Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Streszczenie

Chemotaksja pozwala bakteriom zbliżać się do źródeł substancji przyciągających lub unikać źródeł substancji odpychających. Bakterie nieustannie monitorują stężenie konkretnych chemoefektorów, porównując aktualne stężenie ze stężeniem wykrytym kilka sekund wcześniej. Porównanie to determinuje wypadkowy kierunek ruchu. Chociaż w naturze często współistnieją liczne, konkurujące ze sobą gradienty, konwencjonalne podejścia do badania chemotaksji bakteryjnej są suboptimalne w kontekście ilościowego określania migracji w odpowiedzi na gradienty stężeń substancji przyciągających i odpychających. W niniejszej pracy opisujemy opracowanie mikrofluidycznego modelu chemotaksji służącego do prezentowania bakteriom precyzyjnych i stabilnych gradientów stężeń chemoefektorów oraz ilościowego badania ich odpowiedzi na zastosowany gradient. Urządzenie jest wszechstronne, ponieważ dzięki mieszaniu dyfuzyjnemu można w nim łatwo generować gradienty stężeń o dowolnej pożądanej wartości bezwzględnej i sile gradientu. Działanie urządzenia zademonstrowano, wykorzystując odpowiedźEscherichia coli RP437 do gradientów aminokwasów i jonów niklu.

Protokół

1. Wytwarzanie matryc krzemowych przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8¹(nie pokazano w tym filmie).

1. Należy zastosować standardowe metody fotolitografii SU-8 w celu stworzenia „matrycy” SU-8 (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) do wykonania formy z PDMS zawierającej sieć mikroprzepływową i komorę chemotaktyczną. Takie formy matrycowe można wykonać w dowolnej jednostce mikrowytwórczej (np. Stanford Microfluidics Foundry; http://thebigone.stanford.edu/foundry/).
2. Przed powielaniem w PDMS należy poddać matrycę SU-8 działaniu par fluorosilanu w eksykatorze podłączonym do źródła próżni, aby ułatwić oddzielenie PDMS od matrycy. Należy nanieść kroplę fluorosilanu na ręcznik papierowy i zastosować próżnię przez 1 min. Następnie należy odciąć próżnię i odczekać 30 min na osadzenie się fluorosilanu. Matrycę SU-8 należy przechowywać w zamkniętym pojemniku do późniejszego użycia.

2. Formowanie replikacyjne PDMS z matrycy SU-8: Warstwa fluidyczna i warstwa sterująca są wytwarzane poprzez formowanie replikacyjne PDMS z matrycy SU-8.

1. Wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1 i odgazować w eksyكاتهrze przez 1 godzinę (lub do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS).
2. Umieścić matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlać mieszaninę PDMS na matrycę SU-8 do pożądanej grubości.
3. Podgrzewać szalkę Petriego zawierającą PDMS i formę matrycy SU-8 w temperaturze 80°C przez dwie godziny, aby utwardzić PDMS.
4. Zdjąć utwardzoną matrycę SU-8 pokrytą PDMS z płyty grzejnej i oddzielić formę z PDMS od matrycy SU-8. Pożądana struktura zostanie zatopiona w formie z PDMS.
5. Wywiercić w formie z PDMS otwory na rurki prowadzące do generatora gradientu i wlotu komórek, używając tępej igły o rozmiarze 20 G.

3. Bondowanie urządzeń z PDMS:

1. Oczyść szklany szkiełko mikroskopowe izopropanolem i wysusz azotem lub strumieniem powietrza.
2. Poddaj PDMS i szkiełko szklane działaniu plazmy tlenowej w urządzeniu do trawienia plazmowego.
3. Dociśnij formę z PDMS do szkiełka szklanego. Podgrzewaj połączone szkiełko i formę z PDMS w temperaturze 65°C przez 15 min.

4. Montaż urządzenia z PDMS

1. Za pomocą żyletki odciąć rurkę pod kątem 45°, zachowując odpowiednią długość wymaganą dla urządzenia.
2. Wprowadzić jeden koniec rurki do otworów wykonanych w urządzeniu (np. wylotu), używając pęsety.
3. Za pomocą pęsety wprowadzić tępą igłę o rozmiarze 30G do drugiego końca rurki.
4. Powtórzyć krok 4.2 dla wszystkich pozostałych otworów.
5. Pobrać 1mL buforu do chemotaksji (CB) do strzykawki 3mL, dbając o usunięcie pęcherzyków powietrza ze strzykawki.
6. Zamocować piastę igły na jednym końcu rurki wylotowej.
7. Dodać CB do piasty igły, a następnie opukać piastę, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.
8. Wypchnąć niewielką ilość CB z końcówki strzykawki i połączyć strzykawkę 3mL z piastą igły w sposób zapobiegający uwięzieniu powietrza.
9. Przepchnąć CB przez urządzenie, aż wszystkie pozostałe piasty igieł zostaną wypełnione CB. Powinno to usunąć większość pęcherzyków powietrza.
10. Napełnić dwie strzykawki 500μL buforem CB zawierającym odpowiednie stężenia testowanego chemoefektora. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, wypchnąć małą kroplę zawartości strzykawki, dotknąć kropli do cieczy w piastach igieł i połączyć elementy.
11. W podobny sposób połączyć strzykawkę zawierającą CB z wlotem dla bakterii. Zostanie ona usunięta w momencie wprowadzania bakterii do urządzenia.

5. Hodowla wysoko ruchliwych E. coli

1. Hoduj nocne kultury E. coli RP437 z plazmidem ekspresyjnym GFP w 20 mL bulionu tryptonowego (TB) w temperaturze 32°C z wytrząsaniem. Dodaj odpowiednie stężenia antybiotyku w celu utrzymania plazmidu. W naszym protokole stosujemy plazmid o niskiej liczbie kopii pCM182 do detekcji bakterii na podstawie fluorescencji w urządzeniu. W przypadku E. coli zaleca się hodowlę w 32°C dla zapewnienia wysokiej ruchliwości, ponieważ ruchliwość jest niższa w wyższych temperaturach.
2. Wykorzystaj nocną kulturę do zaszczepienia 20 mL kultury TB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 mL do gęstości optycznej przy 600nm wynoszącej ~ 0,05. Hoduj kulturę z wytrząsaniem w 32°C.
3. Zbierz komórki przy OD₆₀₀ wynoszącej ~0,35–0,45 poprzez wirowanie z niską prędkością 400 x g przez 5 min.
4. Resuspenduj komórki do OD₆₀₀ ~0,35 w buforze CB zawierającym chemoefektor w stężeniu przewidywanym w środku kanału.
5. Dodaj martwe komórki znakowane RFP przy OD₆₀₀ ~ 0,35 do żywych komórek ekspresyjnych GFP. Martwe (czerwone) komórki służą jako kontrola wewnętrzna, aby upewnić się, że jakakolwiek migracja nie wynika z efektów przepływu.

6. Monitorowanie chemotaksji

1. Usuń część CB z piasty igły wlotowej do komory. Uzupełnij ją zawiesiną komórkową.
2. Ostrożnie napełnij strzykawkę 50 μL resuspensowanymi komórkami. Krok ten należy wykonać powoli, ponieważ flagella mogą zostać odcięte, co zmniejszy ruchliwość.
3. Przymocuj strzykawkę 50 μL do piasty igły wlotowej zgodnie z opisem w kroku 4.10.
4. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę do akwizycji obrazów. Umieść strzykawki wlotowe (zarówno strzykawki gradientowe 500 μL, jak i strzykawkę z komórkami 50 μL) w pompie strzykawkowej i rozpocznij przepływ tak, aby utworzył się gradient, a komórki zaczęły przepływać przez cewki.
5. Po wprowadzeniu komórek do komory chemotaktycznej odczekaj około 20 min aż system się ustabilizuje przed rozpoczęciem obrazowania.
6. Zbierz obrazy fluorescencji zielonej (żywe komórki) i czerwonej (martwe komórki) w różnych miejscach wzdłuż komory (odpowiadających różnym czasom ekspozycji). Zazwyczaj zbieramy 100 obrazów w każdym punkcie w odstępach 3 s.

7. Analiza danych: następujące kroki można wykonać przy użyciu dowolnego dostępnego komercyjnie programu do analizy obrazu (np. ImageJ, Metamorph) lub za pomocą prostych kodów napisanych w programie Matlab.

1. Usuń piksele tła z obrazu (tzn. ustaw próg intensywności pikseli i usuń wszystkie piksele, których intensywność jest niższa od progu). Minimalizuje to szum w analizie.
2. Wykorzystaj położenie martwych komórek (czerwona fluorescencja) do wyznaczenia centrum obrazu. Ponieważ martwe komórki nie wykazują chemotaksji, reprezentuje to pozycję, w której komórki weszły do komory chemotaktycznej i byłyby wykryte w przypadku braku jakiejkolwiek migracji.
3. Zlokalizuj żywe komórki (zielona fluorescencja) na obrazie.
4. Podziel obraz na kanały i określ liczbę żywych komórek w każdym kanale. W naszej poprzedniej pracy³ komora chemotaktyczna o szerokości 1050 μm została podzielona na 64 kanały o szerokości ok. 16 μm każdy.
5. Powtórz kroki 7.1–7.3 dla wszystkich obrazów i zsumuj całkowitą liczbę komórek dla każdego kanału we wszystkich obrazach. Pozwala to uzyskać całkowitą liczbę komórek wykrytych w każdym kanale w czasie trwania eksperymentu.
6. Oblicz współczynnik podziału chemotaksji (CPC), który reprezentuje kierunek migracji, w następujący sposób: każdej komórce znajdującej się po stronie wysokiego stężenia (prawej) i niskiego stężenia (lewej) względem martwych komórek przypisuje się mnożnik odpowiednio +1 i -1. Oznacza to, że komórka migrująca w górę gradientu jest mnożona przez +1, natomiast komórki poruszające się w dół gradientu są mnożone przez -1. Wszystkie pomnożone wartości są sumowane i normalizowane do całkowitej liczby wykrytych komórek. Na przykład wartość CPC wynosząca 0,40 wskazuje, że o 40% więcej całkowitej liczby bakterii przemieściło się na stronę wysokiego stężenia niż na stronę niskiego stężenia (tzn. chemoefektor jest atraktantem, ponieważ wykryto więcej bakterii poruszających się w górę gradientu).
7. Oblicz współczynnik migracji chemotaktycznej (CMC), który waży migrację komórek w zależności od przebytej odległości, w następujący sposób: pomnóż liczbę komórek w każdym kanale przez czynnik proporcjonalny do odległości, na jaką migrują komórki. Komórka, która przemieszcza się do najdalej położonej pozycji wysokiego stężenia (kanał 64), otrzymuje czynnik wagowy +1, natomiast komórka, która przemieściła się do połowy strony o wyższym stężeniu, otrzymuje czynnik wagowy +0,5, a komórka przemieszczająca się do najdalej położonej pozycji niskiego stężenia jest ważona przez -1. Zsumuj wszystkie ważone liczby komórek i znormalizuj je do liczby komórek, aby wygenerować CMC.

Reprezentatywne wyniki^3,4:

Wykorzystaliśmy urządzenie mikrofluidyczne (Rysunek 1A) opisanej w niniejszym opracowaniu w celu zbadania chemotaksji E. coli w gradientach atraktantów (kwas asparginowy, autoinduktor-2) i repelentów (NiSO₄, indol)^3,4Prototypowy szczep chemotaktyczny⁵ E. coli Wykorzystano szczep RP437 eksponujący GFP, a także szczep zabity kanamycyną E. coli Komórki TG1 wykazujące ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego w celu monitorowania efektów przepływu. Gradient stężeń utworzony w μFlow urządzenie przedstawiono na Rysunek 1BWlot komory został zamknięty w taki sposób, aby uniemożliwić przepływ, a w urządzeniu ustanowiono stabilny gradient fluoresceiny w zakresie 0–100 ng/mL. Do wyznaczenia profilu stężeń fluoresceiny wykorzystano intensywność pikseli w obrębie urządzenia. Dane wykazują, że bakterie napotykają gradient liniowy w momencie wejścia do komory chemotaksji. Rycina 2A i B przedstawia obrazy fluorescencyjne E. coli Migracja RP437 w odpowiedzi na gradienty kwasu asparaginowego (0 100 μM) i NiSO₄ (0 225 μM). Zaobserwowane reakcje na te kanoniczne substancje wabiące i odstraszające są zgodne z przewidywaniami. Rycina 3A przedstawia ilościowy rozkład E. coli RP437 w przypadku braku gradientu stężeń (tzn. zerowego gradientu kwasu asparginowego), podczas gdy Ryciny 3B i C przedstaw rozkład gradientów kwasu asparginowego i NiSO4₄Specyficzność tych odpowiedzi (tj. stronniczość w migracji) jest widoczna jako E. coli RP437 ΔSmała szczep (tj. szczep pozbawiony chemoreceptora Tar, który jest wykorzystywany w E. coli (do wykrywania kwasu asparaginowego i niklu) nie wykazuje błędu migracji w obecności gradientu stężeń kwasu asparaginowego lub NiSO4₄Trendy widoczne w profilach rozkładu przestrzennego są również zgodne z obliczonymi wartościami CPC i CMC. Wartości CPC dla migracji E. coli RP437 w gradientach kwasu asparaginowego lub NiSO₄₄ wynoszą odpowiednio +0,33 i -0,33. Odpowiednie wartości CMC wynoszą odpowiednio +0,13 i -0,14. W przeciwieństwie do tego wartości CPC i CMC z E. coli RP437 ΔSmała szczepy w gradientach kwasu asparaginowego lub NiSO4₄ są pomijalne. Ponadto wartość CPC i CMC w gradiencie zerowym kwasu asparaginowego wynosi odpowiednio +0,03 i +0,02, co wskazuje na brak błędu migracji w przypadku braku gradientu.

Rycina 1. Schemat urządzenia i gradient stężeń.
(A) Schematyczne przedstawienie mikrofluidycznego urządzenia do chemotaksji. Urządzenie składa się z modułu mieszania gradientu (20 x 100 x 18750 μm) oraz modułu obserwacji chemotaksji (20 x 1050 x 11500 μm). Szerokość dwóch kanałów gradientowych doprowadzonych do urządzenia wynosi 500 μm, a szerokość wlotu dla bakterii wynosi 50 μm. Wstawka przedstawia gradient cząsteczki sygnałowej (szarej) oraz bakterie migrujące w odpowiedzi na ten sygnał. Żywe bakterie przedstawiono jako pełne owale, natomiast martwe bakterie jako owale puste. (B) W urządzeniu wygenerowano gradient stężeń fluoresceiny od 0 do 100 ng/mL i zobrazowano go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy fluorescencyjne zarejestrowano po 30 min i poddano kwantyfikacji poprzez analizę obrazu.

Rycina 2. Chemotaksja E. coli RP437 w urządzeniu mikrofluidycznym.
E. coli RP437 wystawiono w urządzeniu na gradient (A) 0-100 μM L-asparaginianu lub (B) 0-225 μM NiSO₄; migrację żywych bakterii (zielone) w kierunku L-asparaginianu lub z dala od niklu obrazowano co 2,5 sec przez 30 min. Martwe bakterie (czerwone) służyły jako kontrola efektów przepływu w urządzeniu. Obrazy poddano kwantyfikacji przy użyciu opracowanego wewnętrznie programu analitycznego3. Przedstawione dane to reprezentatywne obrazy w pseudokolorach z trzech niezależnych eksperymentów.

Rycina 3: Ilościowe określenie profili migracji w odpowiedzi na kanoniczny atraktant i repelent.
Rozkład przestrzenny RP437 w urządzeniu mikrofluidycznym w odpowiedzi na (A) jednorodne 100 μM L-asparaginianu (tzn. brak gradientu), (B) gradient asparaginianu 0 100 μM oraz (C) gradient NiSO₄ 0 225 μM. Rozkład martwych komórek przedstawiono linią ciągłą, rozkład komórek RP437 linią przerywaną, a rozkład komórek RP437 eda⁺ Δtar linią kropkowaną. Przedstawione dane są średnimi z trzech niezależnych eksperymentów.

Dyskusja

Współczynnik podziału chemotaksji (CPC) oraz współczynnik migracji chemotaktycznej (CMC) można obliczyć zgodnie z opisem Mao et al⁵. Jeśli komórka zostanie wykryta po stronie wysokiego stężenia, przypisuje się jej wartość +1, natomiast komórce wykrytej po stronie niskiego stężenia przypisuje się wartość -1. Wartości te są sumowane i dzielone przez całkowitą liczbę komórek w celu wyznaczenia CPC. Znak CPC (dodatni lub ujemny) wskazuje kierunek migracji (w stronę sygnału lub od niego). Chociaż CPC wska...