Artykuł metodologiczny

Echokardiografia przezklatkowa u myszy

65K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1738

⸱

28 maja 2010

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine (BCM), 2The Margaret M. and Albert B. Alkek Department of Medicine, Baylor College of Medicine (BCM)

W tym artykule

Podsumowanie

Echokardiografia przezklatkowa stanowi nieinwazyjną metodę oceny funkcji serca u myszy. Połączenie obrazowania ultradźwiękowego i dopplerowskiego pozwala na wykonanie pomiarów wymiarów serca oraz przepływu krwi wewnątrzsercowego, co łącznie umożliwia ocenę funkcji skurczowej i rozkurczowej serca.

Streszczenie

W ostatnich latach modele mysie stały się głównym sposobem badania mechanizmów molekularnych dysfunkcji serca wynikających ze zmian w ekspresji genów. Metody transgeniczne i celowane w geny mogą być wykorzystywane do tworzenia myszy o zmienionej wielkości i funkcji serca,1-3w rezultacie,in vivodo oceny ich fenotypu sercowego niezbędne są odpowiednie techniki. W celu uzyskania pomiarów wymiarowych serca myszy oraz ilościowego określenia stopnia wydolności skurczowej i rozkurczowej serca można zastosować echokardiografię przezklatkową, dopplerowską analizę prędkości przepływu (PWD) oraz obrazowanie dopplerowskie tkanek (TDI). Obrazowanie dwuwymiarowe służy do wykrywania nieprawidłowej anatomii lub ruchów lewej komory, natomiast echokardiografia w trybie M służy do ilościowego pomiaru wymiarów i kurczliwości serca.4,5Dodatkowo PWD jest wykorzystywane do ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu turbulentnego,6podczas gdy TDI służy do pomiaru prędkości ruchu mięśnia sercowego.7W związku z tym echokardiografia przezklatkowa stanowi kompleksową metodę nieinwazyjnej oceny funkcji serca u myszy.

Protokół

1. Przygotowanie myszy do badań obrazowych

  1. Przed badaniami obrazowymi znieczul mysz (2% izofluranu zmieszanego z 0,5 L/min 100% O2) w komorze indukcyjnej. W celu zapewnienia bezpieczeństwa operatora należy pamiętać o filtrowaniu gazów odpadowych. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i za pomocą strzygarki usuń sierść od linii szyi do poziomu środka klatki piersiowej. Następnie usuń pozostałą sierść za pomocą kremu do depilacji. Przygotowanie to można przeprowadzić dzień przed badaniami obrazowymi, aby zminimalizować potencjalne niepożądane reakcje stresowe u myszy.
  2. Nanieś żel duralube do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu twardówki (unikaj kontaktu aplikatora żelu z rogówką). Umieść znieczuloną mysz w pozycji grzbietnej na macie grzewczej z wbudowanymi elektrodami EKG w celu utrzymania temperatury ciała.
  3. Umieść pysk w masce nosowej podłączonej do systemu znieczulającego, aby utrzymać stały poziom sedacji podczas całej procedury (1,0% do 1,5% izofluranu zmieszanego z 0,5 L/min 100% O2). Wykonaj uciśnięcie palca u nogi lub ogona, aby potwierdzić sedację. W razie potrzeby poziom znieczulenia można dostosować, aby uzyskać docelową częstotliwość akcji serca 450 ± 50 uderzeń na minutę (bpm).
  4. Ostrożnie wprowadź sondę rektalną (po uprzednim nasmarowaniu), aby stale monitorować i regulować temperaturę ciała za pomocą maty grzewczej. Ważne jest utrzymanie temperatury ciała w wąskim zakresie (37,0 °C ± 0,5 °C), ponieważ nawet umiarkowane zmiany temperatury i częstości akcji serca wpływają na funkcję serca u myszy.
  5. Nanieś żel przewodzący na cztery łapy i przymocuj je taśmą do elektrod EKG.

2. Ocena funkcji skurczowej serca

  1. Aby rozpocząć tę procedurę, nałóż warstwę podgrzanego żelu do badań USG na klatkę piersiową, przede wszystkim w obszarze nad sercem. Żel powinien być ogrzany do temperatury zbliżonej do temperatury ciała. Zastosowanie zimnego żelu może gwałtownie zwiększyć tempo utraty ciepła z organizmu. Unikaj pęcherzyków powietrza w żelu, ponieważ mogą one zakłócać obrazowanie ultradźwiękowe.
  2. Unieruchom mysz w pozycji lekko skierowanej ku górze (głową do góry) pod niewielkim kątem. Za pomocą mikromanipulatora unieruchom głowicę USG pod kątem 90° między głowicą a sercem.
  3. Aby rozpocząć pomiary echokardiograficzne w osi krótkiej, opuść głowicę na klatkę piersiową w pozycji przy mostku. Unikaj umieszczania głowicy bezpośrednio nad mostkiem lub na skórze, ponieważ spowoduje to zniekształcenie sygnału.
  4. W pierwszej kolejności wykonamy obrazowanie dwuwymiarowe (2D) („tryb B”), aby uzyskać widok wzdłuż przymostkowej osi krótkiej. Dostosuj obszar obrazowania głowicy, aby uzyskać kompletny obraz, zależnie od wielkości serca zwierzęcia.
  5. Prawidłowy obraz w tej orientacji obejmie lewą komorę oraz niewielką część ściany prawej komory. Strzałka (widoczna na wideo) wskazuje mięśnie papilarne przednio-boczne i tylno-przyśrodkowe, tylną i przednią ścianę LV, ścianę przegrody komór oraz niewielką część ściany prawej komory. Podczas tych pomiarów zwróć szczególną uwagę na potencjalne nieprawidłowości ruchu ścian (np. hipokinezję, akinezję, asynchronię) lub tętniaki.
  6. Następnie wykorzystamy echokardiografię w trybie M, która zapewnia widok jednowymiarowy (1D), aby uzyskać precyzyjne pomiary wymiarów i kurczliwości serca. Zapisz uzyskane obrazy do późniejszej oceny parametrów funkcji skurczowej lewej komory.

3. Ocena funkcji rozkurczowej serca

  1. Podczas obrazowania w krótkiej osi przymostkowej można przeprowadzić obrazowanie dopplerowskie tkanek (TDI), aby zmierzyć prędkość ruchu mięśnia sercowego. Obszar zainteresowania wyznacza się tak, aby obejmował tylną ścianę lewej komory dla oceny osi radialnej. Uzyskany wykres będzie miał cztery piki służące do oceny funkcji rozkurczowej: IVRT, E', A' oraz IVCT. S' reprezentuje prędkość skurczową. (Rycina 3B) Parametry te zostaną opisane później w sekcji wyników reprezentatywnych.
  2. Do pomiaru prędkości przepływu krwi w niewielkim obszarze na określonej głębokości w tkance mięśnia sercowego można zastosować doppler pulsacyjny (PWD). Aby obrazować wzorzec przepływu przezmitralnego, przechyl zwierzę do tyłu w pozycji Trendelenburga. Skieruj głowicę ku górze tak, aby była prostopadła do wierzchołka serca.
  3. Następnie zwiększ stężenie izofluranu, aby obniżyć czynność serca do 300-350 bpm, co spowolni ruch zastawki mitralnej. W badaniach porównawczych ważne jest utrzymanie podobnej częstości uderzeń serca u poszczególnych zwierząt.
  4. Wizualizuj ruchy zastawki mitralnej jako punkt odniesienia do pomiaru przepływu przez zastawkę. Umieść bramkę pomiarową na końcówce zastawki mitralnej.
  5. Zmierz wzorce przepływu przez zastawkę mitralną za pomocą PWD. Charakterystycznie widoczne są dwie fale: jedna reprezentująca pasywne napełnianie komory (fala wczesna [E]) oraz druga odpowiadająca aktywnemu napełnianiu podczas skurczu przedsionka (fala przedsionkowa [A]). W zdrowym sercu prędkość fali E jest nieco większa niż prędkość fali A (Rycina 3C).
  6. Po zakończeniu wszystkich pomiarów usuń żel elektrodowy (delikatnie wycierając standardowymi gazikami) oraz więzy z zwierzęcia. Pozwól nieunieruchomionemu zwierzęciu dojść do siebie w pozycji pionowej na podgrzewanej podkładce EKG i wyłącz anestezję. Po przebudzeniu myszy należy umieścić ją z powrotem w klatce.

4. Reprezentatywne wyniki echokardiografii przezklatkowej

Nieinwazyjne badania echokardiograficzne mogą być wykorzystywane do oceny morfologii i funkcji lewej komory w mysich modelach chorób serca.4,5 Technika ta jest szeroko stosowana i stanowi alternatywę dla procedur terminalnych służących do oceny funkcji LV, takich jak pomiary pętli ciśnienie-objętość wewnątrzsercowe.8 lub model pracującego serca ex vivo.9 Ocena wymiarów jam LV za pomocą echokardiografii przezklatkowej w trybie M pozwala na wykrycie nieprawidłowego powiększenia jam LV lub zwiększonej grubości ścian w różnych modelach chorób serca.5 Zatem echokardiografia przezklatkowa w połączeniu z dopplerowskim pomiarem prędkości przepływu stanowi kompleksową metodę nieinwazyjnej oceny funkcji skurczowej i rozkurczowej serca u myszy.

figure-protocol-1
Rycina 1. Przegląd systemu wysokorozdzielczego obrazowania in vivo Vevo 770 do echokardiografii i obrazowania Dopplera. (A) Wykorzystano zintegrowany system szyn VisualSonics z jednostką monitorowania fizjologicznego, płytą EKG oraz głowicą skanującą RMV 30mHz. (B) Mysz jest ustawiona i odpowiednio unieruchomiona na podgrzewanej platformie z zintegrowanymi elektrodami EKG (kolor złoty). Cztery kończyny są przymocowane taśmą do elektrod EKG. (C-D) Zdjęcia przedstawiające właściwe kąty dla Dopplera falowego wykorzystanego do pomiarów funkcji rozkurczowej, zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Orientacja sondy dla pomiarów funkcji skurczowej została pokazana w filmowym protokole.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy 2D echokardiografii (tryb B). (A) Widok krótkiej osi w przekroju przymostkowym, pokazujący przednią (AW) i tylną (PW) ścianę lewej komory, ścianę przegrody międzykomorowej (SW) oraz ścianę boczną (LW). Średnicę światła lewej komory można zmierzyć jako wewnętrzną średnicę lewej komory (LVID). Gwiazdka oznacza tylno-przyśrodkowy mięsień papilarny. (B) Apikalny widok czterojamowy z obszarem obrazowania nad zastawką mitralną w celu wyznaczenia prędkości szczytowych E/A. MVAL, przednia płatka zastawki mitralnej; MVPL, tylna płatka zastawki mitralnej; RV, prawa komora; LV, lewa komora.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Pozyskiwanie i ilościowe określanie danych echokardiograficznych i dopplerowskich. Rysunek zawiera reprezentatywne obrazy pozyskanych danych odpowiadające obrazom echokardiografii 2D przedstawionym na Rysunku 2. (A) Zapis w trybie M z liniami wskazującymi średnice koniec-systoliczną (ESD) i koniec-diastoliczną (EDD). LVAWD/S, grubość przedniej ściany lewej komory (rozkurcz/skurcz); LVPWD/S, grubość tylnej ściany lewej komory (rozkurcz/skurcz). (B) Reprezentatywne zapisy obrazowania dopplerowskiego tkanek tylnej ściany LV. IVRT, czas izowolumetrycznego rozkurczu; IVCT, czas izowolumetrycznego skurczu. Fala E' odpowiada ruchowi pierścienia zastawki mitralnej podczas wczesnego napełniania LV w rozkurczu, a fala A' wynika z skurczu przedsionka podczas późnego napełniania LV. S' reprezentuje prędkość skurczową. (C) Rejestracja dopplerowska falą impulsową końcówek płatków zastawki mitralnej umożliwia uzyskanie wzorców prędkości przepływu przez zastawkę mitralną, z których można wyprowadzić wczesną prędkość rozkurczową (E), późną prędkość rozkurczową ze skurczem rozkurczowym (A) oraz stosunek E/A. IVRT jest również użyteczną zmienną do charakteryzacji funkcji rozkurczowej i ciśnień napełniania. ET oznacza czas wyrzutu.

Dyskusja

Ważne jest, aby ustandaryzować poziom znieczulenia,10 temperaturę ciała oraz częstotliwość pracy serca w grupie myszy, aby ułatwić porównanie między różnymi grupami lub genotypami myszy podczas stosowania echokardiografii w trybie M. W celu oceny funkcji rozkurczowej za pomocą PWD niezbędne jest obniżenie częstości pracy serca, aby móc ocenić właściwości rozkurczowe serca myszy. Funkcje życiowe zwierzęcia muszą być ściśle monitorowane w celu zapobieżenia niewydolności hemodynamicznej i śmierci. Z drugiej strony, podczas pomiarów funkcji skurczowej z wykorzystaniem echokardiografii w trybie M, częstotliwość pracy serca poniżej 400 uderzeń na minutę może spowodować zwiększenie średnic końca rozkurczu z powodu zwiększonego napełnienia LV.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr. Corey'owi Reynoldsowi oraz BCM Mouse Phenotyping Core za ekspercką pomoc przy tym projekcie i uprzejme udostępnienie zaplecza badawczego. X.H.T.W. jest stypendystą W.M. Keck Foundation Distinguished Young Scholar in Medical Research, a jego pracę wspierają również granty NIH/NHLBI R01-HL089598 i R01-HL091947 oraz grant Muscular Dystrophy Association nr 69238. Praca ta jest również częściowo finansowana przez Foundation Leducq Alliance for CaMKII Signaling in Heart.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System mikroobrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości Vevo 770 *VisualSonics, inc.www.visualsonics.com/products
RMV (Real-time MicroVisualization) 707B 30MHz głowica z kapsułkowanym przetwornikiemVisualSonics, inc.www.visualsonics.com/products
Zintegrowany system szynowy Vevo, w tym jednostka monitorowania parametrów fizjologicznychVisualSonics, inc.www.visualsonics.com/products
Kompaktowy system anestezjologiczny VevoVisualSonics, inc.www.visualsonics.com/products
Lampa grzewczaGeneral Supply
Krem do depilacji (Nair)General Supply
Krem elektrodowy Sigma crémeParker Laboratories Inc.Part#17-05; www.cardioogyshop.com
Żel do ultrasonografii Ecogel 100Eco-Med Pharmaceuticals Inc.Code 30GB;www.eco-med.com
Standardowe gazikiSafe Cross First Aid
Taśma/ patyczki bawełniane/ podkładki grzewcze (x2)/ Clidox/ ddH2OGeneral Supply

* Wymagane oprogramowanie to oprogramowanie Vevo, w tym aplikacja B-Mode, aplikacja Doppler pulsacyjny oraz pakiet narzędzi do analizy układu sercowo-naczyniowego.

Bibliografia

  1. Zhang, T. M. aier, S, L., Dalton, N. D. The deltaC isoform of CaMKII is activated in cardiac hypertrophy and induces dilated cardiomyopathy and heart failure. Circ Res. 92 (8), 912-912 (2003).
  2. Srivastava, D., Thomas, T., Lin, Q. Regulation of cardiac mesodermal and neural crest development by the bHLH transcription factor, dHAND. Nat Genet. 16 (2), 154-154 (1997).
  3. Sood, S., Chelu, M. G., van Oort, R. J. Intracellular calcium leak due to FKBP12.6 deficiency in mice facilitates the inducibility of atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5 (7), 1047-1047 (2008).
  4. Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-907 (1995).
  5. Tanaka, N., Dalton, N., Mao, L. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1109 (1996).
  6. Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-708 (2002).
  7. Garcia-Fernandez, M. A., Azevedo, J., Moreno, M. Regional Left Ventricular Diastolic Dysfunction Evaluated by Pulsed-Tissue Doppler Echocardiography. Echocardiography. 16 (5), 491-491 (1999).
  8. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1422 (2008).
  9. Larsen, T. S., Belke, D. D., Sas, R. Pflugers Arch. 437 (6), 979-979 (1999).
  10. Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D. Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2134 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

serce myszytryb Mobrazowanie dopplerowskie tkanekdoppler impulsowyobrazowanie dwuwymiarowewymiary sercafunkcja skurczowafunkcja rozkurczowazastawka mitralna

Powiązane artykuły