Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Streszczenie

Opisano szczegółowy protokół krystalizacji białek błonowych z wykorzystaniem mezofaz lipidowych. Metoda ta była określana różnie jako metoda lipidowej fazy kubicznej lub metoda in meso. Wykazano, że metoda ta jest bardzo wszechstronna, ponieważ została wykorzystana do rozwiązania struktur krystalograficznych rentgenowskich białek prokariotycznych i eukariotycznych, białek monomerowych, homo- i hetero-multimerycznych, zawierających i niezawierających chromoforów, a także białek o strukturze alfa-helikalnej i beta-beczułkowej. Ostatnimi sukcesami w zastosowaniu krystalizacji in meso są ludzkie zmodyfikowane genetycznie receptory beta2-adrenergiczne oraz adenozynowe A2a sprzężone z białkiem G. Przedstawiono protokoły rekonstytucji białka błonowego w mezofazie opartej na monooleinie oraz przygotowania krystalizacji w trybie manualnym. Dodatkowe kroki w całym procesie, takie jak pozyskiwanie kryształów, zostaną omówione w przyszłych artykułach wideo. Czas wymagany do przygotowania mezofazy z białkiem i manualnego ustawienia płytki do krystalizacji wynosi około jednej godziny.

Protokół

Ważnym obszarem zainteresowań w dziedzinie biologii strukturalnej i funkcjonalnej jest błona biologiczna (Rysunek 1). Błona, która otacza komórkę oraz obecne w niej organella subkomórkowe, jest strukturą o grubości molekularnej, składającą się z zaledwie dwóch warstw cząsteczek lipidów i usianą białkami. Interesująca jest struktura i funkcja zarówno lipidów, jak i białek. Niniejszy artykuł koncentruje się jednak wyłącznie na białkach błonowych.

Lepszego zrozumienia sposobu, w jaki białka błonowe funkcjonują na poziomie molekularnym, poszukuje się z dwóch powodów. Po pierwsze, daje to satysfakcję intelektualną z wiedzy o tym, jak one działają. Po drugie, znajomość mechanizmu działania białka zawsze stwarza perspektywę możliwości naprawy w przypadku jego nieprawidłowego funkcjonowania, a także poprawy lub nawet modyfikacji pod kątem konkretnych zastosowań. Projektowanie leków jest oczywistym rezultatem tego rodzaju prac. Jednym z podejść do ustalenia, jak białko błonowe działa na poziomie molekularnym, jest wyznaczenie jego struktury. Wiąże się to z ustaleniem położenia w przestrzeni trójwymiarowej wszystkich atomów, lub przynajmniej wszystkich atomów poza wodorem, które tworzą białko. Metodą, której używamy w tym celu, jest makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX). Rycina 2 przedstawia przykład białka błonowego, którego struktura została wyznaczona za pomocą MX. Do przeprowadzenia MX wymagany jest kryształ białka o jakości dyfrakcyjnej.

Krystalografia makromolekularna obejmuje wiele etapów niezbędnych do wyznaczenia struktury, co zilustrowano na Ryc. 3. Typowo obejmują one identyfikację docelowego białka błonowego, a następnie jego produkcję, oczyszczanie i krystalizację. Pomiary dyfrakcyjne kryształu wykonuje się przy użyciu laboratoryjnego źródła promieniowania rentgenowskiego lub synchrotronu. Dane dyfrakcyjne są przetwarzane w celu uzyskania mapy gęstości elektronowej, do której następnie dopasowuje się model molekularny. Model po doprecyzowaniu może służyć do badania mechanizmu działania białka oraz do projektowania leków w oparciu o strukturę.

Celem niniejszego artykułu jest pokazanie, w jaki sposób otrzymujemy kryształy białek błonowych o jakości dyfrakcyjnej z wykorzystaniem mezofaz lipidowych, stosując tzw. metodę in meso. Niedawny przegląd tej metody oraz zakresu jej zastosowań znajduje się w Literaturze 1 (Caffrey, 2009). Szczegółowy protokół krok po kroku, który tutaj zastosujemy, opisano w Literaturze 2 (Caffrey i Cherezov, 2009).

Schemat blokowy podsumowujący etapy oraz czas wymagany do przygotowania próby krystalizacji białek błonowych in meso przedstawiono na Rysunku 4. Niniejszy artykuł obejmuje etapy ujęte w czerwonych liniach przerywanych.

Część 1: Przygotowanie płytek do krystalizacji

1. Umieść zylanizowane szkiełko mikroskopowe na blacie roboczym.
2. Zdejmij papierową warstwę ochronną z jednej strony paska perforowanej, dwustronnej taśmy dystansowej (dostępnej w handlu, patrz Tabela specyficznych odczynników i sprzętu poniżej).
3. Przyklej taśmę stroną klejącą do powierzchni szkiełka.
4. Docisnąć taśmę do szkiełka za pomocą wałka lub rolki. Aby chronić dno studni, między taśmę a wałek można włożyć folię aluminiową.
5. Zdejmij drugą papierową warstwę ochronną z taśmy, aby odsłonić jej górną powierzchnię klejącą.
6. Umieść poszczególne zylanizowane szkiełka nakrywki w bliskiej odległości od płytki, aby umożliwić szybkie i efektywne zamknięcie studni natychmiast po zakończeniu ich napełniania.

Część 2: Przygotowanie strzykawki z lipidami

1. Umieścić lipid (najczęściej monooleinę) w bloku grzewczym w temperaturze 45 °C na 3 minuty, aby go stopić.
2. Podczas topnienia lipidu przygotować dwie szczelne strzykawki Hamiltona o pojemności 100 μL do etapu mieszania lipidu z białkiem. Zdjąć teflonową tulejkę ze strzykawki, która będzie zawierać roztwór białka. Obok niej ustawić strzykawkę przeznaczoną do lipidu (pozostawiając na niej tulejkę).
3. Podłączyć sprzęgało (patrz poniższa Tabela specyficznych odczynników i sprzętu oraz literatura 3 (Cheng et al., 1998)) do strzykawki z lipidem. Dokręcić sprzęgało do strzykawki palcami, unikając nadmiernego dokręcenia. Wyjąć tłok z korpusu strzykawki z lipidem.
4. Należy pamiętać, że przed przejściem do kolejnego kroku lipid musi być stopiony. Ustawić pipetę na 30 μL i powoli pobrać około 30 μL stopionego lipidu. Powoli wprowadzić jak największą ilość stopionego lipidu do otwartego końca strzykawki, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
5. Włożyć tłok do korpusu w taki sposób, aby stykał się ze stopionym lipidem, a następnie powoli przesuwać tłok w górę korpusu, trzymając strzykawkę pionowo, zgodnie z instrukcją w materiale wideo. Pęcherzyki powietrza, które mogły zostać przypadkowo uwięzione, powinny w tym procesie wypłynąć na powierzchnię i zostać usunięte.
6. Starannie określić objętość lipidu w strzykawce, odczytując wartości z podziałki na korpusie strzykawki.
7. Nasunąć tulejkę na igłę wystającą ze sprzęgała. Za pomocą tłoka wtłoczyć stopiony lipid w górę korpusu, a następnie powoli i delikatnie do igły znajdującej się wewnątrz sprzęgała.

Część 3: Przygotowanie strzykawki z białkiem

1. Przed przystąpieniem do prób krystalizacji roztwór białka należy wirować z prędkością 14,000 g przez 5 do 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia dużych agregatów. Należy wyjąć roztwór białka z lodu i pozwolić mu wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej.
2. Należy obliczyć objętość roztworu białka niezbędną do utworzenia fazy kubicznej przy pełnym uwodnieniu lub w bliskim mu stanie. Dla monooleiny w temperaturze 20 °C pełne uwodnienie wodą występuje przy wartości bliskiej 40 % wody (masowo), zgodnie z wykresem fazowym⁵ (Rysunek 5).
3. Za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 25 lub 50 μL należy pobrać wymaganą objętość roztworu białka. Następnie należy przenieść roztwór na teflonową końcówkę tłoka w cylindrze strzykawki z białkiem, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza.
4. Należy ostrożnie wyciągnąć igłę i zmierzyć objętość roztworu białka w strzykawce. Powinna ona odpowiadać wartości pobranej w poprzednim kroku.
5. Należy powoli przesuwać roztwór białka w górę cylindra, aż zrówna się on z jego otwartym końcem.
6. Strzykawkę z białkiem należy wkręcić w otwarty koniec sprzęgła przymocowanego do strzykawki z lipidem. Kluczowe jest, aby nie dokręcać urządzenia zbyt mocno. Zbyt silne dokręcenie zmontowanego urządzenia do mieszania na tym etapie uszkodzi tuleje i spowoduje wycieki. Zbyt słabe dokręcenie również doprowadzi do wycieków.

Część 4: Mieszanie roztworu białka z lipidem: tworzenie mezofazy

1. Aby wymieszać zawartość, przesuń tłok po stronie białka w zmontowanym urządzeniu mieszającym do końca, używając kciuka lub palca wskazującego, aby wtłoczyć roztwór białka ze strzykawki z białkiem, przez sprzęgacz do strzykawki z lipidami.
2. Następnie użyj tłoka po stronie lipidów, aby wtłoczyć zawartość strzykawki z lipidami z powrotem przez sprzęgacz do strzykawki z białkiem.
3. Proces ten powtarzaj wielokrotnie; czasami wymagane jest nawet sto lub więcej przejść, aby uzyskać jednorodną mezofazę. Na początku mieszania ruch materiału w przód i w tył przez sprzęgacz może być nierównomierny, a czasami konieczne jest użycie dodatkowej siły, aby wymieszać zawartość. Początkowe mieszanie zazwyczaj wiąże się z pojawieniem się niejednorodnego zmętnienia w próbce. W miarę postępu homogenizacji tekstura staje się bardziej jednolita i charakterystyczna dla lepkiej fazy kubicznej, podobnie jak wygląd wizualny powstającej mezofazy kubicznej.
4. Jeśli warunki są odpowiednie i utworzy się faza kubiczna, dyspersja w cylindrze strzykawki powinna wydawać się optycznie przezroczysta. W związku z tym oznaczenia na cylindrze strzykawki powinny być wyraźnie widoczne przez znajdującą się w nim mezofazę.
5. Bardzo delikatne schłodzenie próbki podczas mieszania poprzez umieszczenie mieszadła strzykawkowego na krótki czas na lodzie może przyspieszyć homogenizację i uzyskanie przezroczystości. Należy jednak uważać, aby nie schłodzić próbki zbyt mocno.
6. Należy unikać ekstremalnie intensywnego mieszania, ponieważ może to spowodować wzrost temperatury próbki z powodu grzania tarcia³.

Część 5: Napełnianie dozownika

1. Wyjmij igłę oraz tłok z 10-μL Strzykawka Hamiltona. Pozostaw zamontowaną tulejkę teflonową.
2. Za pomocą małej monety zdejmij nakrętkę mocującą z dozownika.
3. Przy całkowicie wycofanym ramieniu zapadkowym należy wsunąć strzykawkę – bez tłoka i igły – przez pierścień mocujący dozownika.
4. Założyć nakrętkę mocującą, stroną z uszczelką w kierunku strzykawki, i mocno przykręcić ją do otwartego końca strzykawki.
   Należy zadbać o to, aby strzykawka była odpowiednio wycentrowana w pierścieniu mocującym, a jej korpus znajdował się równolegle do ramienia zapadkowego. Oba parametry można ocenić wizualnie. Spełnienie tych dwóch warunków jest kluczowe dla uniknięcia wycieków.
5. Przełożyć tłok przez pierścień zaciskowy, odkręcając nakrętkę zaciskową o kilka obrotów, a następnie wprowadzić tłok do otwartego końca strzykawki. W pełni docisnąć ramię zapadki. Wsunąć tłok do cylindra i sprawdzić, czy porusza się on swobodnie i osiowo wewnątrz cylindra. Aby ułatwić swobodne przemieszczanie się tłoka, można poluzować śrubę na prowadnicy. Należy upewnić się, że tłok porusza się bez oporu. Docisnąć tłok, aż jego teflonowa końcówka wyrówna się z punktem zero. μL skalowanie na tulei. Jeśli śruba na prowadnicy została poluzowana, należy ją ponownie dokręcić i sprawdzić, czy tłok porusza się swobodnie.
6. Przesuń tłok po jednej stronie złożonej jednostki mieszającej do pozycji zero μL znacznika graduacji w celu przeniesienia mezofazy do drugiej strzykawki i łącznika.
7. Odłącz pustą strzykawkę (z założonym tuleją) od jednostki mieszającej i natychmiast podłącz załadowaną strzykawkę – z dołączonym sprzęgaelem – do gwintowanego zakończenia 10-μL strzykawka dozująca. Stopień szczelności połączenia jest krytyczny, co zostało już zaznaczone.
8. Napełnij strzykawkę dozującą, naciskając tłok strzykawki 100-μL strzykawkę w taki sposób, aby mezofaza przeszła przez sprzęgacz.
9. Przymocuj krótką igłę o płaskim zakończeniu do stalowego zakończenia strzykawki dozującej i ostrożnie dokręć ją.
10. Zaciśnij tłok w ramieniu zapadkowym, dokręcając nakrętkę w pierścieniu zaciskowym. Należy uważać, aby nie dokręcić nakrętki zbyt mocno, ponieważ może to spowodować zarysowanie i odkształcenie tłoka, co uczyni go niezdatnym do użytku. Ważne jest, aby zakres ruchu ramienia zapadkowego w pozycji zaciśniętej był ograniczony do maksymalnie jednej cala, tak jak pokazano w filmie. Po przekroczeniu tej wartości tłok może ulec wygięciu, co może doprowadzić do niepowodzenia podania.
11. Kilkakrotnie naciśnij bęben zapadkowy, aby przesunąć tłok w cylindrze, wypełniając w ten sposób wolną przestrzeń igły i przygotowując ją do podania. Krok ten należy powtarzać (do dziesięciu razy), aż z końcówki igły zacznie wydostawać się ciągła nić mezofazy.
12. Próby krystalizacji należy rozpocząć niezwłocznie, ponieważ niektóre białka są niestabilne w fazie kubicznej bez dodatku czynnika wytrącającego.

Część 6: Przygotowanie płytek do krystalizacji

1. Aby ułatwić napełnianie, umieść wielodołkową płytkę krystalizacyjną oraz szkiełko nakrywkowe na powierzchni podwyższonej o kilka cali nad blatem roboczym. Optymalny kontrast i lepsza widoczność są osiągane, gdy powierzchnia jest lekko ciemna.
2. Zhomogenizuj roztwory precypitantu i odkręć fiolki. Ustaw pipetę do dozowania precypitantu na 1 μL.
3. Trzymając strzykawkę dozującą pionowo w jednej ręce, za pomocą wolnej ręki ustaw końcówkę igły w centrum i bezpośrednio nad dnem dołka numer 1. Naciśnij przycisk w dozowniku powtarzalnym, aby wycisnąć kroplę mezofazy na powierzchnię szkła. Objętość kropli wynosi 200 nL przy użyciu standardowego dozownika powtarzalnego ze strzykawką 10 μL. Końcówka igły powinna znajdować się nie więcej niż kilkaset mikrometrów nad dnem dołka, aby zapewnić prawidłowe dozowanie.
4. Po napełnieniu 4 sąsiednich dołków mezofazą, nanieś 1 μL roztworu precypitantu na każdą kroplę mezofazy, używając pipety 2 μL i standardowych końcówek jednorazowych.
5. Jak najszybciej nałóż szkiełko nakrywkowe równo nad napełnione dołki, aby pokryć je jednorodnie. W celu zapewnienia szczelności wodnej, użyj szpatułki, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe w miejscu jego styku z odsłoniętą lepką powierzchnią taśmy dystansowej.
6. Proces dozowania mezofazy i precypitantu można powtarzać, aż wszystkie dołki na płytce zostaną napełnione i zamknięte.
7. Wyraźnie opisz płytkę w celu śledzenia próbek. Białka światłoczułe są zazwyczaj zabezpieczane poprzez owinięcie płytek folią aluminiową przed umieszczeniem ich w komorze inkubacyjnej.
8. Umieść płytki w komorze z kontrolowaną temperaturą, zazwyczaj w 20 °C.
9. Zgodnie z ustalonym harmonogramem sprawdzaj wzrost kryształów w dołkach za pomocą mikroskopu w świetle spolaryzowanym z obiektywem 10- lub 20-krotnym. Harmonogram stosowany w laboratorium autora jest następujący: dzień 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 i 60 po przygotowaniu. Uważnie obejrzyj kroplę mezofazy, regulując głębię ostrości w próbce o grubości 0,14 mm. Badanie należy przeprowadzić zarówno w świetle normalnym, jak i między skrzyżowanymi polaryzatorami.

Część 7: Reprezentatywne wyniki

Wygląd otrzymanych kryształów będzie się różnić w zależności od naturalnego koloru białka błonowego, polaryzacji światła użytego do inspekcji (lub jej braku) oraz metody i jakości oświetlenia. Rysunek 6 przedstawia kilka możliwych wariantów wyglądu kryształów. Naturalnie ubarwione białka błonowe rosnące in meso w świetle zwykłym mogą wyglądać tak, jak na Rysunku 6 (Panele b i d). Bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie kubicznej w świetle zwykłym mogą wyglądać tak, jak na Rysunku 6 (Panel e). Wreszcie, bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące in meso obserwowane w świetle spolaryzowanym mogą wyglądać tak, jak na Rysunku 6 (Panele a i c).

Kolejne etapy całego procesu wyznaczania struktury polegają na zbiorze i szybkim mrożeniu kryształów oraz na rejestracji i analizie dyfrakcji promieni Rentgena z nich uzyskanej. Tematy te zostaną omówione w osobnych artykułach JoVE.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie błony biologicznej ukazujące dwuwarstwę lipidową, w której oraz na której znajdują się różne rodzaje białek.

Rysunek 2. Struktura witaminy B₁₂ białko transportowe, BtuB, rozwiązane przy użyciu krystalografii rentgenowskiej (MX), a kryształy otrzymane metodą in meso metoda⁶ przedstawione w niniejszym artykule JoVE.

Rysunek 3. Cykl struktura-funkcja przedstawia wiele etapów związanych z pozyskiwaniem i wykorzystaniem pełnych informacji strukturalnych o białku.

Rycina 4. Schemat blokowy podsumowujący etapy produkcji kryształów białek błonowych metodą in meso. W niniejszym artykule JoVE omówiono wyłącznie kroki otoczone czerwoną przerywaną linią. Źródło: Reference 2.

Rysunek 5. Uproszczony wykres fazowy temperatura-skład dla układu lipid (monooleina)/woda. Próby krystalizacji przeprowadzono w 20 °C, gdzie lipid nasyca się wodą przy 40 % hydratacji. Szczegółowy wykres fazowy znajduje się w publikacji 5.

Rysunek 6. Kryształy białek błonowych rosnące w mezofazie lipidowej.
(a) białko transportujące witaminę B₁₂, BtuB⁶, (b) kompleks zbierający światło II⁷, (c) adhezyna/inwazyna OpcA⁸, (d) bakteriorodopsyna⁹, (e) transporter węglowodanów z Pseudomonas. Obrazy zarejestrowane w świetle normalnym (b,d,e) oraz między skrzyżowanymi polaryzatorami (a,c).

Dyskusja

Faza kubiczna jest delikatnym i dynamicznym środowiskiem, które może drastycznie zmieniać się pod wpływem modyfikacji szeregu zmiennych. W instrukcji trybu ręcznego nie jest możliwe opisanie konfiguracji prób krystalizacji in meso w sposób obejmujący wszystkie potencjalne problemy. Jednak wielu trudności można uniknąć, ćwicząc tę technikę przed zastosowaniem jej do kosztownych roztworów białek oraz zachowując umiar w nacisku przykładanym do strzykawek podczas mieszania. Prawidłowo wykonana metoda in meso może przynieść kryształy szerokiej gamy białek, których liczba stale rośnie.

Przedstawiony tutaj opis przygotowania prób krystalizacji in meso koncentruje się na trybie ręcznym. Proces ten może być, a często jest modyfikowany w celu ułatwienia zautomatyzowanego przygotowania płytek krystalizacyjnych w przypadkach wymagających wielkoskalowego przesiewu warunków krystalizacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór białka	Odczynnik	Różne	Różne
Lipid (monooleina)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	Różne
Roztwory wytręcające	Odczynnik	Różne	Różne
Woda oczyszczona	Odczynnik	EMD Millipore
Urządzenia do pipetowania	Narzędzie	Pipetman	Różne
Jednorazowe końcówki do pipet	Jednorazowe	Pipetman	Różne
Strzykawki szczelne dla gazów	Narzędzie	Hamilton Co	80265 (25-µl)
Igły do strzykawek	Narzędzie	Hamilton Co	7770-020 (rozmiar 22 G)
Złącze o wąskim przekroju*	Narzędzie	Hamilton Co	różne/EBS-LCP-2
Dozownik wielokrotny	Narzędzie	Hamilton Co	83700
Silanizowane szklane lamki do mikroskopu	Jednorazowe	Gold Seal	3010
Przedszkiełka do mikroskopu	Jednorazowe	Fisher Scientific	12-548C
Perforowana dwustronna taśma dystansowa	Jednorazowe	Saunders Corporation (dziurkowana)	ND
Pinceta	Narzędzie	Różne	ND
Wałek (brayer)	Narzędzie	Fisher Scientific	50820937
Kruszony lód	Kontrola temperatury	ND	ND
Chusteczki	Jednorazowe	ND	ND
Kalkulator	Narzędzie	Różne	ND
Notatnik laboratoryjny	Narzędzie	Różne	ND
* Szczegółowe informacje dotyczące samodzielnego wykonania złącza o wąskim przekroju znajdują się w referencji 3.