Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego określania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Summary

Ten protokół opisuje rozwój urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Abstract

Chemotaksja pozwala bakteriom zbliżyć się do źródeł substancji chemicznych wabiących lub uniknąć źródeł odstraszających substancji chemicznych. Bakterie na bieżąco monitorują stężenie określonych chemoefektorów, porównując aktualne stężenie ze stężeniem wykrytym kilka sekund wcześniej. To porównanie określa kierunek ruchu netto. Chociaż wiele konkurujących ze sobą gradientów często współistnieje w przyrodzie, konwencjonalne podejścia do badania chemotaksji bakteryjnej są nieoptymalne do ilościowego określania migracji w odpowiedzi na gradienty stężeń atraktantów i repelentów. W tym miejscu opisujemy rozwój modelu chemotaksji mikroprzepływowej do przedstawiania precyzyjnych i stabilnych gradientów stężeń chemoefektorów bakteriom oraz ilościowego badania ich reakcji na zastosowany gradient. Urządzenie jest wszechstronne pod tym względem, że gradienty stężeń o dowolnym pożądanym stężeniu bezwzględnym i sile gradientu mogą być łatwo generowane przez mieszanie dyfuzyjne. Urządzenie demonstruje się przy użyciu odpowiedzi Escherichia coli RP437 na gradienty aminokwasów i jonów niklu.

Protocol

1. Wytwarzanie wzorców krzemowych przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8¹ (nie pokazane w tym filmie).

1. Użyj standardowych metod fotolitografii SU-8, aby stworzyć "mistrza" SU-8 (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) do wytwarzania formy PDMS, która zawiera sieć mikroprzepływową i komorę chemotaksji. Takie formy wzorcowe można wytwarzać w dowolnym zakładzie mikrofabrykacji (np. Stanford Microfluidics Foundry; http://thebigone.stanford.edu/foundry/).
2. Przed replikacją PDMS należy wystawić master SU-8 na działanie oparów fluorozylanu w eksykatorze podłączonym do źródła podciśnienia, aby ułatwić uwolnienie PDMS z mastera. Dodaj kroplę fluorozylanu do ręcznika papierowego i stosuj próżnię przez jedną minutę. Usunąć próżnię i odczekać 30 minut na osadzenie fluorozylanu. Przechowuj master SU-8 w zamkniętym pojemniku do wykorzystania w przyszłości.

2. Formowanie repliki PDMS z mastera SU-8: Warstwa fluidyczna i warstwa kontrolna są tworzone przez formowanie repliki PDMS z mastera SU-8.

1. Wymieszać prepolimer PDMS i środek sieciujący w stosunku wag. 10:1 i odgazować w eksykatorze przez 1 godzinę (lub do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS).
2. Umieść wzorzec SU-8 na szalce Petriego i ostrożnie wylej mieszaninę PDMS na wierzch wzorca SU-8 do żądanej grubości.
3. Podgrzej szalkę Petriego zawierającą PDMS i główną formę SU-8 w temperaturze 80°C przez dwie godziny, aby utwardzić PDMS.
4. Wyjmij utwardzony master SU-8 pokryty PDMS z płyty grzejnej i oderwij formę PDMS od mastera SU-8. Pożądana struktura zostanie osadzona w formie PDMS.
5. Przebij otwory w formie PDMS na rurki do generatora gradientu i wlotu ogniwa za pomocą igły o końcu o rozmiarze 20.

3. Łączenie urządzeń PDMS:

1. Wyczyść szklane szkiełko mikroskopowe izopropanolem i osusz azotem lub strumieniem powietrza.
2. Wystaw PDMS i szkiełko na działanie plazmy tlenowej w asherze plazmowym.
3. Doprowadzić formę PDMS do kontaktu ze szklanym szkiełkiem. Podgrzej styk szkiełka i formę PDMS do 65°C przez 15 minut.

4. Montaż urządzenia PDMS

1. Za pomocą żyletki przytnij rurkę pod kątem 45° do odpowiedniej długości wymaganej dla urządzenia.
2. Włóż jeden koniec rurki do otworów wybitych w urządzeniu (np. wylot) za pomocą kleszczy.
3. Za pomocą kleszczy włóż igłę o rozmiarze 30 do drugiego końca rurki.
4. Powtórz krok 4.2 dla wszystkich pozostałych otworów.
5. Zebrać 1 ml buforu chemotaksji (CB) do strzykawki o pojemności 3 ml, uważając, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.
6. Przymocuj piastę igły do jednego końca rurki wylotowej.
7. Dodaj CB do piasty igły i postukaj w piastę igły, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
8. Wypchnąć trochę CB z końcówki strzykawki i podłączyć strzykawkę o pojemności 3 ml do piasty igły bez zatrzymywania powietrza.
9. Przepchnij CB przez urządzenie, aż wszystkie pozostałe piasty igieł zostaną wypełnione CB. Powinno to usunąć większość pęcherzyków powietrza.
10. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 500 μl CB zawierającym odpowiednie stężenia badanego chemoefektora. Wyeliminować tworzenie się pęcherzyków powietrza, wypychając niewielką kroplę zawartości strzykawki i dotykając kropli płynem w piaście igły i mocując.
11. W podobny sposób podłączyć strzykawkę zawierającą CB do wlotu bakterii. Zostanie to usunięte, gdy bakterie zostaną wprowadzone do urządzenia.

5. Wzrost wysoce ruchliwych bakterii E. coli

1. Hodować nocne kultury E. coli RP437 z plazmidem ekspresyjnym GFP w 20 ml bulionu tryptonowego (TB) w temperaturze 32°C z wytrząsaniem. Dodaj odpowiednie stężenia antybiotyku, aby utrzymać plazmid. W naszym protokole używamy plazmidu o niskiej kopii pCM182 do wykrywania bakterii na podstawie fluorescencji w urządzeniu. W przypadku E. coli zaleca się uprawę kultur w temperaturze 32°C w celu uzyskania wysokiej ruchliwości, ponieważ ruchliwość jest niższa w wyższych temperaturach.
2. Użyj hodowli przez noc, aby zaszczepić 20 ml kultury gruźlicy w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml do gęstości optycznej przy 600 nm ~ 0,05. Uprawiaj kulturę, wstrząsając w temperaturze 32°C.
3. Zebrać komórki przy średnicy zewnętrznej₆₀₀ ~0,35 0,45 przez wirowanie na niskiej prędkości przy 400 x g przez 5 minut.
4. Ponownie zawiesić komórki do OD₆₀₀ ~ 0,35 w CB zawierającym chemoefektor w stężeniu oczekiwanym w środku kanału.
5. Dodaj martwe komórki oznaczone znakiem RFP o średnicy zewnętrznej₆₀₀ ~ 0,35 do żywych komórek wykazujących ekspresję GFP. Martwe (czerwone) komórki są wykorzystywane jako kontrola wewnętrzna, aby upewnić się, że jakakolwiek migracja nie jest spowodowana efektami przepływu.

6. Monitorowanie chemotaksji

1. Usunąć część CB z piasty igły wlotu komórki. Uzupełnić zawiesiną komórek.
2. Delikatnie napełnij strzykawkę o pojemności 50 μl ponownie zawieszonymi komórkami. Ten krok należy wykonać powoli, ponieważ wici mogą zostać ścięte i zmniejszą ruchliwość.
3. Podłącz strzykawkę o pojemności 50 μl do piasty igły wlotowej zgodnie z opisem w kroku 4.10.
4. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w szybką kamerę do akwizycji obrazu. Umieścić strzykawki wlotowe (zarówno strzykawki gradientowe 500 μl, jak i strzykawkę o pojemności 50 μl) w pompie strzykawkowej i zainicjować przepływ w taki sposób, aby powstał gradient i komórki przepływały przez rurkę.
5. Gdy komórki wejdą do komory chemotaksji, odczekaj ~ 20 minut, aż system się ustabilizuje przed obrazowaniem.
6. Zbierz zielone (na żywo) i czerwone (martwe) obrazy fluorescencji w różnych miejscach na całej długości komory (odpowiadających różnym czasom naświetlania). Zazwyczaj zbieramy 100 obrazów w każdej lokalizacji w odstępach 3-sekundowych.

7. Analiza danych: Poniższe kroki można wykonać za pomocą dowolnego dostępnego na rynku programu do analizy obrazów (np. ImageJ, Metamorph) lub za pomocą prostych kodów napisanych w Matlabie.

1. Usuń piksele tła z obrazu (tj. ustaw próg intensywności pikseli i usuń wszystkie piksele, które mają intensywność mniejszą niż próg). Minimalizuje to szum w analizie.
2. Użyj pozycji martwych komórek (czerwona fluorescencja), aby określić środek obrazu. Ponieważ martwe komórki nie wykazują chemotaksji, jest to pozycja, w której komórki weszły do komory chemotaksji i zostałyby wykryte przy braku jakiejkolwiek migracji.
3. Zlokalizuj żywe komórki (zielona fluorescencja) na obrazie.
4. Podziel obraz na kanały i określ liczbę aktywnych komórek w każdym kanale. W naszej poprzedniej pracy³ komora chemotaksji o szerokości 1050 μm została podzielona na 64 kanały, z których każdy ma szerokość ~ 16 μm.
5. Powtórz kroki 7.1 i 7.3 dla wszystkich obrazów i zsumuj łączną liczbę komórek dla każdego kanału na wszystkich obrazach. Daje to całkowitą liczbę komórek wykrytych na każdym kanale w czasie trwania eksperymentu.
6. Oblicz współczynnik podziału chemotaksji (CPC), który reprezentuje kierunek migracji, w następujący sposób: Każda komórka znajdująca się po stronie o wysokim stężeniu (po prawej) i po lewej stronie martwych komórek ma przypisany mnożnik odpowiednio +1 i -1. Oznacza to, że komórka, która migruje w górę gradientu, jest mnożona przez +1, podczas gdy komórki poruszające się w dół gradientu są mnożone przez -1. Wszystkie pomnożone wartości są sumowane i normalizowane do całkowitej liczby wykrytych komórek. Na przykład wartość CPC wynosząca 0,40 wskazuje, że o 40% więcej wszystkich bakterii przemieściło się na stronę o wysokim stężeniu niż po stronie niskiego stężenia (tj. chemoefektor jest atraktantem, ponieważ wykryto więcej bakterii poruszających się w górę gradientu).
7. Oblicz współczynnik migracji chemotaksji (CMC), który waży migrację komórek przez przebytą odległość, w następujący sposób: Zważ liczbę komórek w każdym kanale za pomocą współczynnika proporcjonalnego do odległości, na jaką migrują komórki. Komórka, która przesuwa się do najdalszej pozycji o wysokim stężeniu (kanał 64), otrzymuje współczynnik wagowy +1, podczas gdy komórka, która przesuwa się w połowie drogi do strony o wyższym stężeniu, otrzymuje współczynnik wagowy +0,5, a komórka poruszająca się do najdalszej pozycji o niskim stężeniu jest ważona przez -1. Zsumuj wszystkie ważone liczby komórek i znormalizuj do liczby komórek, aby wygenerować CMC.

Reprezentatywne wyniki^3,4:

Użyliśmy opisanego tutaj urządzenia mikroprzepływowego (Rysunek 1A) do zbadania chemotaksji E. coli w gradientach atraktantów (kwas asparaginowy, autoinduktor-2) i repelentów (NiSO₄, indol)^3,4. Zastosowano prototypowy szczep chemotaksji⁵ E. coli RP437 wykazujący ekspresję GFP, wraz z komórkami TG1 E. coli zabitymi kanamycyną eksprymującymi białko czerwonej fluorescencji w celu monitorowania efektów przepływu. Gradient stężeń powstający w urządzeniu μFlow pokazano na rysunku 1B. Wlot komórki został zaślepiony w taki sposób, aby nie było przez niego przepływu, a w urządzeniu ustalono stabilny gradient 0 100 ng/ml fluoresceiny. Intensywność pikseli w całym urządzeniu została wykorzystana do określenia profilu stężenia fluoresceiny. Dane pokazują, że bakterie napotykają gradient liniowy, gdy wchodzą do komory chemotaksji. Ryciny 2A i B pokazują obrazy fluorescencyjne E. coli RP437 migrujących w odpowiedzi na gradienty kwasu asparaginowego (0 100 μM) i NiSO₄ (0 225 μM). Obserwowane reakcje na te kanoniczne atraktanty i repelenty są zgodne z przewidywaniami. Rysunek 3A przedstawia ilościowy rozkład E. coli RP437 przy braku gradientu stężenia (tj. gradientu zerowego kwasu asparaginowego), podczas gdy rysunki 3B i C pokazują rozkład gradientów kwasu asparaginowego i NiSO₄. Specyficzność tych odpowiedzi (tj. odchylenie w migracji) jest oczywista, ponieważ szczepsmoły E. coli RP437 Δ (tj. szczep pozbawiony chemoreceptora Tar, który jest używany w E. coli do wykrywania kwasu asparaginowego i niklu) nie wykazuje odchylenia w migracji w obecności gradientu stężeń kwasu asparaginowego lub NiSO₄. Tendencje widoczne w profilach rozkładu przestrzennego są również spójne z obliczonymi wartościami CPC i CMC. Wartości CPC dla migracji E. coli RP437 w gradientach kwasu asparaginowego lub NiSO₄ wynoszą odpowiednio +0,33 i -0,33. Odpowiednie wartości CMC wynoszą odpowiednio +0,13 i -0,14. Natomiast wartości CPC i CMC ze szczepemsmoły E. coli RP437 Δ w gradientach kwasu asparaginowego lub NiSO₄ są znikome. Ponadto CPC i CMC w gradiencie zerowym kwasu asparaginowego wynoszą odpowiednio +0,03 i +0,02 i wskazują na brak odchylenia w migracji przy braku gradientu.

Rysunek 1. Schemat urządzenia i gradient stężenia.
(A) Schematyczne przedstawienie urządzenia do chemotaksji mikroprzepływowej. Urządzenie składa się z modułu mieszania gradientów (20 x 100 x 18750 μm) oraz modułu obserwacyjnego chemotaksji (20 x 1050 x 11500 μm). Szerokość dwóch kanałów gradientowych wchodzących do urządzenia wynosi 500 μm, a szerokość wlotu bakterii wynosi 50 μm. Wstawka przedstawia gradient cząsteczki sygnałowej (szarej) i bakterii migrujących w odpowiedzi na nią. Żywe bakterie są przedstawiane jako stałe owale, podczas gdy martwe bakterie są przedstawiane jako otwarte owale. (B) W urządzeniu wygenerowano gradient stężenia między 0 a 100 ng/ml fluoresceiny i zobrazowano go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy fluorescencyjne uzyskano po 30 minutach i określono ilościowo za pomocą analizy obrazu.

Rysunek 2. Chemotaksja E. coli RP437 w urządzeniu mikroprzepływowym.
Bakteria E. coli RP437 wystawiono na działanie gradientu (A) 0-100 μM L-asparaginianu lub (B) 0-225 μM_NiSO4 w urządzeniu, a migrację żywych bakterii (zielony) w kierunku L-asparaginianu lub z dala od niklu obrazowano co 2,5 sekundy przez 30 minut. Martwe bakterie (kolor czerwony) służyły jako kontrola efektów przepływu w urządzeniu. Obrazy zostały określone ilościowo za pomocą opracowanego przez nas programu analitycznego3. Pokazane dane są reprezentatywnymi pseudokolorowymi obrazami z trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 3: Kwantyfikacja profili migracji do kanonicznego atraktantu i repelentu.
Rozkład przestrzenny RP437 w urządzeniu mikroprzepływowym w odpowiedzi na (A) jednorodny 100 μM L-asparaginian (tj. Brak gradientu), (B) gradient asparaginianu 0 100 μM i (C) gradient 0 225 μM NiSO₄. Rozkład martwych komórek jest pokazany jako linia ciągła, rozkład komórek RP437 jest pokazany jako linia przerywana, a rozkład komóreksmoły RP437 eda⁺ Δ jest pokazany jako linia przerywana. Przedstawione dane są uśredniane dla trzech niezależnych eksperymentów.

Discussion

Współczynnik podziału chemotaksji (CPC) i współczynnik migracji chemotaksji (CMC) można obliczyć w sposób opisany w Mao i wsp. ⁵. Jeśli komórka zostanie wykryta po stronie wysokiego stężenia, otrzymuje wartość +1, podczas gdy komórka wykryta po stronie niskiego stężenia otrzymuje wartość -1. Wartości są sumowane i dzielone przez łączną liczbę komórek w celu wygenerowania CPC. Znak CPC (dodatni lub ujemny) określa kierunek migracji (w kierunku lub od sygnału). Chociaż CPC wskazuje, czy komórki reagują ...