Okno na mikroświat: proste systemy mikroprzepływowe do badania transportu mikrobiologicznego w ośrodkach porowatych

Summary

Urządzenia mikroprzepływowe mogą być używane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiedniej skali fizycznej. Opracowaliśmy proste urządzenie mikroprzepływowe, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych porowatych ośrodków do badania wzrostu i transportu bakterii pod powierzchnią.

Abstract

Rozwój i transport mikroorganizmów w porowatych podłożach ma istotny wpływ na jakość wód gruntowych i powierzchniowych, recykling składników odżywczych w środowisku, a także bezpośrednio na przenoszenie patogenów do zasobów wody pitnej. Naturalne porowate ośrodki składają się ze skomplikowanej topologii fizycznej, zróżnicowanej chemii powierzchni, dynamicznych gradientów składników odżywczych i akceptorów elektronów oraz niejednolitego rozmieszczenia drobnoustrojów. Cechy te różnią się znacznie w skali długości mikronów, co sprawia, że wyniki badań transportu mikroorganizmów w skali makro są trudne do interpretacji, a walidacja modeli mechanistycznych stanowi wyzwanie. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób proste urządzenia mikroprzepływowe mogą być wykorzystywane do wizualizacji interakcji mikrobiologicznych z mikrostrukturalnymi siedliskami, do identyfikacji kluczowych procesów wpływających na obserwowane zjawiska oraz do systematycznej walidacji modeli predykcyjnych. Proste, łatwe w użyciu komory przepływowe zostały zbudowane z przezroczystego, biokompatybilnego i przepuszczalnego dla tlenu materiału poli(dimetylosiloksan). Standardowe metody fotolitografii zostały wykorzystane do wykonania mikrostrukturalnych wzorców, a formowanie replik zastosowano do odlewania mikrostrukturalnych komórek przepływowych z wzorców. Fizyczna konstrukcja komory komory przepływowej można dostosować do wymagań eksperymentalnych: mikrokanały mogą się różnić od prostych połączeń liniowych do złożonych topologii o rozmiarach elementów tak małych jak 2 μm. Nasz modułowy układ komór przepływowych EcoChip składa się z dziesiątek identycznych komór i sterowania przepływem za pomocą grawitacyjnego modułu przepływowego. Wykazaliśmy, że dzięki zastosowaniu urządzeń EcoChip struktury fizyczne i głowice ciśnieniowe mogą być utrzymywane na stałym poziomie lub systematycznie zmieniane, podczas gdy badany jest wpływ chemii powierzchni, właściwości płynów lub charakterystyki populacji drobnoustrojów. Poprzez eksperymenty transportowe z wykorzystaniem niepatogennego, eksprymującego białko zielonej fluorescencji szczepu bakterii Vibrio, ilustrujemy znaczenie struktury siedliska, warunków przepływu i wielkości inokulum dla podstawowych zjawisk transportowych, a dzięki obserwacjom w skali cząstek w czasie rzeczywistym pokazujemy, że mikrofluidyka oferuje fascynujący obraz ukrytego świata.

Protocol

I. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

1. Pierwszym krokiem w tworzeniu urządzenia mikroprzepływowego jest narysowanie dwuwymiarowego układu urządzenia w programie do rysowania wspomaganego komputerowo (CAD). Korzystaliśmy z programu AutoCAD, ale dostępne są również inne programy do rysowania, takie jak CleWin lub CorelDraw.
2. Kolejnym krokiem jest wykonanie maski fotolitograficznej. W zależności od wymiarów urządzenia, wymaganej rozdzielczości i budżetu, maski te mogą być wykonane w chromie (najwyższa rozdzielczość, wysoki koszt), wykonane na kliszy fotograficznej, a nawet wydrukowane bezpośrednio na folii nad głową za pomocą drukarki o wysokiej rozdzielczości. Tutaj użyliśmy masek Cr wyprodukowanych przez Advance Reproductions Corp., North Andover, MA.
3. Następnym krokiem jest przeniesienie wzoru z maski na światłoczułą żywicę epoksydową w celu stworzenia formy z wypukłym reliefem.
   1. Najpierw warstwa negatywowego fotorezystu SU8 jest przędzona na płytce silikonowej do pożądanej grubości i wypalana w celu ulatniania się nadmiaru rozpuszczalnika. Formuła fotorezystu i prędkości wirowania kontrolują grubość osadzonej warstwy.
   2. Następnie wzór jest poddawany działaniu wcześniej określonej dawki światła UV przez maskę. Wypalanie po ekspozycji łączy naświetlone światłem obszary powłoki fotorezystu, czyniąc je nierozpuszczalnymi.
   3. Następny jest etap rozwoju, w którym nieodsłonięty opór jest usuwany za pomocą chemicznego wywoływacza, pozostawiając dodatnią strukturę z wypukłym reliefem zwaną wzorcem.
   4. Trzeci etap pieczenia, zwany etapem pieczenia na twardo, jest opcjonalny, aby jeszcze bardziej naprawić struktury.
4. Formowanie PDMS
   1. Używamy elastomeru silikonowego poli(dimetylosiloksan) do formowania replik urządzeń mikroprzepływowych ¹. Najpierw materiał bazowy miesza się w stosunku wagowym 10:1 z utwardzaczem, wylewa na formę w płytkim pojemniku, takim jak szalka Petriego, i odgazowuje w próżni, aż wszystkie widoczne pęcherzyki znikną.
   2. Wzorzec z nieutwardzonym PDMS jest następnie umieszczany w starannie wypoziomowanym piecu na co najmniej 4 godziny w temperaturze 65°C w celu usieciowania polimeru.
   3. Po zestaleniu PDMS formowany odcinek jest wycinany z szalki Petriego. W górnej części urządzenia wybijane są otwory, aby uzyskać dostęp do przestrzeni mikroprzepływowych w gotowym urządzeniu.
5. Mocowanie do szkła
   1. Czysty PDMS jest nieodwracalnie związany z czystym szkłem poprzez wystawienie na działanie plazmy tlenowej. Najpierw uformowany i wykrawany PDMS oraz czysty szkiełko są umieszczane na powierzchni łączącej w czyszczalni plazmowej. Użyliśmy myjki plazmowej PDC-32G Harrick.
   2. Po zamknięciu komory operator włącza pompę próżniową, a następnie częstotliwość radiową lub źródło RF. Plazma sama zapali się w komorze, o czym świadczy lekko fioletowe jarzenie w komorze.
   3. Po wystawieniu na działanie plazmy przez 30 sekund źródło RF, a następnie pompa próżniowa są wyłączane.
   4. Szybko szklany szkiełko i urządzenie PDMS są wyjmowane z komory i doprowadzane do bezpośredniego kontaktu (formowana powierzchnia PDMS do dołu). Utworzy to nieodwracalne wiązanie, a także sprawi, że właściwości powierzchni będą hydrofilowe.
   5. W razie potrzeby za pomocą PDMS można uzyskać różne właściwości chemiczne powierzchni poprzez unieruchomienie białek na powierzchni przez adsorpcję lub wiązanie kowalencyjne.
   6. Urządzenie można następnie napełnić płynem, takim jak woda dejonizowana, pożywka wzrostowa lub sztuczna woda gruntowa za pomocą sił kapilarnych lub delikatnego nacisku strzykawką.

II. Kwantyfikacja przepływu urządzenia mikroprzepływowego za pomocą analizy grawimetrycznej

1. Aby skalibrować przepływ sterowany ciśnieniem w urządzeniu, mikrostrukturalne komórki przepływowe zostały najpierw wstępnie załadowane wodą DI.
2. Zbiornik zawierający ciecz, taki jak plastikowa strzykawka lub moduł przepływowy (pokazany na rysunku 1) jest podłączony do górnej studni wlotowej, a wysokość płynu w zbiorniku jest utrzymywana powyżej wysokości w dolnej studni
.
3. Próbki są pobierane w studzience odpadowej w regularnych odstępach czasu i ważone na wadze analitycznej.
4. Nachylenie krzywej wykreślającej całkowitą objętość w funkcji całkowitego czasu daje średnie objętościowe natężenie przepływu (rysunek 2). Znaleźliśmy powtarzalne, liniowe średnie prędkości dla szerokiego zakresu głowic ciśnieniowych i dla różnych systemów utrzymywania ciśnienia.

III. Wizualizacja przepływu, mapowanie prędkości i oddziaływanie hydrofilowe / hydrofobowe

1. Do kalibracji modelu uzyskano od firmy Polysciences, Inc. fluorescencyjne kulki lateksowe o wielkości 3 μm zarówno na powierzchniach Carboxy YG, jak i Plain YG, które rozcieńczono w wodzie DI do stężenia 0,01 % ciał stałych.
2. Koraliki przepływające przez siedliska zostały zobrazowane na mikroskopie fluorescencyjnym Zeiss Axiovert 25 wyposażonym w monochromatyczną kamerę Mightex BCE-B013-U.
3. Poszczególne klatki zostały przechwycone w krótkich odstępach czasu i zmontowane w filmy za pomocą pakietu oprogramowania ImageJ (ilustracja 3).

IV. Urządzenie mikroprzepływowe (EcoChip) do modelowania wzrostu i transportu bakterii

1. Vibrio sp. GFP Kan, niepatogenny organizm wykazujący ekspresję białka zielonej fluorescencji, hodowano przez 14 godzin w pożywce Luria-Bertani do stężenia około 10⁹ komórek/ml.
2. Bakterie w pożywce wzrostowej wprowadzono do urządzeń EcoChip i pozwolono im skolonizować urządzenie i utworzyć kłaczki i filmy przez noc przez 19 godzin.
3. Następnie pożywki hodowlane zostały usunięte ze studni, a wszystkie siedliska zostały przepłukane sztuczną wodą morską (patrz Wang i in. ² dla receptury ASW), tak aby w różnych siedliskach pozostały różne gęstości bakterii.
4. Jedno siedlisko było utrzymywane w stanie zamkniętym bez przepływu, podczas gdy warunki powolnego przepływu zostały utrzymane w 3 pozostałych siedliskach.
5. Obrazy wzrostu bakterii w świetle fluorescencyjnym i białym wykonywano co 15-20 godzin przez okres kilku dni (ryc. 4).

V. Reprezentatywne wyniki

Moduł przepływu zapewnia proste sposoby regulacji i dystrybucji przepływów przez wiele siedlisk. Analiza grawimetryczna okazała się łatwym i bezpośrednim sposobem określenia natężeń przepływu przez struktury siedliskowe, które zależą od oporu hydraulicznego siedlisk i różnic ciśnień między studniami wejściowymi i wyjściowymi. W eksperymentach z przepływem kulek zaobserwowaliśmy znacznie większą akumulację kulek na powierzchni urządzenia dla kulek niekarboksylowanych (ryc. 2). Dodatkowo, koraliki o większej średnicy, 6 i 10 mm, były znacznie bardziej podatne na porwanie w mniejszych otworach porów i rozpoczęcie gromadzenia się w urządzeniu. Większe prędkości przepływu zmniejszyły zatrzymywanie i porywanie cząstek.

Podczas eksperymentów z rozwojem bakterii, wpływ warunków przepływu jest wyraźnie widoczny. Ciągłe siły ścinające powodują, że bakterie łączą się ze sobą i tworzą kłaczki, a nie jako pojedyncze komórki. Transport dużych kłaczków bakteryjnych jest ważnym procesem środowiskowym, który jest niezwykle trudny do zbadania w układzie makroskopowym.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający cechy i działanie modułu przepływowego.

Rysunek 2. Natężenie przepływu przez siedlisko strukturalne określone za pomocą analizy grawimetrycznej dla różnych wysokości kolumn. Stosunek wysokości kolumny: 60 / 40 = 1,5, wyznaczony stosunek natężenia przepływu: 1,04 / 0,71 = 1,46. Wynikowe natężenia przepływu dla H = 40 mm to V = 0,71 μL/min, a dla H = 60 mm to V = 1,04 μ L/min. Szacowane średnie prędkości liniowe wynoszą odpowiednio 3,1 mm/s i 4,6 mm/s.

Rysunek 3. Transport kulek lateksowych 3um z karboksylacją i bez, przepływających przez ustrukturyzowane siedliska.

Rysunek 4. Zmiana we wzroście bakterii i tworzeniu biofilmu w funkcji gęstości nasion w obecności powolnego przepływu.

Discussion

System EcoChip można dostosować do potrzeb indywidualnego eksperymentu. Nowe wzorce można tworzyć stosunkowo łatwo, a po wyprodukowaniu wzorca można w razie potrzeby odlać dodatkowe dokładnie zreplikowane urządzenia. Moduł przepływu jest prosty w użyciu, nie wymaga specjalnego sprzętu ani skomplikowanych połączeń i może być modelowany jako prosty system przepływu napędzany ciśnieniem głowicy opadającej. Dodatkowe rozszerzenia tych prac są w toku i obejmują tworzenie kanałów pokrytych kwasem humusowym oraz systematyczne z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Koraliki fluorescencyjne	Polysciences, Inc.