metodę, możemy wprowadzać mutacje w sekwencjach RNA i szybko testować ich funkcję in vivo. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor Tx 10X
60 mM MgCl22 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM spermidyny-HCl
mieszanina 20x cap/NTP
10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM analog czapeczki G(ppp)G (New England Biolabs)
kolumna G-50
Nawodnić 5 g kulek Sephadex G-50 (Sigma Aldrich) w 100 ml odjonizowanej wody H2O2O. Poddać działaniu DEPC przez 30 min. i wysterylizować w autoklawie. Niedopełniony zapas przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodać następujące roztwory wolne od RNaz: 0,5 ml 0,2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8,0 0,5 ml 20% SDS Przechowywać gotowy roztwór G-50 w temperaturze 4°C ° C. Wyjąć i usunąć tłok z 3 ml strzykawki (BD Biosciences), a następnie umieścić korpus strzykawki w 15 ml probówce stożkowej (Corning). Zatkać strzykawkę niewielką ilością wełny szklanej (czop o rozmiarze około połowy monety jednocentowej). Dokładnie wymieszaj roztwór G-50, aby resuspendować koraliki. Do pustej kolumny dodać 2 ml roztworu G-50. Wirować przez 1 minutę przy 1000 x g g w wirówce laboratoryjnej. Dodać 200 μoddejonizowana H2O traktowana DEPC2Do każdej kolumny. Wirować. Powtórzyć płukanie jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy cykle płukania. Przenieś zawartość strzykawki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
Roztwór kolagenazy
75 mg kolagenazy z Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0,1 M KPO3+ (pH 7,4)
bufor MBSH
88 mM NaCl 1 mM KCl 2,4 mM NaHCO33 0,82 mM MgSO44 X 7H2O 0,33 mM Ca(NO3)23)2 4 h x2O 0,41 mM CaCl22 X 6h2O 10 mM HEPES (pH 7,6)
Pożywka do hodowli oocytów
50% pożywki L15 15 mM HEPES (pH 7,6) 1 mg/ml insuliny 100 mg/ml gentamycyny 50 J/ml nystatyny 50 J/ml penicyliny 50 mg/ml streptomycyny
roztwór MEMFA
0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO44 3,7% formaldehydu
Obliczanie wydajności RNA
Wyznaczenie CPM w "wejście" i "włączony" próbki przy użyciu standardowego licznika scyntylacyjnego. wbudowanie = ("włączony") / (10 x "wejście") Typowe wartości wbudowania mieszczą się w zakresie od ok. 0,03 do 0,10. Maksymalne teoretyczne wydajności dla różnych polimeraz: T7, T3, SP6 – 2,64 μg Wydajność reakcji w μg = (maksymalna wydajność użytej polimerazy) X (inkorporacja) Rozcieńczyć RNA do stężenia 50 nM = (μg RNA) / 320 / (długość RNA w zasadach) / (5X10-8) Reakcja ta zazwyczaj daje wydajność rzędu ~50-100 μRNA w stężeniu 50 nM.