Echokardiografia przezklatkowa stanowi nieinwazyjną metodę oceny funkcji serca u myszy. Połączenie obrazowania ultradźwiękowego i dopplerowskiego pozwala na wykonanie pomiarów wymiarów serca oraz przepływu krwi wewnątrzsercowego, co łącznie umożliwia ocenę funkcji skurczowej i rozkurczowej serca.
Artykuł metodologiczny
Echokardiografia przezklatkowa u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ostatnich latach modele mysie stały się głównym sposobem badania mechanizmów molekularnych dysfunkcji serca wynikających ze zmian w ekspresji genów. Metody transgeniczne i celowane w geny mogą być wykorzystywane do tworzenia myszy o zmienionej wielkości i funkcji serca,1-3w rezultacie,in vivodo oceny ich fenotypu sercowego niezbędne są odpowiednie techniki. W celu uzyskania pomiarów wymiarowych serca myszy oraz ilościowego określenia stopnia wydolności skurczowej i rozkurczowej serca można zastosować echokardiografię przezklatkową, dopplerowską analizę prędkości przepływu (PWD) oraz obrazowanie dopplerowskie tkanek (TDI). Obrazowanie dwuwymiarowe służy do wykrywania nieprawidłowej anatomii lub ruchów lewej komory, natomiast echokardiografia w trybie M służy do ilościowego pomiaru wymiarów i kurczliwości serca.4,5Dodatkowo PWD jest wykorzystywane do ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu turbulentnego,6podczas gdy TDI służy do pomiaru prędkości ruchu mięśnia sercowego.7W związku z tym echokardiografia przezklatkowa stanowi kompleksową metodę nieinwazyjnej oceny funkcji serca u myszy.
Protokół
1. Przygotowanie myszy do badań obrazowych
- Przed badaniami obrazowymi znieczul mysz (2% izofluranu zmieszanego z 0,5 L/min 10% O2) w komorze indukcyjnej. Dla bezpieczeństwa operatora należy upewnić się, że gazy odpadowe są filtrowane. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i za pomocą maszynki do strzyżenia usuń sierść od szyi do połowy klatki piersiowej. Następnie usuń pozostałą sierść z ciała za pomocą kremu do depilacji. Przygotowanie to można przeprowadzić na dzień przed badaniami obrazowymi, aby zminimalizować potencjalne niepożądane reakcje stresowe u myszy.
- Nałóż żel duralube do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu twardówki (unikaj kontaktu aplikatora żelu z rogówką). Umieść znieczuloną mysz w pozycji na plecach na podkładce grzewczej z wbudowanymi elektrodami EKG w celu utrzymania temperatury ciała.
- Umieść pysk w masce nosowej podłączonej do systemu anestezjologicznego, aby utrzymać stały poziom sedacji podczas całej procedury (1,0% do 1,5% izofluranu zmieszanego z 0,5 L/min 100% O2). Wykonaj ucisk palca u nogi lub ogona, aby potwierdzić sedację. W razie potrzeby poziom znieczulenia można dostosować, aby uzyskać docelową częstość akcji serca 450 ± 50 uderzeń na minutę (bpm).
- Ostrożnie wprowadź sondę rektalną (po uprzednim nasmarowaniu), aby na bieżąco monitorować i regulować temperaturę ciała za pomocą podkładki grzewczej. Ważne jest utrzymanie temperatury ciała w wąskim zakresie (37,0 °C ± 0,5 °C), ponieważ nawet umiarkowane zmiany temperatury i częstości akcji serca wpływają na funkcję serca u myszy.
- Nałóż żel przewodzący na cztery łapy i przytwierdź je taśmą do elektrod EKG.
2. Ocena funkcji skurczowej serca
- Aby rozpocząć tę procedurę, należy nałożyć warstwę podgrzanego żelu do ultrasonografii na klatkę piersiową, głównie w obszarze nad sercem. Żel powinien być ogrzany do temperatury zbliżonej do temperatury ciała. Zastosowanie zimnego żelu może gwałtownie przyspieszyć utratę ciepła z organizmu. Należy unikać pęcherzyków powietrza w żelu, ponieważ mogą one zakłócać obrazowanie ultradźwiękowe.
- Ustabilizuj mysz w pozycji lekko uniesionej (głowa do góry) pod niewielkim kątem. Używając mikromanipulatora, unieruchom głowicę ultradźwiękową pod kątem 90° względem serca.
- Aby rozpocząć pomiary echokardiograficzne w osi krótkiej, opuść głowicę na klatkę piersiową w przekroju przymostkowym. Unikaj umieszczania głowicy bezpośrednio nad mostkiem lub bezpośrednio na skórze, ponieważ spowoduje to zniekształcenie sygnału.
- W pierwszej kolejności wykonamy obrazowanie dwuwymiarowe (2D) („tryb B”), aby uzyskać widok wzdłuż przymostkowej osi krótkiej. Dostosuj obszar obrazowania głowicy, aby uzyskać pełny obraz, zależnie od wielkości serca zwierzęcia.
- Prawidłowy obraz w tej orientacji powinien obejmować lewą komorę oraz niewielką część ściany prawej komory. Strzałka (widoczna na filmie) wskazuje przednioboczne i tylnoprzyśrodkowe mięśnie brodawkowate, tylną i przednią ścianę LV, ścianę przegrody międzykomorowej oraz niewielką część ściany prawej komory. Podczas tych pomiarów należy zwrócić szczególną uwagę na potencjalne nieprawidłowości w kurczliwości ścian (np. hipokinezę, akinezję, asynchronię) lub tętniaki.
- Następnie wykorzystamy echokardiografię w trybie M, która zapewnia widok jednowymiarowy (1D), aby uzyskać precyzyjne pomiary wymiarów i kurczliwości serca. Zapisz uzyskane obrazy do późniejszej oceny parametrów funkcji skurczowej lewej komory.
3. Ocena funkcji rozkurczowej serca
- Podczas dalszego obrazowania w przekroju krótkim w osi parasternalnej można przeprowadzić dopplerowską ocenę tkanek (TDI), aby zmierzyć prędkość ruchu mięśnia sercowego. Wyznacza się obszar zainteresowania obejmujący tylną ścianę lewej komory do oceny w osi radialnej. Uzyskana fala będzie miała cztery piki służące do oceny funkcji rozkurczowej: IVRT, E', A' oraz IVCT. S' reprezentuje prędkość skurczową. (Rysunek 3B) Parametry te zostaną opisane później w sekcji wyników reprezentatywnych.
- Do pomiaru prędkości przepływu krwi w obrębie niewielkiego obszaru na określonej głębokości w tkance mięśnia sercowego można zastosować Doppler pulsacyjny (PWD). Aby obrazować wzorzec przepływu przezmitralnego, należy przechylić zwierzę do tyłu w pozycji Trendelenburga. Przechylić głowicę do góry tak, aby była prostopadła do wierzchołka serca.
- Następnie zwiększyć poziom izofluranu, aby obniżyć czynność serca do 30-350 bpm, co spowolni ruch zastawki mitralnej. W badaniach porównawczych ważne jest utrzymanie zbliżonej częstości pracy serca u wszystkich zwierząt.
- Wizualizować ruchy zastawki mitralnej jako punkt odniesienia do pomiaru przepływu przez zastawkę. Umieścić objętość próbkowania na końcówce zastawki mitralnej.
- Zmierzyć wzorce przepływu przez zastawkę mitralną za pomocą PWD. Charakterystyczne jest widoczność dwóch fal: jednej reprezentującej bierne napełnianie komory (fala wczesna [E]) oraz drugiej zgodnej z aktywnym napełnianiem podczas skurczu przedsionka (fala przedsionkowa [A]). W zdrowym sercu prędkość fali E jest nieco większa niż prędkość fali A (Rysunek 3C).
- Po zakończeniu wszystkich pomiarów usunąć żel elektrodowy (poprzez delikatne przetarcie standardowymi gazikami) oraz więzy z ciała zwierzęcia. Pozwolić nieunieruchomionemu zwierzęciu dojść do siebie na podgrzewanej podkładce EKG w pozycji pionowej i wyłączyć narkozę. Po przebudzeniu myszy należy umieścić ją z powrotem w klatce.
4. Reprezentatywne wyniki echokardiografii przezklatkowej
Nieinwazyjne badania echokardiograficzne mogą być wykorzystywane do oceny morfologii i funkcji lewej komory w mysich modelach chorób serca.4,5 Technika ta jest szeroko stosowana i stanowi alternatywę dla procedur terminalnych służących do oceny funkcji LV, takich jak pomiary pętli ciśnienie-objętość wewnątrzsercowe.8 lub model pracującego serca ex vivo.9 Ocena wymiarów jam LV za pomocą przezklatkowej echokardiografii w trybie M pozwala na wykrycie nieprawidłowego powiększenia jam LV lub zwiększonej grubości ścian w różnych modelach chorób serca.5 Tym samym echokardiografia przezklatkowa, w połączeniu z dopplerowskim badaniem fali tętna, stanowi kompleksową metodę nieinwazyjnej oceny funkcji skurczowej i rozkurczowej serca u myszy.
Rysunek 1. Przegląd systemu wysokorozdzielczego obrazowania in vivo Vevo 70 do echokardiografii i obrazowania Dopplera. (AWykorzystujemy zintegrowany system szynowy VisualSonics z jednostką monitorowania fizjologicznego, płytką EKG oraz głowicą skanującą RMV 30MHz.BMyszy umieszcza się i odpowiednio unieruchamia na podgrzewanej płytce z zintegrowanymi elektrodami EKG (kolor złoty). Cztery kończyny przymocowuje się taśmą do elektrod EKG.C-DZdjęcia przedstawiające właściwe kąty dla dopplerowskiego pomiaru prędkości przepływu (pulse-wave Doppler) wykorzystanego do oceny funkcji rozkurczowej, zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Orientacja głowicy dla pomiarów funkcji skurczowej została przedstawiona w protokole wideo.
Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy dwuwymiarowego echokardiograficznego badania serca (tryb B). (A) Przekrój krótka oś w płaszczyźnie parasternalnej przedstawiający przednią (AW) i tylną (PW) ścianę lewej komory, ścianę przegrody międzykomorowej (SW) oraz ścianę boczną (LW). Średnicę światła lewej komory można zmierzyć jako wewnętrzną średnicę lewej komory (LVID). Gwiazdka oznacza tylno-przyśrodkowy mięsień brodawkowaty. (B) Apikalny widok czterojamowy z obszarem obrazowania nad zastawką mitralną w celu oznaczenia prędkości szczytowych fal E/A. MVAL, przedni płatek zastawki mitralnej; MVPL, tylny płatek zastawki mitralnej; RV, prawa komora; LV, lewa komora.
Rycina 3. Pozyskiwanie i kwantyfikacja danych echokardiograficznych i dopplerowskich. Rycina ta zawiera reprezentatywne obrazy pozyskanych danych, odpowiadające obrazom echokardiografii 2D przedstawionym na Rycynie 2.A) Obrys w trybie M z liniami wskazującymi średnice końcowoskurczową (ESD) i końcoworozkurczową (EDD). LVAWD/S, grubość przedniej ściany lewej komory (rozkurcz/ skurcz); LVPWD/S, grubość tylnej ściany lewej komory (rozkurcz/ skurcz). (B) Reprezentatywne zapisy obrazowania Dopplera tkankowego tylnej ściany lewej komory (LV). IVRT – czas izowolumetrycznego rozkurczu; IVCT – czas izowolumetrycznego skurczu. Fala E' odpowiada ruchowi pierścienia zastawki mitralnej podczas wczesnego napełniania rozkurczowego LV, a fala A' wynika z skurczu przedsionka podczas późnego napełniania LV. S' reprezentuje prędkość skurczową. (CRejestracja dopplerowska fal tętniących w obrębie końców płatków zastawki mitralnej pozwala na uzyskanie wzorców prędkości przepływu przez zastawkę mitralną, z których można wyznaczyć wczesną prędkość rozkurczową (E), późną prędkość rozkurczową z towarzyszącym skurczem rozkurczowym (A) oraz stosunek E/A. IVRT jest również użyteczną zmienną do charakteryzacji funkcji rozkurczowej oraz ciśnień napełniania. ET oznacza czas wyrzutu.
Dyskusja
Ważne jest, aby ustandaryzować poziom znieczulenia,10 temperaturę ciała oraz częstotliwość pracy serca w grupie myszy, aby ułatwić porównanie między różnymi grupami lub genotypami myszy podczas stosowania echokardiografii w trybie M. W celu oceny funkcji rozkurczowej za pomocą PWD niezbędne jest obniżenie częstości pracy serca, aby móc ocenić właściwości rozkurczowe serca myszy. Funkcje życiowe zwierzęcia muszą być ściśle monitorowane w celu zapobieżenia niewydolności hemodynamicznej i śmierci. Z drugiej strony, podczas pomiarów funkcji skurczowej z wykorzystaniem echokardiografii w trybie M, częstotliwość pracy serca poniżej 400 uderzeń na minutę może spowodować zwiększenie średnic końca rozkurczu z powodu zwiększonego napełnienia LV.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr. Corey'owi Reynoldsowi oraz BCM Mouse Phenotyping Core za ekspercką pomoc przy tym projekcie i uprzejme udostępnienie zaplecza badawczego. X.H.T.W. jest stypendystą W.M. Keck Foundation Distinguished Young Scholar in Medical Research, a jego pracę wspierają również granty NIH/NHLBI R01-HL089598 i R01-HL091947 oraz grant Muscular Dystrophy Association nr 69238. Praca ta jest również częściowo finansowana przez Foundation Leducq Alliance for CaMKII Signaling in Heart.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System mikroobrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości Vevo 770 * | VisualSonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| RMV (Real-time MicroVisualization) 707B 30MHz głowica z kapsułkowanym przetwornikiem | VisualSonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Zintegrowany system szynowy Vevo, w tym jednostka monitorowania parametrów fizjologicznych | VisualSonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Kompaktowy system anestezjologiczny Vevo | VisualSonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Lampa grzewcza | General Supply | ||
| Krem do depilacji (Nair) | General Supply | ||
| Krem elektrodowy Sigma créme | Parker Laboratories Inc. | Part#17-05; www.cardioogyshop.com | |
| Żel do ultrasonografii Ecogel 100 | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | Code 30GB;www.eco-med.com | |
| Standardowe gaziki | Safe Cross First Aid | ||
| Taśma/ patyczki bawełniane/ podkładki grzewcze (x2)/ Clidox/ ddH2O | General Supply | ||
* Wymagane oprogramowanie to oprogramowanie Vevo, w tym aplikacja B-Mode, aplikacja Doppler pulsacyjny oraz pakiet narzędzi do analizy układu sercowo-naczyniowego. |
Bibliografia
- Zhang, T. M. aier, S, L., Dalton, N. D. The deltaC isoform of CaMKII is activated in cardiac hypertrophy and induces dilated cardiomyopathy and heart failure. Circ Res. 92 (8), 912-912 (2003).
- Srivastava, D., Thomas, T., Lin, Q. Regulation of cardiac mesodermal and neural crest development by the bHLH transcription factor, dHAND. Nat Genet. 16 (2), 154-154 (1997).
- Sood, S., Chelu, M. G., van Oort, R. J. Intracellular calcium leak due to FKBP12.6 deficiency in mice facilitates the inducibility of atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5 (7), 1047-1047 (2008).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-907 (1995).
- Tanaka, N., Dalton, N., Mao, L. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1109 (1996).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-708 (2002).
- Garcia-Fernandez, M. A., Azevedo, J., Moreno, M. Regional Left Ventricular Diastolic Dysfunction Evaluated by Pulsed-Tissue Doppler Echocardiography. Echocardiography. 16 (5), 491-491 (1999).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1422 (2008).
- Larsen, T. S., Belke, D. D., Sas, R. Pflugers Arch. 437 (6), 979-979 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D. Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2134 (2002).
Przedruki i uprawnienia
