Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla kinetyki i określenia powinowactwa w analizie strukturalno-funkcjonalnej

Podsumowanie

Stosujemy analizę interakcji białek bez znaczników za pomocą Biacore X100 do analizy strukturalno-funkcjonalnej wiązania kilku mutantów cystatyny B z papainą poprzez charakterystykę kinetyczną. Analiza stężenia bez kalibracji (CFCA) mierzy stężenie białka o zachowanej aktywności wiązania bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. Pokazujemy, że potwierdzenie stężeń za pomocą CFCA zwiększa wiarygodność analizy kinetycznej i że stałe kinetyczne można wiarygodnie określić nawet wtedy, gdy aktywność rekombinowanego białka jest zmniejszona.

Streszczenie

W tym badaniu badamy interakcję między bydlęcym inhibitorem proteazy cysteinowej cystatyną B a katalitycznie nieaktywną formą papainy (ryc. 1), roślinną proteazą cysteinową, poprzez analizę w czasie rzeczywistym bez znaczników przy użyciu Biacore X100. Powstaje kilka wariantów cystatyny B z mutacjami punktowymi w obszarach interakcji z papainą. Dla każdego wariantu cystatyny B określamy jej specyficzne stężenie wiązania za pomocą analizy stężenia bez kalibracji (CFCA) i porównujemy uzyskane wartości z całkowitym stężeniem białka określonym przez A₂₈₀. Następnie kinetyka każdego wariantu cystatyny B wiążącego się z papainą jest mierzona za pomocą kinetyki jednego cyklu (SCK). Pokazujemy, że jeden z czterech badanych przez nas wariantów cystatyny B jest tylko częściowo aktywny do wiązania. Ta częściowa aktywność, ujawniona przez CFCA, przekłada się na istotną różnicę w stałej szybkości asocjacji (k_a) i powinowactwie (K_D) w porównaniu z wartościami obliczonymi na podstawie całkowitego stężenia białka. Zastosowanie CFCA w połączeniu z analizą kinetyczną w badaniu struktura-funkcja przyczynia się do uzyskania wiarygodnych wyników i pomaga w prawidłowej interpretacji mechanizmu oddziaływania.

Protokół

Rysunek 1. Trójwymiarowa struktura kompleksu cystatyny B (kolor niebieski) z papainą (kolor żółty). Zmutowane reszty cystatyny B są pokazane na czerwono.

1. Zasady analizy interakcji bez etykiet przy użyciu systemów Biacore

W typowym eksperymencie wiązania bez znaczników przy użyciu systemu Biacore, biomolekuła zwana 'ligandem' jest dołączana do powierzchni chipa czujnika. System kanałów przepływowych sprawia, że jego partner wiążący, zwany "analitem", styka się z powierzchnią chipa, gdzie następuje detekcja. Kiedy analit wiąże się z ligandem, wynikająca z tego zmiana masy akumulującej się na powierzchni jest wykrywana przez powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR). Odpowiedź SPR jest proporcjonalna do ilości wiążącego analitu.

Ponieważ wiązanie jest mierzone w czasie rzeczywistym, można określić stałe asocjacji kinetycznej i szybkości dysocjacji dla konkretnej interakcji. Na podstawie tych stałych można obliczyć powinowactwo jako stałą dysocjacji równowagi. Możliwe jest również obliczenie powinowactwa na podstawie danych wiązania w stanie ustalonym. Podobną metodologię można również zastosować do określenia stężenia białka, które specyficznie wiąże się z ligandem na powierzchni.

2. Analiza właściwości kinetycznych oddziaływania białko-białko

W Biacore X100 analiza kinetyczna może być wykonywana przy użyciu kinetyki jednego cyklu. W jednocyklowym eksperymencie kinetycznym, seria stężeń analitu jest wstrzykiwana w jednym cyklu analizy bez regeneracji powierzchni między wstrzyknięciami. W związku z tym kinetyka jednego cyklu umożliwia analizę kinetyczną w sytuacji, gdy trudno jest znaleźć odpowiednie warunki regeneracji.

Po zebraniu danych do eksperymentu kinetycznego, oprogramowanie oceniające Biacore X100 generuje wartości k_a, k_d i K_D, dopasowując dane do modelu interakcji.

3. Metody określania stężenia białka

Analiza interakcji między biomolekułami jest ważna dla zrozumienia ich funkcji. Scharakteryzowanie wiązania białek z innymi białkami, kwasem nukleinowym lub małymi cząsteczkami ma fundamentalne znaczenie dla badań biochemicznych i znajduje zastosowanie w wielu innych dziedzinach, w tym w odkrywaniu leków.

Dla dokładnego pomiaru kinetyki oddziaływania między dwoma oddziałującymi białkami niezbędna jest znajomość stężenia specyficznie wiążącego białka w eksperymentalnej próbce, która jest używana jako analit. Odczyt spektrofotometru A₂₈₀ lub testy kolorymetryczne, takie jak ten wykorzystujący odczynnik Bradforda, jest powszechnie stosowany do określania całkowitego stężenia białka. Jednak zanieczyszczenia białkowe mogą mieć wpływ na wynik. Co ważniejsze, w całkowitym stężeniu białka zawarte są zarówno aktywne, jak i nieaktywne formy białka. Szczególnie w przypadku białek rekombinowanych, które mogą być nieaktywne z powodu nieprawidłowego fałdowania, ważne jest określenie procentowej zawartości białka specyficznie wiążącego w próbce.

W Biacore X100 stężenie związane ze specyficzną aktywnością wiązania może być określone albo przez porównanie poziomów odpowiedzi wiązania z krzywą kalibracyjną wyprowadzoną ze znanego wzorca, albo za pomocą niedawno wprowadzonej metodologii Analizy Stężenia bez Kalibracji (CFCA). CFCA nie opiera się na standardach. Dlatego CFCA jest szczególnie przydatna w przypadku badania zmutowanych form białek, gdzie normy zwykle nie są dostępne.

W eksperymencie CFCA, początkowa szybkość wiązania jest mierzona przy różnych prędkościach przepływu w warunkach, gdy dyfuzja próbki na powierzchnię chipa ogranicza szybkość. Współczynnik dyfuzji analitu, wymiary komory przepływowej i natężenia przepływu są brane pod uwagę przy obliczaniu stężenia właściwego wiązania od początkowej szybkości wiązania^1,2.

W eksperymencie kinetycznym, stężenie analitu jest używane do obliczania stałej szybkości asocjacji kinetycznej i powinowactwa na podstawie danych eksperymentalnych. Zarówno CFCA, jak i pomiar kinetyczny w systemach Biacore opierają się na tych samych właściwościach interakcji. W związku z tym użycie specyficznego stężenia wiązania określonego przez analizę Biacore, a nie całkowitego stężenia białka, zwiększa wiarygodność wyników.

4. Wykorzystanie analizy Biacore do scharakteryzowania interakcji między cystatyną B a papainą

Ssaczy cystatyna B jest odwracalnym, konkurencyjnym i ściśle wiążącym inhibitorem białkowym podobnych do papainy proteinaz cysteinowych, głównie katepsyny B, H, K, L i S. Białka te biorą głównie udział w nieselektywnej wewnątrzkomórkowej degradacji białek. Przypuszcza się, że cystatyny chronią komórki i tkanki przed niewłaściwą proteolizą przez te enzymy. Dezaktywują również proteinazy cysteinowe z pasożytów i wirusów oraz mogą uczestniczyć w obronie przed inwazją takich czynników zakaźnych. Ponadto cystatyny hamują kilka roślinnych proteinaz cysteinowych, takich jak papaina, która jest często wykorzystywana jako enzym modelowy w badaniach strukturalno-funkcjonalnych. Trójwymiarowa struktura kompleksu cystatyny B z papainą³ pokazuje, że interakcja między tymi dwoma białkami jest zdominowana przez kontakty hydrofobowe, które od strony inhibitora są zapewniane przez końce N- i C-końcowe oraz dwie pętle spinki do włosów (ryc. 1). W tym badaniu badamy znaczenie C-końcowego końca i drugiej pętli wiązania cystatyny B dla wiązania z papainą przy użyciu bydlęcych wariantów cystatyny B zawierających mutacje punktowe w obszarach interakcji z papainą. Najpierw określamy specyficzne stężenie wiązania czterech zastosowanych wariantów cystatyny B, a także białka typu dzikiego. Po określeniu specyficznych stężeń wiązania aktywnej cystatyny B mierzy się stałe szybkości i powinowactwa dzikich i zmutowanych wariantów cystatyny B wiążących się z papainą za pomocą Biacore X100.

5. Instrument i odczynniki

1. Warianty cystatyny B Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala i Cys3Ser są wytwarzane zgodnie z wcześniejszym opisem⁴. Wszystkie mutanty zawierają dodatkowe podpodstawienie cysteiny do seryny w pozycji 3, aby zapobiec tworzeniu się nieaktywnych dimerów cystatyny B związanych z dwusiarczkiem.
2. Tarcza papainy jest również przygotowywana zgodnie z wcześniejszym opisem⁵. Jest to S-(metylotio)papaina (MMTS-papaina) posiadająca grupę metylotiologową przyłączoną do Cys25 w aktywnej szczelinie, co sprawia, że proteaza jest katalitycznie nieaktywna.
3. Biacore X100 z pakietem Biacore X100 Plus służy do pomiaru i analizy określonych stężeń wiązania i kinetyki wiązania.
4. MMTS-papaina jest unieruchomiona na chipie czujnika CM5 za pomocą zestawu sprzęgającego aminy Biacore.
5. Serie są wykonywane w temperaturze 25°C, a bufor to 0,01 M Hepes przy pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,0034 M EDTA i 0,05% polisorbatu 20.
6. Pomiędzy każdym wariantem cystatyny B powierzchnia czujnika jest regenerowana za pomocą 20 mM NaOH przez 30 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min.

6.Unieruchomienie liganda MMTS-papaina

Kowalencyjne dołączenie MMTS-papainy do analizy CFCA

CFCA polega na pomiarze szybkości wiązania w warunkach, w których szybkość jest ograniczona przez dyfuzję cząsteczek analitu na powierzchnię (ograniczenie transportu masy). Sprzyja temu wysoki poziom unieruchomienia liganda. Unieruchomienie MMTS-papaina zostało skonfigurowane i przeprowadzone za pomocą kreatora unieruchomienia oprogramowania Biacore X100 Control.

1. Aktywować powierzchnię w komorze przepływowej 2 przez wstrzyknięcie mieszaniny sukcynimidu (NHS) i karbodiimidu (EDC) przez 7 minut przy natężeniu przepływu 10 μl/min. Celę przepływową 1 pozostawia się niezmodyfikowaną, aby mogła być wykorzystana jako powierzchnia odniesienia.
2. Wstrzyknąć MMTS-papainę w dawce 50 μg/ml do buforu octanu sodu o pH 4,5 przez 15 minut przy szybkości przepływu 5 μl/min.
3. Etanoloaminę wstrzykuje się przez 7 minut z szybkością przepływu 10 μl/min w celu dezaktywacji pozostałych aktywnych estrów.

Cała procedura sprzęgania powinna zakończyć się unieruchomieniem ~ 3000 RU MMTS-papaina w komorze przepływowej 2.

Kowalencyjne przywiązanie papainy MMTS do analizy kinetycznej

Ta sama procedura jest używana do unieruchamiania MMTS-papaina do analizy kinetycznej, z tą różnicą, że w analizie kinetycznej poziom unieruchomienia musi być niski, aby uniknąć ograniczenia szybkości wiązania przez dyfuzję. Komora przepływowa 1 również na tym etapie pozostaje niezmodyfikowana, aby mogła być używana jako powierzchnia odniesienia.

4. Po aktywacji powierzchni mieszaniną NHS i EDC, jak w 7.1, MMTS-papaina jest wstrzykiwana w stężeniu 1 μg/ml przez 50 sekund. Następnie powierzchnię dezaktywuje się za pomocą wstrzyknięcia etanoloaminy, jak w kroku 7.3.

Poziom sprzężenia powinien wynosić około 50 RU po tej procedurze.

7. Oznaczanie stężenia cystatyny B za pomocą testu CFCA

1. Eksperyment CFCA jest konfigurowany zgodnie z kreatorem CFCA w pakiecie Biacore X100 Plus. Około 10 nM białka wstrzykuje się przy natężeniach przepływu 10 i 100 μl/min w dwóch odstępach przez 48 sekund. Powierzchnia jest regenerowana za pomocą 20 mM NaOH między każdym cyklem.
2. Uwzględnij ślepe wstrzyknięcia dla każdego natężenia przepływu.
3. Stężenie białka jest następnie oznaczane na podstawie danych wiązania (Rysunek 3) za pomocą funkcji oceny CFCA w oprogramowaniu do oceny pakietu Biacore X100 Plus.
   
   
   Rysunek 2. Wyniki analizy CFCA cystatyny B typu dzikiego. Dane dotyczące specyficznego stężenia wiązania zostały wyodrębnione z sensorgramów uzyskanych przy natężeniach przepływu 10 i 100 μl/min.
   
   
   Rysunek 3. Stężenia mutantów oznaczone za pomocą pomiaru A₂₈₀ (n=3) i CFCA (n=2). Błędy standardowe są oznaczone słupkami błędów. Molowe współczynniki absorpcji obliczono zgodnie z opisem w (6). Można zaobserwować dużą różnicę w wartościach stężeń mutanta Cys3Ser/Leu73Gly wyznaczonych tymi dwiema metodami.
4. Porównując stężenie określone za pomocą pomiaru A₂₈₀ z stężeniem CFCA, jasne jest, że podczas gdy w większości przypadków białko jest w pełni aktywne, w przypadku wariantu Cys3Ser/Leu73Gly frakcja aktywnego białka jest bardzo niska (ryc. 3). Poniższa tabela przedstawia aktywność wariantów cystatyny B w odniesieniu do całkowitych stężeń A₂₈₀. próbka CFCA w odniesieniu do A₂₈₀ (%) Typ dziki 94 Rozdział 94 Cys3Ser/His75Gly Rozdział 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Rozdział Cys3Ser powiedział: Rozdział 83

8. Pomiar kinetyki wiązania cystatyny B z papainą

1. Na podstawie pomiarów CFCA należy przygotować podwójną serię stężeń w zakresie od 2,5 do 40 nM dla każdego z wariantów cystatyny B.
2. Eksperyment kinetyczny jest konfigurowany za pomocą kreatora kinetyki w Biacore X100 z podejściem pojedynczym cyklem. Powierzchnia nie jest regenerowana między iniekcjami, ale po zakończeniu każdego cyklu analizy przy użyciu 20 mM NaOH jako roztworu regeneracyjnego.
3. Skonfiguruj eksperyment w taki sposób, aby każdy cykl zawierający próbkę był otoczony cyklem ślepej próby, w którym zamiast próbki wstrzykiwany jest bufor.
4. Użyj funkcji oceny kinetyki w Biacore X100, aby automatycznie wykonać puste odejmowanie odjętych danych referencyjnych przed dopasowaniem modelu interakcji 1:1.
5. Dane doświadczalne uzyskane dla wiązania wariantów cystatyny B z papainą przedstawiono na rycinie 4. Poniższa tabela podsumowuje stałe asocjacji i szybkości dysocjacji oraz stałe dysocjacji równowagi uzyskane w analizie kinetycznej. próbka k_a (^{M-1 s-1}) K_D (^S-1) K_D (M) Typ dziki 1,8 x 10⁶ Wymiary: 0,41 x ^10-3 Wymiary: 2,3 x ^10-10 szt. Cys3Ser/His75Gly 1,1 x 10⁶ 1,7 x ^10-3 1,5 x ^10-9 szt. Cys3Ser/Leu73Gly 1,1 x 10⁶ Wymiary: 23 x ^10-3 2,2 x ^10-8 szt. Cys3Ser/Tyr97Ala 1,7 x 10⁶ Wymiary 12 x ^10-3 7,1 x ^10-9 Cys3Ser powiedział: 0,9 x 10⁶ 0,53 x ^10-3 Wymiary: 5,8 x ^10-10 szt.
   
   
   Rysunek 4. Profile kinetyczne dla wariantów cystatyny B wiążących się z MMTS-papainą określone za pomocą kinetyki pojedynczego cyklu. Sensorgramy pokazują puste i odjęte dane referencyjne z dopasowaniem kinetycznym dla modelu interakcji 1:1 nałożonym na kolor.
6. Podczas gdy wskaźniki asocjacji mutantów są porównywalne z białkiem typu dzikiego (Figura 5, górny panel), stałe szybkości dysocjacji mutantów mogą być wyższe o blisko dwa rzędy wielkości, z odpowiadającym im wzrostem równowagowej stałej dysocjacji (Rysunek 5, dolny panel).
   
   
   Rysunek 5. Obliczenia stałych szybkości i powinowactwa oparto na stężeniach uzyskanych z CFCA. Zmiany k_a, k_d i K_D, związane z mutacjami, są przedstawione na wykresach.
7. Ponieważ stężenie próbki jest parametrem w obliczeniach stałej szybkości asocjacji na podstawie danych doświadczalnych, ważne jest, aby było ono poprawne. Zastosowanie stężenia opartego na pomiarze A₂₈₀ zamiast CFCA prowadziłoby do wniosku, że Leu73 jest ważny dla wskaźnika asocjacji, gdzie zastąpienie wydaje się skutkować około 10 razy wolniejszym asocjacją niż inne warianty cystatyny B. Jednak specyficzne stężenie wiązania mierzone przez CFCA wynosi w tym przypadku tylko około 10% całkowitego białka. Biorąc to pod uwagę, staje się jasne, że wskaźnik asocjacji dla Leu73 jest podobny do innych wariantów. W związku z tym CFCA pozwala na prawidłową ocenę k_a i k_d, umożliwiając tym samym właściwą interpretację mechanizmu interakcji.

Dyskusja

W niniejszej pracy wyprodukowano cztery mutanty i cystatynę B typu dzikiego w celu oceny znaczenia drugiej pętli wiążącej i C-końcowych końców dla interakcji między cystatyną B a papainą. Badanie to wykazało zalety i łatwość stosowania Biacore X100 do określania specyficznego stężenia wiązania i analizy kinetyki interakcji białko-białko w celu zrozumienia zależności struktura-funkcja. Wykazaliśmy, że pomiar całkowitego stężenia białka nie ujawnia wariantów białek, które mają zmniejszoną aktywność wiązania, co w tym przypadku wprowadza istotny błąd pomiarowy w określeniu powinowactwa i kinetyki wiązania. Specyficzne stężenia wiązania cystatyny B określono za pomocą CFCA z Biacore X100. Wykorzystanie pomiarów stężenia za pomocą CFCA jako danych wejściowych do analizy kinetycznej zaowocowało uzyskaniem wiarygodnych stałych szybkości i powinowactwa, co umożliwiło właściwą interpretację mechanizmu interakcji.

Zmniejszone powinowactwo mutantów było prawie wyłącznie spowodowane zwiększoną wartością k_d, podczas gdy k_a było dotknięte tylko nieznacznie. To zachowanie wskazuje, że zarówno drugi region pętli wiązania, jak i koniec C-końcowy nie są ważne dla szybkości wiązania inhibitora z papainą. Zamiast tego przyczyniają się do powinowactwa do wiązania przede wszystkim poprzez utrzymywanie inhibitora przyłączonego do enzymu po utworzeniu kompleksu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Biacore™ X100 System	GE Healthcare	BR-1100-73	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Biacore™ Pakiet X100 Plus GE	Healthcare	BR-1007-98	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Chip czujnika CM5	GE Healthcare	BR-1000-14	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Amina Zestaw sprzęgający	GE Healthcare	BR-1000-50
Bufor octanowy pH 4,5, 50 ml	GE Healthcare	BR-1003-50
HBS-EP+ bufor 10X, 4 x 50 ml	GE Healthcare	BR-1008-26
Fiolki plastikowe 11 mm	GE Healthcare	BR-1002-87
Nakrętki gumowe, typ 2	GE Healthcare	BR-1004-11