Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Podsumowanie

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Streszczenie

Wzrost i transport drobnoustrojów w ośrodkach porowatych mają istotny wpływ na jakość wód podziemnych i powierzchniowych, recykling składników odżywczych w środowisku, a także bezpośrednio na przenoszenie patogenów do ujęć wody pitnej. Naturalne ośrodki porowate charakteryzują się złożoną topologią fizyczną, zróżnicowaną chemią powierzchni, dynamicznymi gradientami składników odżywczych i akceptorów elektronów oraz niejednorodnym rozmieszczeniem drobnoustrojów. Cechy te zmieniają się znacząco w skali mikronowej, co utrudnia interpretację wyników badań transportu drobnoustrojów w skali makro oraz stanowi wyzwanie dla walidacji modeli mechanistycznych. W niniejszej pracy demonstrujemy, w jaki sposób proste urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystane do wizualizacji interakcji drobnoustrojów ze ustrukturyzowanymi mikrośrodowiskami, identyfikacji kluczowych procesów wpływających na obserwowane zjawiska oraz systematycznej walidacji modeli predykcyjnych. Proste, łatwe w użyciu komory przepływowe zostały wykonane z przezroczystego, biokompatybilnego i przepuszczalnego dla tlenu materiału, jakim jest poli(dimetylosiloksan). Do wykonania mikrostrukturalnych matryc wykorzystano standardowe metody fotolitografii, a następnie zastosowano odlewanie replik w celu wytworzenia ustrukturyzowanych komór przepływowych z tych matryc. Konstrukcja fizyczna komory przepływowej jest dostosowana do wymagań eksperymentalnych: mikrokanały mogą być zarówno prostymi połączeniami liniowymi, jak i złożonymi topologiami z elementami o rozmiarach sięgających 2 μm. Nasza modułowa macierz komór przepływowych EcoChip zawiera dziesiątki identycznych komór i system kontroli przepływu sterowany modułem grawitacyjnym. Wykazujemy, że dzięki zastosowaniu urządzeń EcoChip można utrzymywać stałe struktury fizyczne i ciśnienia hydrauliczne lub zmieniać je systematycznie, badając jednocześnie wpływ chemii powierzchni, właściwości cieczy lub charakterystyki populacji drobnoustrojów. W ramach eksperymentów transportowych z wykorzystaniem niepatogennego szczepu wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnegoVibriowykorzystując szczep bakteryjny, ilustrujemy znaczenie struktury siedliska, warunków przepływu oraz wielkości inokulum dla fundamentalnych zjawisk transportu i za pomocą obserwacji cząstek w czasie rzeczywistym wykazujemy, że mikrofluidyka oferuje przekonujący wgląd w ukryty świat.

Protokół

I. Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego

1. Pierwszym krokiem w tworzeniu urządzenia mikroprzepływowego jest narysowanie dwuwymiarowego projektu urządzenia w programie do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD). Użyliśmy programu AutoCAD, ale dostępne są również inne programy do rysowania, takie jak CleWin lub CorelDraw.
2. Kolejnym krokiem jest wykonanie maski fotolitograficznej. W zależności od wymiarów urządzenia, wymaganej rozdzielczości i budżetu, maski te mogą być wykonane z chromu (najwyższa rozdzielczość, wysoki koszt), stworzone na błonie fotograficznej, a nawet wydrukowane bezpośrednio na folii do rzutnika za pomocą drukarki o wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku użyliśmy masek Cr wykonanych przez Advance Reproductions Corp., North Andover, MA.
3. Następnym krokiem jest przeniesienie wzoru z maski na światłoczułą żywicę epoksydową w celu stworzenia formy wypukłej.
   1. Najpierw warstwa negatywowego fotorezystu SU8 jest nanoszona metodą wirowania na wafel krzemowy do pożądanej grubości, a następnie wypalana w celu odparowania nadmiaru rozpuszczalnika. Skład fotorezystu i prędkości wirowania kontrolują grubość naniesionej warstwy.
   2. Następnie wzór jest naświetlany określoną dawką światła UV przez maskę. Wypalanie po naświetlaniu powoduje sieciowanie naświetlonych obszarów powłoki fotorezystu, czyniąc je nierozpuszczalnymi.
   3. Następnym etapem jest wywoływanie, podczas którego nienaświetlony rezyst jest usuwany za pomocą chemicznego wywoływacza, pozostawiając pozytywną strukturę wypukłą zwaną matrycą.
   4. Trzeci etap wypalania, zwany wypalaniem utwardzającym, jest opcjonalny i służy do dalszej stabilizacji struktur.
4. Formowanie PDMS
   1. Do formowania replik urządzeń mikroprzepływowych stosujemy elastomer silikonowy poli(dimetylosiloksan) ¹. Najpierw materiał bazowy miesza się w stosunku wagowym 10:1 z utwardzaczem, wlewa do płytkiego naczynia, takiego jak szalka Petri, na formę i odgazowuje w próżni, aż znikną wszystkie widoczne pęcherzyki powietrza.
   2. Matryca z nieutwardzonym PDMS jest następnie umieszczana w precyzyjnie wypoziomowanym piekarniku przez co najmniej 4h w temperaturze 65°C, aby doszło do sieciowania polimeru.
   3. Po zestaleniu PDMS uformowana sekcja jest wycinana z szalki Petri. W górnej części urządzenia wykonuje się otwory, aby uzyskać dostęp do przestrzeni mikroprzepływowych w gotowym urządzeniu.
5. Przytwierdzanie do szkła
   1. Czysty PDMS jest nieodwracalnie łączony z czystym szkłem poprzez ekspozycję na plazmę tlenową. Najpierw uformowany i dziurkowany PDMS oraz czysta płytka szklana są umieszczane powierzchnią wiążącą do góry w oczyszczaczu plazmowym. Użyliśmy oczyszczacza plazmowego PDC-32G Harrick.
   2. Po zamknięciu komory operator uruchamia pompę próżniową, a następnie źródło wysokiej częstotliwości (rf). W komorze dojdzie do samozapłonu plazmy, co objawi się lekkim fioletowym blaskiem.
   3. Po 30 sekundach ekspozycji na plazmę wyłącza się źródło rf, a następnie pompę próżniową.
   4. Szybko wyjmuje się płytkę szklaną i urządzenie z PDMS z komory i doprowadza do bezpośredniego kontaktu (powierzchnią formowanego PDMS do dołu). Stworzy to nieodwracalne wiązanie i sprawi, że właściwości powierzchni staną się hydrofilowe.
   5. W razie potrzeby można uzyskać różną chemię powierzchni PDMS poprzez unieruchomienie białek na powierzchni za pomocą adsorpcji lub wiązania kowalencyjnego.
   6. Urządzenie można następnie napełnić cieczą, taką jak woda dejonizowana, pożywka wzrostowa lub sztuczne wody gruntowe, wykorzystując siły kapilarne lub delikatny nacisk za pomocą strzykawki.

II. Ilościowe określanie przepływu w urządzeniu mikrofluidycznym za pomocą analizy grawimetrycznej

1. Aby skalibrować przepływ wymuszany ciśnieniem w urządzeniu, mikrostrukturalne komory przepływowe wstępnie napełniono wodą DI.
2. Zbiornik zawierający ciecz, taki jak plastikowa strzykawka lub moduł przepływowy (pokazany na Rysunku 1), zostaje podłączony do górnego otworu wlotowego, a wysokość cieczy w zbiorniku jest utrzymywana powyżej wysokości dolnego otworu.
3. Próbki są zbierane w otworze odpływowym w regularnych odstępach czasu i ważone na wadze analitycznej.
4. Nachylenie krzywej przedstawiającej całkowitą objętość w funkcji całkowitego czasu pozwala wyznaczyć średni wolumetryczny przepływ (Rysunek 2). Uzyskano powtarzalne, liniowe średnie prędkości dla szerokiego zakresu ciśnień hydrostatycznych oraz dla różnych systemów utrzymywania ciśnienia.

III. Wizualizacja przepływu, mapowanie prędkości oraz oddziaływania hydrofilowe / hydrofobowe

1. Do kalibracji modelu wykorzystano fluorescencyjne kule lateksowe o średnicy 3 μm z powierzchniami Carboxy YG oraz Plain YG, zakupione w Polysciences, Inc., rozcieńczone w wodzie DI do stężenia 0,01 % ciał stałych.
2. Kule przepływające przez habitaty wizualizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axiovert 25 wyposażonego w monochromatyczną kamerę Mightex BCE-B013-U.
3. Poszczególne klatki obrazu rejestrowano w szybkiej sekwencji, a następnie łączono w filmy za pomocą pakietu oprogramowania ImageJ (Rysunek 3).

IV. Urządzenie mikrofluidyczne (EcoChip) do modelowania wzrostu i transportu bakterii

1. Niepatogenny organizm Vibrio sp. GFP Kan, wykazujący ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, hodowano przez 14 godzin w pożywce Luria-Bertani do uzyskania stężenia około 10⁹ komórek/ml.
2. Bakterie w pożywce wprowadzono do urządzeń EcoChip, pozwalając im na kolonizację urządzenia oraz utworzenie kłaczków i biofilmu w ciągu nocy przez 19 godzin.
3. Następnie z dołków usunięto pożywkę, a wszystkie siedliska przepłukano sztuczną wodą morską (przepis na ASW znajduje się w pracy Wang et al. ²), tak aby w różnych siedliskach pozostały bakterie o różnej gęstości.
4. Jedno siedlisko pozostawiono szczelnie zamknięte bez przepływu, podczas gdy w pozostałych 3 siedliskach utrzymano warunki wolnego przepływu.
5. Zdjęcia wzrostu bakterii w świetle fluorescencyjnym i białym wykonywano co 15-20 godzin przez okres kilku dni (rycina 4).

V. Reprezentatywne wyniki

Moduł przepływu zapewnia prosty sposób regulacji i dystrybucji przepływów przez wiele środowisk. Analiza grawimetryczna okazała się łatwą i bezpośrednią metodą określania szybkości przepływu przez struktury środowisk, które zależą od oporu hydraulicznego środowisk oraz różnic ciśnień między studnią wlotową a wylotową. W eksperymentach z przepływem kulek zaobserwowaliśmy znacznie większą akumulację kulek na powierzchniach urządzenia w przypadku kulek niekarboksylowanych (Rycina 2). Dodatkowo kulki o większej średnicy, 6 i 10 mm, znacznie częściej ulegały uwięzieniu w mniejszych otworach porów i zaczynały gromadzić się w urządzeniu. Wyższe szybkości przepływu ograniczały retencję i uwięzienie cząstek.

Podczas eksperymentów dotyczących wzrostu bakterii wpływ warunków przepływu jest wyraźnie widoczny. Ciągłe siły ścinania powodują agregację bakterii i tworzenie kłaczków, zamiast występowania w formie pojedynczych komórek. Transport dużych kłaczków bakteryjnych jest istotnym procesem środowiskowym, który jest niezwykle trudny do zbadania w systemie makroskopowym.

Rycina 1. Schemat przedstawiający cechy i działanie modułu przepływowego.

Rycina 2. Szybkość przepływu przez ustrukturyzowane siedlisko wyznaczona za pomocą analizy grawimetrycznej dla różnych wysokości kolumn. Stosunek wysokości kolumn: 60 / 40 = 1,5, wyznaczony stosunek szybkości przepływu: 1,04 / 0,71 = 1,46. Uzyskane szybkości przepływu dla H = 40 mm wynoszą V = 0,71 μL/min, a dla H = 60 mm V = 1,04 μL/min. Szacowane średnie prędkości liniowe wynoszą odpowiednio 3,1 mm/s oraz 4,6 mm/s.

Rycina 3. Transport lateksowych kulek 3um z i bez karboksylowania przepływających przez ustrukturyzowane siedliska.

Rysunek 4. Zmiana wzrostu bakterii i tworzenia biofilmu w funkcji gęstości szczepionki w warunkach powolnego przepływu.

Dyskusja

System EcoChip można dostosować do potrzeb konkretnego eksperymentu. Nowe formy matrycowe można tworzyć stosunkowo łatwo, a po wykonaniu matrycy można odlewać dodatkowe, dokładnie powielone urządzenia w zależności od potrzeb. Moduł przepływowy jest prosty w obsłudze, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani złożonych połączeń i może być modelowany jako prosty system przepływu napędzanego ciśnieniem z opadającym poziomem cieczy. Trwają prace nad dalszym rozwojem tego rozwiązania, które obejmują tworzenie kanałów powlekany...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Kuleczki fluorescencyjne	Polysciences, Inc.