Stosujemy analizę oddziaływań białkowych bez użycia znaczników z wykorzystaniem systemu Biacore X100 do analizy struktura-funkcja wiązania kilku mutantów cystatyny B z papainą poprzez charakterystykę kinetyczną. Analiza stężenia bez kalibracji (CFCA) pozwala zmierzyć stężenie białka zachowującego aktywność wiązania bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. Wykazujemy, że potwierdzenie stężeń za pomocą CFCA zwiększa wiarygodność analizy kinetycznej oraz że stałe kinetyczne można rzetelnie wyznaczyć nawet w przypadku obniżonej aktywności białka rekombinowanego.
Artykuł metodologiczny
Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla wyznaczania kinetyki i powinowactwa w analizie zależności struktura-funkcja
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym badaniu analizujemy interakcję między wołową cystatyną B, będącą inhibitorem cysteinowych proteaz, a katalitycznie nieaktywną formą papainy (Ryc. 1), roślinnej cysteinowej proteazy, z wykorzystaniem analizy bezetykietowej w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu Biacore X100. Przygotowano kilka wariantów cystatyny B z mutacjami punktowymi w obszarach oddziaływania z papainą. Dla każdego wariantu cystatyny B wyznaczono specyficzne stężenie wiązania za pomocą analizy stężenia bez kalibracji (CFCA) i porównano uzyskane wartości z całkowitym stężeniem białka wyznaczonym metodą A280Następnie kinetykę wiązania każdego wariantu cystatyny B z papainą pomiarzono przy użyciu kinetyki jednocyklowej (SCK). Wykazujemy, że jeden z czterech badanych wariantów cystatyny B wykazuje jedynie częściową aktywność wiązania. Ta częściowa aktywność, ujawniona przez CFCA, przekłada się na istotną różnicę w stałej szybkości asocjacji (ka) i powinowactwo (KD), w porównaniu z wartościami obliczonymi przy użyciu całkowitego stężenia białka. Wykorzystanie CFCA w połączeniu z analizą kinetyczną w badaniu struktury i funkcji przyczynia się do uzyskania wiarygodnych wyników i pomaga w prawidłowej interpretacji mechanizmu oddziaływań.
Protokół
Rysunek 1. Trójwymiarowa struktura kompleksu cystatyny B (niebieski) z papainą (żółty). Zmutowane reszty cystatyny B zaznaczono na czerwono.
1. Zasady analizy oddziaływań bez znakowania z wykorzystaniem systemów Biacore
W typowym eksperymencie wiązania bez znakowania z wykorzystaniem systemu Biacore, biomolekuła nazywana „ligandem” jest przytwierdzona do powierzchni chipa sensorycznego. System kanałów przepływowych doprowadza partner wiążący, nazywany „analitem”, do powierzchni chipa, gdzie odbywa się detekcja. Gdy analit wiąże się z ligandem, wynikająca z tego zmiana masy kumulującej się na powierzchni jest wykrywana za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Odpowiedź SPR jest proporcjonalna do ilości związanego analitu.
Ponieważ wiązanie jest mierzone w czasie rzeczywistym, można wyznaczyć kinetyczne stałe szybkości asocjacji i dysocjacji dla konkretnej interakcji. Na podstawie tych stałych możliwe jest obliczenie powinowactwa jako stałej dysocjacji równowagowej. Powinowactwo można obliczyć również na podstawie danych o wiązaniu w stanie stacjonarnym. Podobną metodologię można zastosować do oznaczenia stężenia białka, które specyficznie wiąże się z ligandem na powierzchni.
2. Analiza właściwości kinetycznych oddziaływania białko-białko
W systemie Biacore X100 analizę kinetyczną można przeprowadzić z wykorzystaniem kinetyki jednocyklowej. W eksperymencie z użyciem kinetyki jednocyklowej seria stężeń analitytu jest wstrzykiwana w jednym cyklu analitycznym, bez regeneracji powierzchni pomiędzy wstrzyknięciami. Dzięki temu kinetyka jednocyklowa umożliwia analizę kinetyczną w sytuacjach, gdy trudno jest dobrać odpowiednie warunki regeneracji.
Po zebraniu danych z eksperymentu kinetycznego, oprogramowanie ewaluacyjne Biacore X100 generuje wartości ka, kd oraz KD poprzez dopasowanie danych do modelu oddziaływania.
3. Metody oznaczania stężenia białka
Analiza oddziaływań między biomolekułami jest istotna dla zrozumienia ich funkcji. Charakterystyka wiązania białek z innymi białkami, kwasami nukleinowymi lub małymi cząsteczkami jest fundamentalna dla badań biochemicznych i znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach, w tym w procesie odkrywania leków.
Aby dokładnie zmierzyć kinetykę oddziaływania między dwoma białkami, niezbędna jest znajomość stężenia białka wiążącego specyficznie w próbce eksperymentalnej wykorzystywanej jako analityt. Do określania całkowitego stężenia białka powszechnie stosuje się pomiar spektrofotometryczny A280 lub analizy kolorymetryczne, takie jak metoda z użyciem odczynnika Bradforda. Jednak zanieczyszczenia białkowe mogą wpływać na wynik. Co ważniejsze, całkowite stężenie białka obejmuje zarówno formy aktywne, jak i nieaktywne. Szczególnie w przypadku białek rekombinowanych, które mogą być nieaktywne z powodu nieprawidłowego fałdowania, istotne jest określenie procentowej zawartości białka wiążącego specyficznie w próbce.
W systemie Biacore X100 stężenie związane ze specyficzną aktywnością wiązania można określić albo poprzez porównanie poziomów odpowiedzi wiązania z krzywą kalibracyjną opracowaną na podstawie znanego standardu, albo przy użyciu nowszej metodologii analizy stężeń bez kalibracji (Calibration-Free Concentration Analysis, CFCA). Metoda CFCA nie opiera się na standardzie. W związku z tym CFCA jest szczególnie użyteczna w przypadku badania mutantów białek, dla których standardy zazwyczaj nie są dostępne.
W eksperymencie CFCA początkowa szybkość wiązania jest mierzona przy różnych prędkościach przepływu w warunkach, w których dyfuzja próbki do powierzchni chipa jest etapem limitującym szybkość procesu. Współczynnik dyfuzji analitytu, wymiary komory przepływowej oraz prędkości przepływu są brane pod uwagę podczas obliczania specyficznego stężenia wiązania na podstawie początkowej szybkości wiązania1,2.
W eksperymencie kinetycznym stężenie anality jest wykorzystywane w obliczeniach stałej szybkości asocjacji kinetycznej oraz powinowactwa na podstawie danych eksperymentalnych. Zarówno CFCA, jak i pomiary kinetyczne w systemach Biacore opierają się na tych samych właściwościach oddziaływań. Dlatego zastosowanie specyficznego stężenia wiązania określonego w analizie Biacore, zamiast całkowitego stężenia białka, zwiększa wiarygodność wyników.
4. Wykorzystanie analizy Biacore do charakterystyki oddziaływania między cystatyną B a papainą
Ssakia cystatyna B jest odwracalnym, konkurencyjnym i silnie wiążącym białkowym inhibitorem cysteinowych proteinaz papainopodobnych, przede wszystkim katepsyn B, H, K, L i S. Białka te biorą udział głównie w nieselektywnej wewnątrzkomórkowej degradacji białek. Przypuszcza się, że cystatyny chronią komórki i tkanki przed niewłaściwą proteolizą prowadzoną przez te enzymy. Inaktywują one również cysteinowe proteinazy pochodzące z pasożytów i wirusów, a także mogą uczestniczyć w obronie przed inwazją takich czynników zakaźnych. Ponadto cystatyny hamują kilka roślinnych cysteinowych proteinaz, takich jak papaina, która jest często wykorzystywana jako enzym modelowy w badaniach nad relacją struktura-funkcja. Struktura trójwymiarowa kompleksu cystatyny B z papainą3 wykazuje, że w oddziaływaniu między tymi dwoma białkami dominują kontakty hydrofobowe, które po stronie inhibitora są zapewnione przez końce N- i C-terminalne oraz dwie pętle typu spinka do włosów (Ryc. 1). W niniejszym badaniu analizujemy znaczenie końca C-terminalnego oraz drugiej pętli wiążącej cystatyny B dla wiązania z papainą, wykorzystując warianty bydlęcej cystatyny B zawierające mutacje punktowe w obszarach oddziaływania z papainą. W pierwszej kolejności określamy stężenie wiązania specyficznego dla czterech zastosowanych wariantów cystatyny B, a także dla białka typu dzikiego. Po wyznaczeniu specyficznych stężeń wiązania aktywnych cystatyn B, za pomocą urządzenia Biacore X100 mierzymy stałe szybkości i powinowactwa wiązania wariantu typu dzikiego oraz wariantów zmutowanych cystatyny B do papainy.
5. Aparatura i odczynniki
- Warianty cystatyny B Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala oraz Cys3Ser są otrzymywane zgodnie z opisaną wcześniej procedurą4. Wszystkie mutanty zawierają dodatkową substytucję cysteiny na serynę w pozycji 3, aby zapobiec tworzeniu nieaktywnych dimerów cystatyny B powiązanych mostkami disiarczkowymi.
- Cel w postaci papainy jest również przygotowywany zgodnie z opisaną wcześniej procedurą5. Jest to S-(metylotio) papaina (MMTS-papain), posiadająca grupę metylotio przyłączoną do Cys25 w szczelinie aktywnej, co czyni proteazę katalitycznie nieaktywną.
- Do pomiaru i analizy specyficznych stężeń wiązania oraz kinetyki wiązania wykorzystywany jest system Biacore X100 z pakietem Biacore X100 Plus Package.
- MMTS-papain jest unieruchamiana na Sensor Chip CM5 przy użyciu Biacore Amine Coupling Kit.
- Pomiary są przeprowadzane w temperaturze 25°C, a jako bufor stosuje się 0,01 M Hepes o pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,0034 M EDTA oraz 0,05% polisorbatu 20.
- Między analizami poszczególnych wariantów cystatyny B powierzchnia sensora jest regenerowana przy użyciu 20 mM NaOH przez 30 sekund przy szybkości przepływu 10 μl/min.
6. Immobilizacja ligandu MMTS-papaina
Kowalencyjne przyłączenie MMTS-papainy do analizy CFCA
Metoda CFCA opiera się na pomiarze szybkości wiązania w warunkach, w których szybkość ta jest ograniczona dyfuzją cząsteczek analitycznych do powierzchni (ograniczenie transportu masy). Sprzyja temu wysoki poziom immobilizacji ligandu. Immobilizację MMTS-papainy skonfigurowano i przeprowadzono przy użyciu kreatora immobilizacji w oprogramowaniu Biacore X100 Control.
- Aktywować powierzchnię w komórce przepływowej 2 poprzez wstrzyknięcie mieszaniny sukcynimidu (NHS) i karbodiimidu (EDC) przez 7 minut przy szybkości przepływu 10 μl/min. Komórka przepływowa 1 pozostaje niezmodyfikowana, aby służyć jako powierzchnia referencyjna.
- Wstrzyknąć MMTS-papainę w stężeniu 50μg/ml w buforze octanu sodu o pH 4.5 przez 15 minut przy szybkości przepływu 5 μl/min.
- Wstrzyknąć etanolaminę przez 7 minut przy szybkości przepływu 10 μl/min w celu dezaktywacji pozostałych estrów aktywnych.
Cała procedura sprzęgania powinna doprowadzić do unieruchomienia ~ 3000 RU MMTS-papainy w komórce przepływowej 2.
Kowalencyjne przyłączenie MMTS-papainy do analizy kinetycznej
Tę samą procedurę stosuje się do unieruchamiania MMTS-papainy w celu przeprowadzenia analizy kinetycznej, z tą różnicą, że w analizie kinetycznej poziom unieruchomienia musi być niski, aby uniknąć ograniczenia szybkości wiązania przez dyfuzję. Komora przepływowa 1 pozostaje również w tym kroku niemodyfikowana, aby mogła służyć jako powierzchnia referencyjna.
- Po aktywacji powierzchni mieszaniną NHS i EDC zgodnie z punktem 7.1, wstrzykuje się MMTS-papainę w stężeniu 1μg/ml przez 50 sekund. Następnie powierzchnię dezaktywuje się poprzez wstrzyknięcie etanolaminy, zgodnie z krokiem 7.3.
Po zakończeniu tej procedury poziom sprzęgania powinien wynosić około 50 RU.
7. Wyznaczanie stężenia cystatyny B za pomocą testu CFCA
- Eksperyment CFCA jest konfigurowany zgodnie z kreatorem CFCA w pakiecie Biacore X100 Plus. Około 10 nM białka jest wstrzykiwane przy szybkościach przepływu 10 i 100 μl/min w dwóch powtórzeniach przez 48 sekund. Powierzchnia jest regenerowana za pomocą 20 mM NaOH pomiędzy każdym cyklem.
- Należy uwzględnić wstrzyknięcia ślepe dla każdej szybkości przepływu.
- Stężenie białka jest następnie wyznaczane na podstawie danych wiązania (Rycina 3) przy użyciu funkcji oceny CFCA w oprogramowaniu analitycznym pakietu Biacore X100 Plus.
Rycina 2. Wyniki analizy CFCA dla cystatyny B typu dzikiego. Dane dotyczące specyficznego stężenia wiązania zostały wyodrębnione z sensorgramów uzyskanych przy szybkościach przepływu 10 i 100 μl/min.
Rycina 3. Stężenia mutantów wyznaczone za pomocą pomiaru A280 (n=3) oraz CFCA (n=2). Błędy standardowe są oznaczone słupkami błędów. Molowe współczynniki absorpcji obliczono zgodnie z opisem w (6). Można zaobserwować dużą różnicę w wartościach stężeń mutanta Cys3Ser/Leu73Gly wyznaczonych dwiema metodami. - Przy porównaniu stężenia wyznaczonego pomiarem A280 ze stężeniem wyznaczonym metodą CFCA wyraźnie widać, że o ile w większości przypadków białko jest w pełni aktywne, o tyle dla wariantu Cys3Ser/Leu73Gly frakcja aktywnego białka jest bardzo niska (Rycina 3). Poniższa tabela przedstawia aktywności wariantów cystatyny B w stosunku do stężeń całkowitych wyznaczonych metodą A280.
Próbka CFCA w stosunku do A280 (%) Typ dziki 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83
8. Pomiar kinetyki wiązania cystatyny B do papainy
- Na podstawie pomiarów CFCA przygotować dwukrotnie rozcieńczoną serię stężeń w zakresie od 2,5 do 40 nM dla każdego z wariantów cystatyny B.
- Eksperyment kinetyczny konfiguruje się za pomocą kreatora kinetyki w Biacore X100 z zastosowaniem podejścia pojedynczego cyklu. Powierzchnia nie jest regenerowana pomiędzy iniekcjami, lecz po zakończeniu każdego cyklu analizy przy użyciu 20 mM NaOH jako roztworu regenerującego.
- Skonfigurować eksperyment tak, aby każdy cykl zawierający próbkę był poprzedzony i zakończony cyklem pustym, w którym zamiast próbki wstrzykiwany jest bufor.
- Użyć funkcji oceny kinetycznej w Biacore X100, aby automatycznie przeprowadzić odejmowanie tła z danych po odjęciu referencji przed dopasowaniem modelu oddziaływania 1:1.
- Dane eksperymentalne uzyskane dla wiązania wariantów cystatyny B z papainą przedstawiono na rysunku 4. Poniższa tabela podsumowuje stałe szybkości asocjacji i dysocjacji oraz stałe dysocjacji równowagowej uzyskane w analizie kinetycznej.
Próbka ka (M-1 s-1) kd (s-1) KD (M) Typ dziki 1.8 x 106 0.41 x 10-3 2.3 x 10-10 Cys3Ser/His75Gly 1.1 x 106 1.7 x 10-3 1.5 x 10-9 Cys3Ser/Leu73Gly 1.1 x 106 23 x 10-3 2.2 x 10-8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1.7 x 106 12 x 10-3 7.1 x 10-9 Cys3Ser 0.9 x 106 0.53 x 10-3 5.8 x 10-10 
Rysunek 4. Profile kinetyczne wiązania wariantów cystatyny B z MMTS-papainą określone za pomocą kinetyki pojedynczego cyklu. Sensogramy przedstawiają dane po odjęciu tła i referencji z nałożoną czarną linią dopasowania kinetycznego dla modelu oddziaływania 1:1. - Podczas gdy szybkości asocjacji mutantów są porównywalne z szybkością białka typu dzikiego (rysunek 5, panel górny), stałe szybkości dysocjacji mutantów mogą być wyższe niemal o dwa rzędy wielkości, z odpowiadającym temu wzrostem stałej dysocjacji równowagowej (rysunek 5, panel dolny).
Rysunek 5. Obliczenia stałych szybkości i powinowactwa oparto na stężeniach uzyskanych z CFCA. Zmiany ka, kd i KD związane z mutacjami przedstawiono na wykresach. - Ponieważ stężenie próbki jest parametrem w obliczaniu stałej szybkości asocjacji z danych eksperymentalnych, istotne jest, aby było ono prawidłowe. Użycie stężenia opartego na pomiarze A280 zamiast CFCA doprowadziłoby do wniosku, że Leu73 jest istotny dla szybkości asocjacji, a jego zastąpienie wydaje się skutkować około 10-krotnie wolniejszą asocjacją niż w przypadku innych wariantów cystatyny B. Jednakże stężenie wiązania specyficznego zmierzone za pomocą CFCA stanowi w tym przypadku tylko około 10% całkowitego białka. Po uwzględnieniu tego faktu staje się jasne, że szybkość asocjacji dla Leu73 jest podobna do szybkości innych wariantów. Zatem CFCA pozwala na prawidłową ocenę ka i KD, umożliwiając tym samym właściwą interpretację mechanizmu oddziaływania.
Dyskusja
W niniejszej pracy otrzymano cztery mutanty oraz typ dziki cystatyny B, aby ocenić znaczenie drugiej pętli wiążącej oraz końców C-terminalnych dla oddziaływania między cystatyną B a papainą. Badanie to wykazało zalety i łatwość zastosowania Biacore X100 w celu wyznaczenia specyficznego stężenia wiązania oraz analizy kinetyki oddziaływań białko-białko w celu zrozumienia zależności między strukturą a funkcją. Wykazaliśmy, że pomiar całkowitego stężenia białka nie ujawnia wariantów białek o obniżonej aktywności wiązania, co w tym przypadku wprowadza znaczący błąd pomiarowy przy wyznaczaniu powinowactwa wiązania i kinetyki. Specyficzne stężenia wiązania wariantów cystatyny B wyznaczono za pomocą CFCA z użyciem Biacore X100. Wykorzystanie pomiarów stężenia metodą CFCA jako danych wejściowych do analizy kinetycznej pozwoliło na uzyskanie wiarygodnych stałych szybkości i powinowactwa, umożliwiając tym samym prawidłową interpretację mechanizmu oddziaływania.
Zmniejszone powinowactwa mutantów wynikały niemal wyłącznie ze zwiększonej wartości kd, podczas gdy wartość ka uległa jedynie niewielkiej zmianie. Takie zachowanie wskazuje, że zarówno region drugiej pętli wiążącej, jak i koniec C-końcowy nie są istotne dla szybkości wiązania inhibitora z papainą. Zamiast tego wpływają one na powinowactwo wiązania przede wszystkim poprzez utrzymywanie inhibitora przyłączonego do enzymu po utworzeniu kompleksu.
Oświadczenia
Autor jest zatrudniony przez firmę GE Healthcare, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System Biacore™ X100 | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Pakiet Biacore™ X100 Plus | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Chip sensorowy CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Zestaw do sprzęgania aminowego | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Bufor octanowy pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | |
| Bufor HBS-EP+ 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | |
| Fiolki plastikowe 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | |
| Zakrętki gumowe, typ 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |
Bibliografia
- Christensen, L. L. H. Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation. Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).
- Sigmundsson, K., Mâsson, G., Rice, R., Beauchemin, N., Öbrink, B. Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification. Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).
- Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction. EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).
- Pol, E., Björk, I. Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases. Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).
- Björk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes. Biochem. J. 299, 219-225 (1994).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).
Przedruki i uprawnienia
