Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Streszczenie

W ciągu ostatnich 20 lat zebrafish stał się potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju i chorób kręgowców. Choć analiza eksperymentalna zarodka i larwy jest szeroka, a morfologia została dobrze udokumentowana, brakuje opisów anatomii dorosłych osobników zebrafish oraz badań nad rozwojem struktur i narządów u osobników dorosłych, wraz z technikami pracy z tymi zwierzętami. Narządy larwy przechodzą znaczące zmiany w ogólnej budowie, morfologii i położeniu anatomicznym podczas przejścia ze stadium larwalnego w dorosłe. Zewnętrznie przezroczysta larwa wykształca charakterystyczny dla dorosłych osobników prążkowany wzór pigmentowy oraz parzyste płetwy brzuszne, natomiast wewnętrznie narządy ulegają gwałtownemu wzrostowi i przebudowie. Dodatkowo bipotencjalny prymordium gonad rozwija się w jądra lub jajniki. Niniejszy protokół identyfikuje wiele narządów osobników dorosłych i prezentuje metody sekcji mózgu, gonad, układu pokarmowego, serca i nerek dorosłego zebrafish. Wypreparowane narządy mogą być wykorzystywane do hybrydyzacji in situ, immunohistochemii, histologii, ekstrakcji RNA, analizy białek oraz innych technik molekularnych. Protokół ten przyczyni się do rozszerzenia badań nad zebrafish o przebudowę narządów larwalnych, morfogenezę narządów specyficznych dla osobników dorosłych oraz inne analizy układów narządowych dorosłych osobników.

Protokół

1. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić sekcję samca danio pręgowanego, a następnie samicy. Przed rozpoczęciem sekcji rybę należy znieczulić w 0,2% roztworze Tricaine, a następnie poddać eutanazji poprzez inkubację w lodowatej wodzie przez 15 minut.
2. Należy rozpocząć od delikatnego osuszenia ryby ręcznikiem papierowym i umieszczenia jej na macie do sekcji. Zewnętrznie ryby z rodzaju danio pręgowany posiadają pojedynczą płetwę grzbietową, ogonową i odbytową oraz parzyste płetwy piersiowe i brzuszne (Rycina 1).
   
   
   
   Rycina 1. Dorosły samiec ryby z opisanymi płetwami.
   
3. Rybę należy przypiąć do maty do sekcji za pomocą szpilek przez mięsistą część ogona oraz brzuszny fragment oczodołu.
4. Należy naciąć skórę na brzuchu ryby tuż przed płetwą odbytową. Następnie należy rozciąć skórę i leżący pod nią mięsień wzdłuż brzucha, od płetwy odbytowej do operkulum (twardej pokrywy skrzeli) (Rycina 2, krok 1).
   
   
   
   Rycina 2. Etapy usuwania skóry i mięśni ściany ciała w celu odsłonięcia organów wewnętrznych.
   
5. Następnie należy usunąć operkulum i płetwę piersiową, w tym obręcz piersiową (gruby, kostny obszar u nasady płetwy) (Rycina 2, krok 2). Należy rozciąć skórę i leżący pod nią mięsień, zaczynając znad odsłoniętego skrzela, kierując się ku tyłowi wzdłuż boku ryby, aż do płetwy odbytowej (Rycina 2, krok 3).
6. Należy ostrożnie usunąć skórę i leżący pod nią mięsień z boku ryby. Wiele organów wewnętrznych jest teraz widocznych (Rycina 3).
   
   
   
   Rycina 3. Dorosły samiec ryby po usunięciu ściany ciała i mięśni, co umożliwia wizualizację organów wewnętrznych.
   
7. Jądra to długie, białe, parzyste organy przytwierdzone do grzbietowej ściany ciała. Należy usunąć jedno jądro i umieścić je w naczyniu z PBS. Jądro należy zbadać w świetle odbitym, aby zwizualizować kanaliki nasienne (Rycina 4), które zawierają cysty z różnymi stadiami rozwoju komórek płciowych, od spermatogoniów po spermatydy (Leal et al., 2009).
   
   
   
   Rycina 4. Sekcja jądra. Białe, okrągławe struktury to kanaliki nasienne.
   
8. Następnie należy usunąć układ pokarmowy z jamy ciała ryby. Wątrobę można zidentyfikować po dużym rozmiarze, płatowej morfologii, brązowawym kolorze i rozległym unaczynieniu. W obrębie trzewi znajdują się pęcherzyk żółciowy (zielony, przeświecający worek wypełniony płynem) oraz śledziona, która ma intensywnie czerwony kolor.
9. Należy oddzielić jelito od pozostałych organów i je rozprostować. Przedni, środkowy i tylny region jelita definiuje wysokość fałdów nabłonkowych (Wallace et al., 2005).
10. Fragment jelita należy umieścić w PBS i obserwować fałdy nabłonkowe w świetle przechodzącym.
11. Następnie należy zbadać pęcherz pławny. Pęcherz pławny składa się z komory tylnej, połączonej z przełykiem za pomocą przewodu pneumatycznego, oraz komory przedniej, połączonej z uchem wewnętrznym za pomocą aparatu Webera (Finney et al., 2006).
12. Pęcherz pławny należy usunąć i odrzucić. Rybę należy odpiąć i przypiąć ponownie stroną brzuszną do góry, aby przeprowadzić sekcję nerki, która znajduje się wzdłuż grzbietowej ściany ciała. Nerka jest przeświecającą, różową strukturą powiązaną z aortą grzbietową i komórkami pigmentowymi. Nerka dzieli się na region głowy, ciała i ogona (Rycina 5). Należy wyciąć fragment nerki i umieścić go w PBS. Następnie należy rozdzielić tkankę nerkową, aby odsłonić kanaliki nerkowe.
    
    
    
    Rycina 5. Położenie części głowowej, ciałowej i ogonowej nerki wzdłuż grzbietowej ściany ciała.
    
13. Należy przeprowadzić sekcję samicy. Zgodnie z wcześniejszym opisem, rybę należy poddać eutanazji w lodowatej wodzie i osuszyć przed przypięciem do maty do sekcji. Skórę z boku ryby należy usunąć w sposób zademonstrowany wcześniej. Jajnik jest strukturą dwupłatową zawieszoną w jamie ciała przez unaczynione mezowarium.
14. Należy usunąć jeden płat jajnika, umieścić go w PBS i zbadać w świetle przechodzącym. Oocyty można rozdzielić za pomocą cienkich igieł, a następnie określić ich stadium (Rycina 6, Selman et al., 1993). Oocyty w stadium I mają wielkość około 10 - 150 µm i są przeświecające. Oocyty w stadium II mają wielkość około 150 - 350 µm i charakteryzują się pojawieniem ziarnistości korowej. Oocyty w stadium III mają wielkość 350 - 750 µm i są nieprzeźroczyste z powodu gromadzenia się żółtka. Dojrzałe oocyty w stadiach IV i V są przeświecające i zazwyczaj nie występują w jajnikach samic, które niedawno odbyły tarło.
    
    
    
    Rycina 6. Żywe oocyty w stadiach I, II i III obserwowane pod mikroskopem sekcyjnym w świetle przechodzącym.
    
15. Następnie należy wypreparować serce ryby. Serce znajduje się za skrzela i po stronie brzusznej. Należy zacząć od wycięcia serca wraz z całą otaczającą go tkanką i umieszczenia go w PBS. Należy ostrożnie usunąć tkankę otaczającą serce, dbając o to, aby nie uszkodzić delikatnego przedsionka.
16. Wypreparowane serce należy umieścić w roztworze Ringera, aby zaobserwować jego bicie.
    Należy zidentyfikować przedsionek, komorę oraz bulbus arteriosus (Rycina 7, Hu et al., 2001).
    
    
    
    Rycina 7. Wypreparowane serce dorosłego osobnika.
    
17. Sekcję należy zakończyć usunięciem mózgu ryby. Należy zacząć od odpięcia ryby i odcięcia głowy za pomocą żyletki. Za pomocą pęsety należy usunąć jak najwięcej tkanek miękkich z brzusznej strony czaszki. Oczy należy usunąć za pomocą małych nożyczek sprężynowych. Należy rozłupać czaszkę i usunąć kość z brzusznej strony mózgu. Następnie należy umieścić głowę w naczyniu z PBS i usunąć skórę oraz kości czaszki z grzbietowej strony mózgu.
18. Należy zidentyfikować cebulki węchowe, telencefalon, habenulę, wzgórze optyczne, móżdżek i rdzeń przedłużony (Rycina 8, Wullimann et al., 1996; Schilling, 2002).
    
    
    
    Rycina 8. Wypreparowany mózg dorosłego danio pręgowanego. Widok grzbietowy, góra to strona przednia.
    

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki:
0,2% trikainy (3-aminobenzoesan etylu) 200 mg proszku trikainy 97,9 ml wody DD ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Dostosować pH do wartości 7,0
Roztwór soli fosforanowo-buforowany (PBS) 4,0 g NaCl 0,1 g KCl 100 ml 0,1 M PO4 Bufor, pH 7,3 150 ml dH2O2O
roztwór Ringera’roztwór s 6,7 g NaCl 0,2 g KCl 0,2 g CaCl22 1,2 g Hepes 1 L H2O2O Dostosować pH do wartości 7,2
Płytka sekcyjna z matą	Electron Microscopy Sciences	70540
Nożyczki sprężynowe Vannasa	Fine Science Tools	91500-09