Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Podsumowanie

Wizualizacja transportu RNA in vivo odbywa się poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie mikroskopię konfokalną.

Streszczenie

Lokalizacja RNA to konserwatywny mechanizm ustalania polaryzacji komórek. MRNA Vg1 lokalizuje się w biegunie roślinnym oocytów Xenopus laevis i działa w celu przestrzennego ograniczenia ekspresji genu białka Vg1. Ścisła kontrola dystrybucji Vg1 w ten sposób jest wymagana dla prawidłowej specyfikacji listka zarodkowego w rozwijającym się zarodku. Elementy sekwencji RNA w 3' UTR mRNA, element lokalizacyjny Vg1 (VLE) są wymagane i wystarczające do bezpośredniego transportu. Aby zbadać rozpoznawanie i transport mRNA Vg1 in vivo, opracowaliśmy technikę obrazowania, która umożliwia obszerną analizę mechanizmów transportu kierowanego przez transfaktora za pomocą prostego odczytu wizualnego.

Aby zobrazować lokalizację RNA, syntetyzujemy fluorescencyjnie znakowane RNA VLE i mikrowstrzykujemy ten transkrypt do poszczególnych oocytów. Po hodowli oocytów, aby umożliwić transport wstrzykniętego RNA, oocyty są utrwalane i odwadniane przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja wzorców lokalizacji mRNA zapewnia odczyt do monitorowania całego szlaku transportu RNA i do identyfikacji ról w kierowaniu transportem RNA dla elementów cis-działających w transkryptach i czynnikach transakcyjnych, które wiążą się z VLE (Lewis i wsp., 2008, Messitt i wsp., 2008). Rozszerzyliśmy tę technikę poprzez kolokalizację z dodatkowymi RNA i białkami (Gagnon i Mowry, 2009, Messitt i wsp., 2008) oraz w połączeniu z rozerwaniem białek motorycznych i cytoszkieletu (Messitt i wsp., 2008) w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw lokalizacji mRNA.

Protokół

Część 1: Transkrypcja fluorescencyjnie znakowanego mRNA.

1. Linearyzować plazmidowy DNA zawierający element lokalizacyjny RNA lub inną istotną sekwencję i ponownie zawiesić w stężeniu 1 μg/μl za pomocą H₂O poddanego działaniu DEPC. Matryca DNA musi mieć miejsca promotorowe do transkrypcji przez polimerazę RNA T7, SP6 lub T3.
2. Dodaj następujące odczynniki do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml:

   a. Bufor 10X Tx (patrz M&M)	2 μl
   b. 20-krotna mieszanka nakrętki/NTP (patrz M&M)	1 μl
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 μl
   d. UTP, [α-32P](1 μCi/μl) (Perkin Elmer)	1 μl
   e. DEPC-H2O	11 μl
   f. 0,2 mln naziemnej telewizji cyfrowej	1 μl
   g. RNasin (Promega)	1 μl
   h. matryca liniowa DNA	1 μl
   i. Polimeraza RNA (Promega)	1 μl

3. Delikatnie wymieszać odczynniki i krótko odwirować (10 sek. w mikrowirówce).
4. Inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 37°C, przykrywając probówkę folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforu.
5. Dodać 1 μl 1 mg/ml DNazy wolnej od RNaz (Promega) w celu degradacji matrycowego DNA.
6. Inkubować 15 minut w temperaturze 37°C.
7. Dodać 79 μl 20 mM EDTA (pH 8,0), aby zatrzymać reakcję.
8. Pobrać 1 μl do osobnej probówki, oznaczonej jako "wejście" i zaoszczędzić.
9. Reakcja wirowania przez 1 ml kolumny G50 (patrz Materiały i metody), która będzie zawierać nieinkorporowane nukleotydy, wykluczając mRNA o pełnej długości.
10. Zagęścić RNA przez wytrącanie etanolu:
    1. Dodać 250 μl 100% etanolu, 10 μl 7M CH₃COONH₄, 1 μl nośnika RNA (tRNA drożdży, 10 μg/μl) lub 1 μl glikogenu (20 mg/ml).
    2. Dobrze wymieszaj i zamrażaj do zestalenia w temperaturze -80°C przez >30 minut lub na suchym lodzie przez 15 minut.
    3. Wirować z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 15 minut, zdekantować supernatant.
    4. Umyć 150 μl 75% etanolu.
    5. Wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością w mikrowirówce, zdekantować supernatant.
    6. Suszyć granulki w temperaturze 37°C przez 3 minuty, upewniając się, że cały etanol wyparował.
11. Zawiesić ponownie w 11 μl DEPC-H₂O i usunąć 1 μl do oddzielnej probówki, oznaczonej jako "wbudowana".
12. Określić procentową inkorporację i rozcieńczyć RNA do 50 nM (patrz Materiały i metody obliczeń).
13. RNA powinno być zamrożone w podwielokrotnościach o objętości 5 μl, do jednorazowego użytku, aby uniknąć cykli zamrażania / rozmrażania i może być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80° C.

Część 2: Przygotowanie do mikroiniekcji.

1. Przygotowanie RNA:
   Rozmrozić podwielokrotność RNA (50 nM) i zdenaturować RNA w temperaturze 70 ° C przez 3-5 minut. Wirować przez 10 minut w temperaturze pokojowej mikrowirówkę z maksymalną prędkością, aby usunąć wszelkie cząstki stałe i trzymać na lodzie.
2. Przygotowanie oocytów:
   1. Chirurgicznie usunąć jajnik od samic Xenopus laevis (Nasco).
   2. Przyciąć kawałki jajnika Xenopus laevis do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy (patrz Materiały i metody).
   3. Wstrząsać delikatnie w temperaturze 18°C przez 15 minut lub do momentu, gdy oocyty zostaną wyraźnie oddzielone od jajnika. Ze względu na różnice w poszczególnych partiach, czas leczenia kolagenazą może się różnić i powinien być uważnie monitorowany poprzez kontrolę wzrokową w celu zapewnienia defolikulacji.
   4. Pozwól oocytom osiadły w probówce, usuń roztwór i przemyj oocyty buforem MBSH (patrz Materiały i Metody).
   5. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania. Ten protokół izolacji oocytów jest podobny do tego opisanego w Cohen i in., 2009.
   6. Ręczne sortowanie oocytów w stadium III/IV (Dumont, 1972) w buforze MBSH pod standardowym mikroskopem preparacyjnym. Oocyty w stadium III są całkowicie nieprzezroczyste, ale białe, podczas gdy oocyty w stadium IV są nieco większe i nakrapiane pigmentem. Oocyty, które są lekko przezroczyste, są zbyt młode, a oocyty, które są w pełni pigmentowane lub wykazują spolaryzowaną dystrybucję pigmentu, są zbyt stare.
3. Przygotowanie igły:
   Pociągnij i ukosuj igły do średnicy zewnętrznej ~ 0,05 mm. (Używamy 3,5-calowych kapilar Drummond Scientific (zamówienie # 3-000-203-G/X), ściągacza do mikropipet Sutter Instrument Co. i bevelellera WPI Inc.)

Część 3: Mikroiniekcja

1. Skalibrować igłę za pomocą DEPC-H₂O, aby dostarczyć 2 nl na wstrzyknięcie. Ładujemy naszą igłę od przodu za pomocą mikrowtryskiwacza napędzanego gazem (patrz Materiały i metody) i kalibrujemy wielkość kropli za pomocą mikrometru.
2. Załaduj RNA do igły.
3. Umieść posortowane oocyty w naczyniu iniekcyjnym zawierającym bufor MBSH. Mikroiniekujemy na naczyniu warstwę czarnej gumy piankowej. Blade oocyty dobrze wyróżniają się na białym tle.
4. Ostrożnie wstrzyknąć do każdego oocytu 2 nl RNA o długości fali 50 nM.
5. Wydalić RNA, przepłukać igłę DEPC-H₂O i załadować następny RNA do wstrzyknięcia.

Część 4: Hodowla oocytów

1. Umieść oocyty w studzience sterylnej 24-dołkowej płytki (Sigma Aldrich). Hodujemy do tysiąca oocytów w każdym dołku.
2. Usunąć bufor i zastąpić 400 μl Ocyte Culture Medium (OCM; patrz Materiały i Metody) na studzienkę. Umieść płytkę hodowlaną w hermetycznym plastikowym pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgotne środowisko podczas hodowli.
3. Inkubować oocyty w temperaturze 18 ° C przez punkty czasowe od 8 do 48 godzin.

Część 5: Utrwalanie, odwadnianie i przechowywanie oocytów

1. Uporządkuj wszelkie martwe oocyty i umieść ocalałe oocyty w szklanych fiolkach. Rutynowo obserwujemy >90% przeżywalności.
2. Umieść oocyty w utrwalaczu MEMFA (patrz Materiały i metody) i kołysz przez 20 minut. Chroń oocyty przed światłem, przykrywając folią aluminiową.
3. Przemyć oocyty, usuwając utrwalacz i zastępując równą objętością buforu MBSH. Powtórz to pranie jeszcze raz, w sumie dwa prania.
4. Przemyć oocyty do bezwodnego metanolu:
   1. Usuń połowę objętości, zastąp metanolem.
   2. Powtórz krok "a" dwa razy.
   3. Usuń cały roztwór, zastąp go metanolem.
   4. Powtórzyć mycie metanolem.
5. Oocyty mogą być przechowywane w temperaturze -20°C do momentu uzyskania gotowości do obrazowania.

Część 6: Obrazowanie lokalizacji RNA za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Przed obrazowaniem dodaj pożywkę czyszczącą Murray's Clearing Medium (2:1 benzoesan benzylu-alkohol benzylowy) do szklanego dna FluoroDish (WPI Inc.), aby pokryć powierzchnię obrazowania.
2. Ostrożnie przenieś oocyty z metanolu do FluoroDish, minimalizując objętość przenoszonego metanolu.
3. Obraz na odwróconym mikroskopie konfokalnym (z powodzeniem użyliśmy Zeiss LSM510 i Leica TCS SP2).

Rysunek 1: Wizualizacja lokalizacji subkomórkowego RNA poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów.  A.  Po mikroiniekcji, RNA znakowane Alexa Fluor 546 jest początkowo ograniczone do jądra. Ur. Po ośmiu godzinach hodowli można zobaczyć znakowany fluorescencyjnie kontrolny RNA równomiernie rozmieszczony w cytoplazmie oocytu. C. Jednak znakowane fluorescencyjnie sekwencje RNA zawierające sekwencje, które rekrutują maszynerię transportową, można zaobserwować w procesie lokalizacji subkomórkowej do bieguna roślinnego oocytu (w kierunku dołu). Podziałka = 50 μm.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiliśmy protokół wizualizacji lokalizacji mRNA w oocytach Xenopus . Ta metoda, wykorzystująca znakowane fluorescencyjnie transkrypty RNA, ma wyższy stosunek sygnału do szumu niż wcześniej uzyskiwany w przypadku transkryptów znakowanych digoksygeniną i jest prostsza i szybsza niż podejścia oparte na in-situ (Mowry i Melton, 1992, Gautreau i wsp., 1997). Za pomocą tej metody możemy zaprojektować mutacje sekwencji RNA i szybko przetestować funkcję in vivo . Ponadto, dzięki zastosowani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10X Tx buffer
60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM spermidyna-HCl
10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)
G-50 column
Hydrate 5 g koralików Sephadex G-50 (Sigma Aldrich) w 100 ml dejonizowanego H2O. Leczenie DEPC przez 30 minut i autoklaw. Niekompletny zapas należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed użyciem dodaj następujące roztwory wolne od RNaz: 0,5 ml 0,2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8,0 0,5 ml 20% SDS Przechowywać kompletny roztwór G-50 w temperaturze 4 ° C. Wyjmij i wyrzuć tłok ze strzykawki 3 ml (BD Biosciences) i umieść cylinder strzykawki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (Corning). Zatkaj strzykawkę niewielką ilością waty szklanej (zatyczka o wielkości około połowy grosza). Zakręć kompletny roztwór G-50, aby ponownie zawiesić koraliki. Dodaj 2 ml roztworu G-50 do pustej kolumny. Wiruj przez 1 minutę przy 1,000 x g w wirówce stołowej. Dodaj 200 μ l Dejonizowany H2O poddany działaniu DEPC do każdej kolumny. Spin. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania. Wyjmij cylinder strzykawki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
roztwór kolagenazy
75 mg kolagenazy z Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0,1 M KPO3+ (pH 7,4)
MBSH buffer
88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2 O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7,6)
Pożywka do hodowli oocytów
50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7,6) 1 mg/ ml insuliny 100 mg/ml gentamycyny 50 U/ml nystatyny 50 U/ml penicyliny 50 mg/ml streptomycyny
Roztwór MEMFA
0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3,7% formaldehydu
< p class="jove_content">Obliczanie wydajności RNA
Określ CPM w próbkach "wejściowych" i "włączonych" za pomocą standardowego licznika scyntylacyjnego. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical wartości inkorporacji mieszczą się w zakresie od ~0,03 do 0,10, Maksymalne teoretyczne plony dla różnych polimeraz: T7, T3, SP6 - 2,64 μ g Wydajność reakcji w μ g = (maksymalna wydajność użytej polimerazy) X (inkorporacja) Rozcieńczyć RNA do 50 nM = (μ g RNA) / 320 / (długość RNA w zasadach) / (5X10-8) Reakcja zwykle daje ~50-100 μ l RNA przy 50 nM.