Krystalizacja białek błonowych do określania struktury przy użyciu mezofaz lipidowych

Summary

Tutaj opisana jest procedura zaimplementowana w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Błony Caffrey w celu ręcznego przeprowadzenia prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Abstract

Opisano szczegółowy protokół krystalizacji białek błonowych za pomocą mezofaz lipidowych. Metoda ta była różnie określana jako lipidowa faza sześcienna lub metoda mezo. Wykazano, że metoda ta jest dość wszechstronna, ponieważ była stosowana do rozwiązywania rentgenowskich struktur krystalograficznych białek prokariotycznych i eukariotycznych, białek monomerycznych, homo- i hetero-multimerycznych, zawierających chromofor i bezchromoforowych oraz białek alfa-helisowych i beta-beczkowych. Ostatnimi sukcesami wykorzystującymi w krystalizacji mezo są zmodyfikowane przez człowieka receptory sprzężone z białkiem beta2-adrenergicznym i adenozyny A2a G. Przedstawiono protokoły odtwarzania białka błonowego do mezofazy na bazie monooleiny oraz ustawiania krystalizacji w trybie ręcznym. Dodatkowe etapy całego procesu, takie jak zbieranie kryształów, zostaną omówione w przyszłych artykułach wideo. Czas potrzebny do przygotowania mezofazy obciążonej białkiem i ręcznego ustawienia płytki krystalizacyjnej wynosi około jednej godziny.

Protocol

Ważnym przedmiotem zainteresowania w dziedzinie biologii strukturalnej i funkcjonalnej jest błona biologiczna (Rysunek 1). Błona, która otacza komórkę i organelle subkomórkowe, gdy jest obecna, jest molekularnie cienką strukturą o średnicy zaledwie dwóch cząsteczek lipidów i jest wysadzana białkami. Interesująca jest struktura i funkcja w zastosowaniu zarówno do lipidów, jak i białek. Jednak skupienie się na tym artykule ogranicza się do białek błonowych.

Lepsze zrozumienie funkcjonowania białek błonowych na poziomie molekularnym jest poszukiwane z dwóch powodów. Po pierwsze, istnieje intelektualna satysfakcja wynikająca z wiedzy o tym, jak one działają. Po drugie, wiedząc, jak działa białko, zawsze istnieje perspektywa naprawienia go w przypadku nieprawidłowego działania lub ulepszenia lub nawet zmodyfikowania go pod kątem określonych zastosowań. Projektowanie leków jest oczywistym rezultatem tego typu prac. Jednym z podejść do ustalenia, jak działa białko błonowe na poziomie molekularnym, jest określenie jego struktury. Polega to na ustaleniu położenia w przestrzeni trójwymiarowej wszystkich atomów, a przynajmniej wszystkich atomów niebędących wodorem, z których składa się białko. Metodą, którą wykorzystujemy w tym celu jest makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX). Rysunek 2 przedstawia przykład białka błonowego, którego strukturę określono za pomocą MX. Do wykonania MX wymagany jest kryształ o jakości dyfrakcyjnej białka.

Oczywiście, istnieje wiele etapów związanych z określaniem struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej. Ilustruje to rysunek 3. Zazwyczaj obejmują one identyfikację docelowego białka błonowego, a następnie jego produkcję, oczyszczanie i krystalizację. Pomiary dyfrakcyjne są wykonywane na krysztale przy użyciu domowego lub synchrotronowego źródła promieniowania rentgenowskiego. Dane dyfrakcyjne są przetwarzane w celu uzyskania mapy gęstości elektronów, która jest następnie dopasowywana do modelu molekularnego. Model, po udoskonaleniu, może być wykorzystany do zbadania mechanizmu działania białka i do projektowania leków w oparciu o strukturę.

Głównym celem tego artykułu jest pokazanie, jak wytwarzamy kryształy o jakości dyfrakcyjnej białek błonowych za pomocą mezofaz lipidowych, za pomocą tzw. metody in meso. Niedawny przegląd metody i jej zakresu jest dostępny w Piśmiennictwie 1 (Caffrey, 2009). Protokół krok po kroku, który będziemy tutaj stosować, jest opisany w Odnośniku 2 (Caffrey i Cherezov, 2009).

Schemat blokowy podsumowujący kroki związane z przygotowaniem próby krystalizacji białek w mezo błonie jest pokazany na rysunku 4. W tym artykule omówiono kroki ujęte w czerwone linie przerywane.

Część 1: Przygotowanie płytek krystalizacyjnych

1. Umieść silanizowane szkiełko mikroskopowe na stole roboczym.
2. Zdejmij papierową osłonę ochronną z jednej powierzchni paska perforowanej podwójnej taśmy dystansowej (dostępnej w handlu, patrz Tabela określonych odczynników i sprzętu poniżej).
3. Umieść taśmę lepką stroną do dołu, stykając się z powierzchnią szkiełka.
4. Dociśnij taśmę do suwaka za pomocą chwytaka lub wałka. Folię aluminiową można umieścić między taśmą a rolką, aby chronić podstawę studzienek.
5. Zdejmij drugą papierową osłonę z taśmy, aby odsłonić jej górną lepką powierzchnię.
6. Umieść pojedyncze silanizowane szkiełka nakrywkowe w bliskiej odległości od płyty, aby szybko i skutecznie uszczelnić studzienki zaraz po zakończeniu załadunku.

Część 2: Przygotowanie strzykawki z lipidami

1. Umieść lipid (często monooleinę) w bloku o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 45 °C na 3 minuty, aby go stopić.
2. Podczas topnienia lipidów przygotuj dwie gazoszczelne strzykawki Hamilton o pojemności 100 μl do użycia na etapie mieszania lipidów i białek. Wyjmij teflonową skuwkę ze strzykawki, która będzie zawierać roztwór białka. Umieść obok siebie strzykawkę, która będzie przytrzymywać lipid (pozostawiając jej skuwkę na miejscu).
3. Podłączyć łącznik (patrz Tabela Specyficznych Odczynników i Sprzętu poniżej oraz Odniesienie 3 (Cheng i wsp., 1998)) do strzykawki lipidowej. Dokręcić złączkę do strzykawki palcami, ale nie należy dokręcać jej zbyt mocno. Wyjąć tłok z cylindra strzykawki lipidowej.
4. Należy pamiętać, że lipid musi zostać stopiony przed kontynuowaniem. Ustaw pipetę na 30 μl i powoli pobieraj około 30 μl stopionego lipidu. Powoli dostarczyć jak najwięcej stopionego lipidu do otwartego końca strzykawki, uważając, aby nie wprowadzić szczelin powietrznych.
5. Umieścić tłok w cylindrze w kontakcie ze stopionym lipidem i powoli przesuwać tłok w górę cylindra ze strzykawką trzymaną pionowo, jak pokazano na filmie. Pęcherzyki powietrza, które mogą zostać przypadkowo uwięzione, powinny unosić się w tym procesie i zostać uwolnione.
6. Dokładnie określić objętość lipidów w strzykawce, odczytując oznaczenia na cylindrze strzykawki.
7. Wsuń tuleję na igłę wystającą ze złączki. Za pomocą tłoka wtłoczyć stopiony lipid w górę cylindra i powoli i delikatnie do igły w rdzeniu łącznika.

Część 3: Przygotowanie strzykawki białkowej

1. Roztwór białka należy odwirowywać z prędkością 14 000 g przez 5 do 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia dużych agregatów przed rozpoczęciem prób krystalizacji. Usuń roztwór białka z lodu i pozwól mu się zrównoważyć w temperaturze pokojowej.
2. Obliczyć objętość roztworu białkowego, który ma zostać użyty do utworzenia fazy sześciennej przy pełnym lub zbliżonym do pełnego nawodnieniu. W przypadku monooleiny w temperaturze 20 °C pełne uwodnienie wodą następuje przy zawartości bliskiej 40 % wody (masowo), jak pokazano na wykresie fazowym⁵ (rysunek 5).
3. Za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 25 lub 50 μl pobrać wymaganą objętość roztworu białkowego. Przenieść roztwór na teflonową końcówkę tłoka w cylindrze strzykawki białkowej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
4. Ostrożnie wyjąć igłę i zmierzyć objętość roztworu białka w strzykawce. Powinna być zgodna z wartością dostarczoną w poprzednim kroku.
5. Powoli przesuwaj roztwór białka w górę beczki, aby zrównał się z jego otwartym końcem.
6. Wkręcić strzykawkę białkową w otwarty koniec łącznika dołączonego do strzykawki lipidowej. Bardzo ważne jest, aby urządzenie nie było nadmiernie dokręcone. Zbyt mocne dokręcenie zmontowanego urządzenia mieszającego na tym etapie spowoduje uszkodzenie tulejek i wyciek. Niedostateczne dokręcenie również doprowadzi do wycieku.

Część 4: Mieszanie roztworu białkowego i lipidów: tworzenie mezofazy

1. Aby uzyskać efekt mieszania, należy przesunąć tłok po stronie białka zmontowanego mieszalnika do jego granicy, kciukiem lub palcem wskazującym wypychając roztwór białka ze strzykawki białkowej, przez łącznik i do strzykawki lipidowej.
2. Tłok po stronie lipidowej jest teraz używany do wprowadzania zawartości strzykawki lipidowej z powrotem przez łącznik do strzykawki białkowej.
3. Proces ten powtarza się wiele razy; czasami potrzeba stu lub więcej pasaży, aby wytworzyć jednorodną mezofazę. Na początku mieszania ruch materiału tam iz powrotem przez łącznik może być nierównomierny, a czasami do wymieszania potrzebna jest dodatkowa siła. Wstępnemu mieszaniu zwykle towarzyszy rozwój nierównomiernego zmętnienia próbki. Wraz z postępem homogenizacji tekstura staje się bardziej jednolita i charakterystyczna dla lepkiej fazy sześciennej, podobnie jak wizualny wygląd wyłaniającej się mezofazy sześciennej.
4. Jeśli warunki są odpowiednie i tworzy się faza sześcienna, dyspersja powinna wydawać się optycznie przezroczysta w cylindrze strzykawki. W związku z tym oznaczenia na cylindrze strzykawki powinny być wyraźnie czytelne przez mezofazę w cylindrze.
5. Bardzo lekkie schłodzenie próbki podczas mieszania poprzez umieszczenie mieszalnika strzykawkowego na krótki czas na lodzie może przyspieszyć homogenizację i osiągnięcie przezroczystości. Jednak ważne jest, aby nie przechłodzić próbki.
6. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć bardzo energicznego mieszania, ponieważ może to spowodować wzrost temperatury próbki spowodowany ogrzewaniem ciernym³.

Część 5: Ładowanie dozownika

1. Wyjąć igłę i tłok ze strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl. Pozostaw skuwkę teflonową na miejscu.
2. Odkręć nakrętkę mocującą z dozownika za pomocą małej monety.
3. Przy całkowicie wysuniętym ramieniu grzechotki wprowadzić strzykawkę - bez tłoka i igły - przez pierścień mocujący dozownika.
4. Załóż nakrętkę mocującą stroną uszczelki skierowaną w stronę strzykawki i mocno przykręć ją do otwartego końca strzykawki.
   Należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że strzykawka jest prawidłowo wyśrodkowana w pierścieniu mocującym i że lufa jest ustawiona równolegle do ramienia grzechotki. Oba można ocenić na oko. Te dwa wymagania mają kluczowe znaczenie dla uniknięcia wycieków.
5. Przepuścić tłok przez pierścień chwytający z odkręconą o kilka obrotów nakrętką chwytaka i wprowadzić tłok do otwartego końca strzykawki. Całkowicie wciśnij ramię zapadkowe. Wsuń tłok do lufy i sprawdź, czy porusza się swobodnie i prawidłowo w lufie. Pomocne może być poluzowanie na prowadnicy, aby ułatwić swobodne poruszanie się tłoka. Upewnij się, że tak jest. Wciśnij tłok, aż jego teflonowa końcówka zrówna się ze znacznikiem podziałki zero μL na cylindrze. Jeśli śruba na prowadnicy została poluzowana, dokręć ją ponownie i ponownie sprawdź, czy tłok porusza się swobodnie.
6. Przesunąć tłok po jednej stronie zmontowanego mieszalnika do znacznika podziałki zero μl, aby przenieść mezofazę do drugiej strzykawki i łącznika.
7. Odłączyć pustą strzykawkę (z założoną tuleją) od mieszalnika i natychmiast podłączyć załadowaną strzykawkę - z dołączoną złączką - do gwintowanego zakończenia strzykawki dozującej 10 μl. Jak już wspomniano, stopień szczelności, z jaką odbywa się sprzężenie, ma kluczowe znaczenie.
8. Załadować strzykawkę dozującą, naciskając tłok strzykawki o pojemności 100 μl, tak aby mezofaza przeszła przez łącznik.
9. Przymocować krótką, płaską końcówkę igły do stalowego zakończenia strzykawki dozującej i ostrożnie ją dokręcić.
10. Clamp tłok do ramienia grzechotki, dokręcając nakrętkę w pierścieniu chwytającym. Należy uważać, aby nie dokręcić nakrętki zbyt mocno, ponieważ może to spowodować zadrapanie i deformację tłoka, czyniąc go bezużytecznym. Ważne jest, aby zakres ruchu zapewniany ramieniu grzechotki w stanie zaciśniętym był ograniczony do nie więcej niż jednego cala, jak pokazano na filmie. Poza tym tłok będzie miał tendencję do wyginania się, a dostawa może się nie powieść.
11. Wciśnij kilkakrotnie bęben zapadkowy, aby przesunąć tłok w cylindrze, wypełniając w ten sposób pustą objętość igły i ładując igłę. Ten krok należy powtarzać (do dziesięciu razy), aż z końcówki igły wyłoni się ciągły sznurek mezofazy.
12. Próby krystalizacji należy rozpocząć natychmiast, ponieważ niektóre białka są niestabilne w fazie sześciennej bez dodatku środka strącającego.

Część 6: Ustawianie płytek krystalizacyjnych

1. Umieść wielodołkową płytkę krystalizacyjną i szkiełko nakrywkowe na powierzchni uniesionej kilka cali nad stołem roboczym, aby ułatwić ładowanie. Optymalny kontrast i lepszą widoczność uzyskuje się, gdy powierzchnia jest lekko ciemna.
2. Homogenizować roztwory strącające i odkręcić fiolki. Ustawić pipetę dozującą środek strącający na 1 μl.
3. Trzymając strzykawkę dozującą pionowo w jednej ręce, wolną ręką umieść końcówkę igły pośrodku i bezpośrednio nad podstawą studzienki numer 1. Naciśnij przycisk na powtarzalnym dozowniku, aby usunąć bolus mezofazy na szklaną powierzchnię. Objętość bolusa wynosi 200 nl, gdy standardowy dozownik powtarzalny jest używany ze strzykawką o pojemności 10 μl. Końcówka igły nie powinna znajdować się więcej niż kilkaset mikrometrów nad podstawą studni, aby zapewnić prawidłowe podawanie.
4. Po załadowaniu mezofazą 4 sąsiednich studzienek, umieść 1 μl roztworu strącającego na każdym bolusie mezofazowym, używając pipety o pojemności 2 μl i standardowych jednorazowych końcówek.
5. Tak szybko, jak to możliwe, umieść szkiełko nakrywkowe prostopadle na wypełnionych studzienkach, aby równomiernie je przykryć. Aby uzyskać wodoszczelne uszczelnienie, użyj szpatułki, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe w miejscu, w którym styka się z odsłoniętą lepką powierzchnią taśmy dystansowej.
6. Proces dozowania mezofazy i środka strącającego można powtarzać, aż wszystkie studzienki na płytce zostaną załadowane i uszczelnione.
7. Oznacz tabliczkę wyraźnie w celu śledzenia. Białka wrażliwe na światło są zwykle obsługiwane przez owinięcie płytek w folię aluminiową przed umieszczeniem ich w komorze inkubacyjnej.
8. Umieść płytki w komorze o kontrolowanej temperaturze, zwykle w temperaturze 20 °C.
9. Regularnie sprawdzaj studzienki pod kątem wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu światła spolaryzowanego z obiektywem 10 lub 20-krotnym. Harmonogram używany w laboratorium autora jest następujący: dzień 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 i 60 po konfiguracji. Dokładnie sprawdź bolus mezofazowy, dostosowując głębokość ostrości w próbce o grubości 0,14 mm. Badanie powinno być wykonywane zarówno w normalnym świetle, jak i między skrzyżowanymi polaryzatorami.

Część 7: Reprezentatywne wyniki

Wygląd powstałych kryształów będzie się różnił w zależności od koloru białka błonowego, polaryzacji światła użytego do kontroli (lub jej braku) oraz metody i jakości oświetlenia. Rysunek 6 przedstawia kilka możliwych wyglądów kryształów. Naturalnie zabarwione białka błonowe rosnące w mezo, gdy ogląda się je w normalnym świetle, mogą wyglądać jak te pokazane na rysunku 6 (panele b i d). Bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie sześciennej oglądane w normalnym świetle mogą wyglądać jak te pokazane na rysunku 6 (Panel e). Wreszcie, bezbarwne kryształy białka błonowego rosnące w mezo, gdy są oglądane w świetle spolaryzowanym, mogą wyglądać jak na rysunku 6 (panele a i c).

Następne kroki w ogólnym procesie określania struktury to zbieranie i kriochłodzenie kryształów oraz rejestrowanie i analizowanie dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego z nich. Tematy te zostaną omówione w osobnych artykułach JoVe.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie błony biologicznej przedstawiające dwuwarstwę lipidową, w której i na której znajdują się różne białka.

Rysunek 2. Struktura białka transportującego witaminę B₁₂, BtuB, rozwiązana przy użyciu MX i kryształów wyhodowanych metodą in meso ⁶ zilustrowaną w tym artykule JoVE.

Rysunek 3. Cykl struktura-funkcja ilustruje wiele etapów związanych z uzyskaniem i wykorzystaniem pełnych informacji strukturalnych o białku.

Rysunek 4. Schemat blokowy podsumowuje etapy związane z produkcją kryształów białek błonowych metodą in mezo. Tylko te stopnie, które są otoczone przerywaną czerwoną linią, są omówione w tym artykule JoVE. Z odnośnika 2.

Rysunek 5. Uproszczony diagram fazowy składu temperaturowego dla układu lipidowego (monooleinowego)/wodnego. Próby krystalizacji przeprowadza się w temperaturze 20 °C, w której lipid nasyca się wodą przy 40% uwodnieniu. Szczegółowy schemat fazowy jest dostępny w Piśmiennictwie 5.

Rysunek 6. Kryształy białek błonowych rosnących w mezofazie lipidowej.
a) białko transportujące witaminę B₁₂, BtuB⁶, b) kompleks II⁷ do zbioru światła, c) adhezyna/inwazyna OpcA⁸, d) bakteriorodopsyna⁹, e) transporter węglowodanów z Pseudomonas. Obrazy zarejestrowane w normalnym świetle (b,d,e) i pomiędzy skrzyżowanymi polaryzatorami (a,c).

Discussion

Faza sześcienna to delikatne i dynamiczne środowisko, które może się drastycznie zmieniać wraz ze zmianą wielu zmiennych. Nie jest możliwe podanie opisu konfiguracji prób krystalizacji w mezo w trybie ręcznym, który opisywałby wszystkie potencjalne pułapki. Jednak wielu trudności można uniknąć, ćwicząc tę technikę przed zastosowaniem jej do drogich roztworów białkowych i stosując umiar w nacisku wywieranym na strzykawki podczas mieszania. Prawidłowo wykonana metoda in meso może dać kryształy z szerokiej gamy białek, których liczba stale rośnie.

Podany tutaj opis konfiguracji prób krystalizacji w mezo koncentruje się na trybie ręcznym. Proces ten może być i często jest modyfikowany w celu ułatwienia automatycznego ustawiania płytek krystalizacyjnych w tych przypadkach, które wymagają przesiewania warunków krystalizacji na dużą skalę.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwór białka	Odczynnik	Różne	Różne
Lipidy (monooleina)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	Różne
roztwory strącające	Odczynnik	Różne	Woda
oczyszczona	Odczynnik	EMD Millipore
Urządzenia do pipetowania	Narzędzie	Pipetman	Różne
Jednorazowe końcówki do pipet	Jednorazowe	Pipetman	Różne
gazoszczelne strzykawki	Narzędzie	Hamilton Co	80265 (25-µ l)
Końcówki strzykawek	Narzędzie	Hamilton Co	7770-020 (rozmiar 22)
Łącznik o wąskim otworze *	Narzędzie	Hamilton Co	różne / EBS-LCP-2
Dozownik powtarzalny	Narzędzie	Hamilton Co	83700
Szkiełka mikroskopowe ze szkła silanizowanego	Jednorazowe	mikroskopu Gold Seal	3010
	Jednorazowa	Fisher Scientific	12-548C
Perforowana taśma dystansowa z podwójnym patyczkiem	Jednorazowa	pęseta Saunders Corporation (dziurkowana)
	Narzędzie	Różne	NA
Brayer (wałek)	Narzędzie	Fisher Scientific	50820937
Rozdrobniony lód	Regulacja temperatury	Nie dotyczy	NIE DOTYCZY
Chusteczki	Jednorazowe	Nie dotyczy	NA
	Narzędzie	Różne	do
Lab		Różne	NA
* Pełne szczegóły dotyczące obróbki własnego łącznika z wąskim otworem znajdują się w Odnośniku 3.