Protokoły eksperymentalne
W celu ustalenia wykonalności pomiarów służących do nieinwazyjnego badania niedokrwienia i reperfuzji (IR) serca mysiego zastosowano następujące protokoły. Po wykonaniu baseline’owego obrazowania echokardiograficznego przeprowadzono chirurgiczną indukcję niedokrwienia i reperfuzji (IR, protokół 1), po której następowało badanie echokardiograficzne w wielu punktach czasowych podczas rekonwalescencji po IR.
Protokół 1. Niedokrwienie i reperfuzja (IR) lewej tętnicy wieńcowej opadającej przedniej (LAD): procedura chirurgiczna
Dorosłe samce myszy C57BL/6 (w wieku 8 tygodni; 24,5±1,5g, średnia±SD; Harlan Technologies, IN) utrzymywano w standardowych warunkach laboratoryjnych z dostępem do paszy i wody pitnej ad libitum. Myszy znieczulono poprzez dostrychalne wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (10 mg/kg) i ksylazyny (10mg/kg), ułożono na ciepłym stole operacyjnym i poddano intubacji endotrachealnej. Odpowiednią głębokość znieczulenia u gryzoni stwierdzano na podstawie zaniku odruchu cofania łapy po uszczypnięciu oraz spowolnienia oddechu. Instrumenty sterylizowano poprzez przemywanie 70% etanolem i autoklawowanie. Wszelkie instrumenty, które opuściły pole sterylne, umieszczano w sterylizatorze koralikowym na 1 minutę przed dalszym użyciem. Myszy wentylowano (Harvard Apparatus, Boston, MA) mieszaniną powietrza i izofluranu z zastosowaniem odpowiedniej częstotliwości i objętości oddechowej. Elektrofizjologię serca monitorowano przez cały czas trwania operacji za pomocą trójodprowadzeniowego układu EKG, a zmiany rejestrowano przy użyciu oprogramowania PC Powerlab (AD Instruments).
Dostęp do serca uzyskano poprzez lewostronną torakotomię. Lewą płucną odsunęto, aby uzyskać dostęp do osierdzia. Uniesiono lewy przedsionek, aby odsłonić tętnicę wieńcową LAD, którą wyizolowano za pomocą nici Prolene 7-0 zamocowanej na igle stożkowej. Nić zaciśnięto na odcinku rurki PE-10, aby wywołać odwracalny niedokrwienie. Tętnica LAD była zamknięta przez 60 minut. Po 60 min poluzowano nić, aby umożliwić reperfuzję uszkodzonego mięśnia sercowego. Po pomyślnej reperfuzji zamknięto klatkę piersiową za pomocą przerywanych szwów Prolene 7-0, a następnie zamknięto nacięcie skóry szwami Prolene 5-0.
W trakcie operacji temperaturę ciała utrzymywano na poziomie 36,7 ± 0,5°C przy użyciu podgrzewanego stołu operacyjnego i monitorowano za pomocą rektalnej sondy termicznej. Epizod niedokrwienny powoduje bladość mięśnia sercowego LV, co można zaobserwować wizualnie. Klatkę piersiową zamknięto i zaszyto, a rurkę intubacyjną odłączono, aby mysz mogła oddychać samodzielnie. Następnie zwierzę przeniesiono do klatki i umieszczono na bloku grzewczym ustawionym na 37°C. Po całkowitym wybudzeniu zwierzę zwrócono do aneksowania gryzoni przed wykonaniem obrazowania echokardiograficznego. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Laboratoryjnych (ILACUC) Uniwersytetu stanowego Ohio.
Protokół 2. Protokół obrazowania w trybie M w celu oceny funkcji serca i wykrycia zaburzeń kurczliwości ścian
W celu oceny zmian radialnych i podłużnych w funkcji serca oraz nieprawidłowości w kurczliwości ścian, wykonaliśmy obrazowanie przed-IR z wykorzystaniem wysokoczęstotliwościowego skanera ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości (Visual Sonics Inc., Toronto, Canada). Standardowe parametry echokardiografii w trybie M, takie jak wymiary ścian, objętości w skurczu i rozkurczu oraz objętość wyrzutowa, frakcje wyrzutowe (EF), frakcyjne skrócenie (FS), rzut serca (CO) oraz średnice wewnętrzne w skurczu i rozkurczu, oceniano za pomocą wbudowanego protokołu trybu M w każdym punkcie czasowym (przed-IR, dzień 3 i dzień 7).
Protokół 3. Protokół algorytmu śledzenia plamek VevoStrain
Nagrania w trybie B zostały zarejestrowane i poddane przetwarzaniu przy użyciu wbudowanego algorytmu VevoStrain w celu przeprowadzenia analiz odkształcenia. Pozwala to na ocenę prędkości, przemieszczenia, odkształcenia oraz szybkości odkształcenia za pomocą oddzielnych przycisków radiowych dostępnych w interfejsie, które po kliknięciu odpowiednich ikon w panelu sterowania generują interaktywne wykresy i obrazy w trybie M wraz z wartościami danych.
Ocena odkształceń metodą śledzenia plamek
Dwuwymiarowe pętle cine w skali szarości pozyskano w widoku krótkiej osi LV przy częstotliwości klatek >275 frames/s. Dla każdego eksperymentu zarejestrowano co najmniej trzy kolejne cykle pracy serca, które zapisano cyfrowo na dysku twardym w celu późniejszej analizy w stacji roboczej. Wykorzystano algorytm śledzenia plamek (speckle-tracking) wbudowany w system Vevo210. Analizę odkształcenia (strain) przeprowadził ten sam przeszkolony obserwator. Obszar zainteresowania (ROI) nałożono na przekrój poprzeczny komory na obrazie odpowiadającym minimalnemu obszarowi endokardium. Następnie algorytm oprogramowania automatycznie podzielił widok krótkiej osi LV na sześć segmentów w celu śledzenia plamek w całym cyklu pracy serca. Następnie wizualnie oceniono jakość śledzenia i, jeśli była ona zadowalająca dla co najmniej pięciu segmentów, obrys uznano za prawidłowy.
Protokół 4. Protokół pomiaru przepływu Dopplera
W celu zbadania niedomykalności zastawki mitralnej oraz obliczenia szybkości zmiany skurczowego ciśnienia krwi w LV (dP/dt) zastosowano protokół detekcji przepływu metodą Dopplera. W tym celu zarejestrowano profile prędkości przepływu krwi za pomocą kolorowego Dopplera energetycznego (power Doppler), umieszczając głowicę w strumieniu cofającym zastawki mitralnej oraz w strumieniu aortycznym. Obrazowaniu prędkości przepływu krwi towarzyszyły pomiary służące do uzyskania wartości parametrów takich jak prędkość szczytowa i średnia, gradienty ciśnień szczytowe i średnie, całka prędkości z czasu (VTI) oraz czas. Do obliczenia dP/dt wykorzystano profil prędkości cofania w zastawce mitralnej, aby zmierzyć prędkość we wczesnej fazie skurczu (najbardziej strome nachylenie profilu prędkości w celu zminimalizowania zależności od obciążenia) oraz odpowiadający temu czas nachylenia. Ostatecznie, do przeliczenia prędkości na ciśnienie w celu określenia szybkości wzrostu ciśnienia skurczowego zastosowano równanie Bernoulliego.
Pozyskiwanie danych echokardiograficznych
Myszy obrazowano w stanie świadomości w temperaturze pokojowej 37°C przy zmniejszonym oświetleniu otoczenia, podczas gdy doświadczony opiekun trzymał je w pozycji brzusznej bocznej lewej. Serce obrazowano w trybie 2-D w widokach długiej i krótkiej osi przyściannej, przy ustawieniu głębokości 1,0 cm i częstotliwości odświeżania ≥ 270 frames/s. Obraz w trybie M uzyskano przy prędkości przesiewu 20 mm/s. Wszystkie pomiary wykonano zgodnie z wytycznymi American Society of Echocardiography.
Obrazowanie przeprowadzono u przytomnych myszy wraz z jednoczesnym zapisem elektrokardiogramu. Koniec skurczu zdefiniowano jako minimalną powierzchnię LV. Następnie sporządzono segmentowe krzywe Scirc i Srad poprzez całkowanie odpowiednich sygnałów, zaczynając od punktów końcowo-rozkurczowych, a następnie wyliczono z nich średnie krzywe odkształcenia segmentowego. Odkształcenia końcowoskurczowe uzyskano z przeciętnej krzywej odkształcenia.
Reprezentatywne wyniki
Do oszacowania wysokiej jakości odkształcenia mięśnia sercowego wykorzystano dwuwymiarowe filmy zarejestrowane z wysoką częstliwością klatek (8 kHz). Dwuwymiarowe elastogramy (obrazy odkształcenia), a także profile odkształcenia w funkcji czasu, pomogły ocenić funkcjonalne skutki niedokrwienia i reperfuzji (IR). Wspomniane podejście pozwoliło na wiarygodne wykrycie następujących parametrów:
Standardowe wyniki IR (częściej raportowane w literaturze)
- skurcz lewej komory (LV)
- uraz upośledza skurcz i rozkurcz serca, co prowadzi do utraty funkcjonalnej
- zmiany w powierzchni i masie komory LV (przerost)
- rozkurcz LV w fazach izowolumetrycznych zarówno przed-IR, jak i po-IR w bijących sercach
- upośledzony ruch ścian w poszczególnych sektorach
- turbulencje w schemacie przepływu krwi wykazane przez kolorowy Doppler i profile prędkości
- zmiany kształtu LV w kierunku sferyczności
- upośledzona frakcja wyrzutowa
- osłabione skrócenie frakcyjne
Unikalne wyniki po naświetlaniu (post-IR)
(nigdy wcześniej nie raportowane w mysim modelu IR, ale znane z istotności klinicznej u ludzi)
- efektywny otwór niedomykalności (ERO)
- podstawowa miara niewydolności zastawki
- zmniejszone odkształcenia mięśnia sercowego (obwodowe oraz promieniowe)
- podstawowa miara kurczliwości mięśnia sercowego i deformacji anatomicznej
- asynchronia w sektorach LV
- podstawowa miara wrodzonych okresowych charakterystyk pompowania serca
- ruch i symetria ścian
- zmiany w wielkości i kierunku wektorów wykazujące amplitudę, kierunek i symetrię w obszarze objętym procesem chorobowym
- wymiary zastawki mitralnej i aorty
- zmiany średnic wewnętrznych otworu zastawki mitralnej i aorty
- niedomykalność zastawki mitralnej
- cofanie się krwi z LV do lewego przedsionka z powodu niepełnego domykania się płatków zastawki mitralnej
- zmiany wartości odkształcenia promieniowego (Srad) i obwodowego (Scir) w poszczególnych sektorach
- zmiany szybkości odkształcania wraz z wyraźną zmiennością wzorców ich zmian w stosunku do danych sprzed IR
- synchroniczność sektorów LV podzielonych zgodnie z wytycznymi American Society of Echocardiography
- związek mechanicznej synchroniczności komory z sztywnością mięśnia sercowego i zmniejszoną wytrzymałością mięśnia sercowego ocenianą za pomocą Dopplera tkankowego i obrazowania odkształceń (strain imaging)
- zmiany wartości i kierunku wektorów pokazanych na filmach przedstawiających upośledzony ruch (powolny i asymetryczny) w obszarze objętym IR
- średnice wewnętrzne otworu zastawki mitralnej i aorty

Ryc. 1i. pomiar odkształcenia mięśnia sercowego: pełny rozkurcz w końcowej rozkurczu wykazany przez najkrótsze wektory (M1)

Ryc. 1ii. pomiar odkształcenia mięśnia sercowego: LV kurczy się, co obrazują długość i kierunek wektorów; miejsce uszkodzenia (zielony punkt) wykazuje ograniczoną kurczliwość (M2)

Ryc. 1iii. pomiar odkształcenia mięśnia sercowego: koniec skurczu, pełny skurcz wykazany przez najkrótsze wektory (M3)

Ryc. 1iv. pomiar odkształcenia mięśnia sercowego: oś podłużna w rozkurczu (M4)

Ryc. 1v. radialny odkształcenie mięśnia sercowego (Spromieniowaniepomiar: krzywe oznaczone kolorami reprezentują odkształcenie w odpowiadających im kolorystycznie punktach na obrazach przedstawionych na Rys. 1.i-iv (M5)

Ryc. 1vi. obwodowy odkształcenie mięśnia sercowego (Scirpomiar: krzywe oznaczone kolorami reprezentują odkształcenie w odpowiednich kolorowych punktach na obrazach z Rys. 1.i-iv (M6)
Rysunek 1. Filmy w trybie B obrazujące koniec rozkurczu (ED) oraz koniec skurczu (ES) i zmiany wielkości komory LV po IR.
Obrazy w trybie B służące do wyznaczenia odkształcenia obwodowego (Scirc) oraz odkształcenia promieniowego (Srad) lewej komory (LV) za pomocą dwuwymiarowej echokardiografii z tropieniem plamek (speckle tracking).
Algorytm śledzenia plamek VevoStrain służący do obserwacji wektorów przedstawiających wielkość i kierunek ruchu mięśnia sercowego; widoki osiowe i przymięśniowe w osi długiej obrazujące wektory w miejscu uszkodzenia upośledzonego mięśnia sercowego.
Odkształcenia promieniowe i podłużne u myszy w grupie kontrolnej oraz u myszy w 7. dniu po IR. Profile odkształceń z kodowaniem kolorystycznym przedstawiają punkty w różnych kolorach w miejscach na mięśniu sercowym w sercach kontrolnych (przed IR) i traktowanych (po IR, dzień 7). LV – lewa komora, RV – prawa komora, Srad – odkształcenie promieniowe, Scir – odkształcenie obwodowe.

Rysunek 2. Synchroniczność sektorowa mięśnia sercowego.
Analizy oparte na danych o odkształceniu (strain) przed i po IR. LV podzielono na sześć sektorów (1 = tylny podstawowy, 4 = przedni podstawowy, 2 = tylny środkowy, 5 = przedni środkowy, 3 = tylny wierzchołkowy, 6 = przedni wierzchołkowy) zgodnie z wytycznymi American Society of Echocardiography. Walidacja synchronii mechanicznej komory w celu oceny jej związku ze sztywnością mięśnia sercowego ocenianą za pomocą dopplerowskiego obrazowania tkanek oraz obrazowania odkształcenia.
Panel obrazów z kodowaniem kolorystycznym przedstawiający sektory od 1 do 6 wraz z wartościami czasu do osiągnięcia szczytu dla odpowiadających im sektorów w milisekundach. Synchronizacje radialne i podłużne dla okresu przed-IR i po-IR przedstawione w formie wykresów. Kolory na wykresach odpowiadają kolorom odpowiadających im sektorów.

Ryc. 3i. pomiary anatomiczne: średnica otworu niedomykalności zastawki mitralnej w sercu myszy (niebieskie linie z powtórzonymi pomiarami), objętość próbki w aorcie (żółte linie) (M8)

Ryc. 3ii. profile przepływu cofającego w sercu myszy, górny przepływ do przodu i dolny przepływ wsteczny w zastawce mitralnej (M9)

Ryc. 3iii. profile prędkości wypływu z aorty w sercu myszy (M10)

Ryc. 3iv. otwór cofający w zastawce mitralnej, Ao = aorta, LA = lewy przedsionek, LV = lewa komora, r = promień (M1)
Rysunek 3. Ułamk regulacji (RF) zastawki mitralnej V.
Panel obrazów echokardiograficznych do pomiaru ułamka regulacji (RF). Pomiar średnicy aorty (AoD) oraz średnicy otworu zastawki mitralnej (MVD) pokazujący rozmieszczenie objętości próbkowania w strumieniu regulacyjnym i aorcie. Pomiary te dostarczają profili prędkości regulacji i przepływu w aorcie wstępującej, w których profile prędkości powyżej i poniżej linii bazowej wskazują przepływ krwi w przód do LV i z powrotem do lewego przedsionka. Obliczanie RF (w %) według wzoru: RF = (MV CSA*VTI strumienia MV w rozkurczu - Ao CSA*VTI strumienia Ao w skurczu)*10 / MV CSA*VTI MV.
Ilościowe oznaczenie frakcji cofania, wskazujące na frakcję cofania u myszy po IR jako wskaźnik nieszczelności zastawki mitralnej. Zmiany efektywnego otworu cofania (ERO) zastawki mitralnej po IR wynikające z sferyczności LV. Reprezentatywne obrazy kolorowego Dopplera przedstawiające przepływ krwi z lewego przedsionka do LV. Powiększony otwór przepływu krwi wskazuje na przepływ turbulentny i zwiększoną abnormalną prędkość przepływu. ERO wskazujące na niewydolność zastawkową. Prędkość przepływu z aliasingiem. Fala impulsowa jest wykorzystywana w celu usprawnienia określania przejść z przepływu laminarnego na turbulentny. ERO obliczone według wzoru ERO = Flow/Vmax = 2 π r2 Va /Vmax, gdzie Va = prędkość aliasingu, r = promień otworu, Vmax = prędkość maksymalna.

Rys. 4i. pomiar parametrów czynnościowych u myszy przed IR. Oprogramowanie oblicza parametry poprzez śledzenie przebiegu; czerwona linia pionowa = rozkurcz, zielona linia pionowa = skurcz (M12)

Rys. 4ii. pomiar parametrów funkcjonalnych u myszy po IR. Oprogramowanie oblicza parametry poprzez obrysowywanie; czerwona linia pionowa = rozkurcz, zielona linia pionowa = skurcz (M13)
Rysunek 4. Szybkość zmiany ciśnienia skurczowego w komorze (dP/dt): przed i po niedokrwieniu i reperfusji (IR).
Korelacja frakcji wyrzutowej (EF) z dP/dt. Panel obrazu przedstawiający tryb M, z którego pobrano podstawowe pomiary funkcjonalne.
Odróżnienie kurczliwości serca w czasie; wykresy słupkowe przedstawiające dP/dt po niedokrwieniu i reperfuzji (IR). Wskazuje to, że pomiar jednego parametru dostarcza informacji klinicznych na temat drugiego.

Rysunek 5. Film w osi krótkiej obrazujący pomiar odkształcenia przed IR.
Nagranie echokardiograficzne uzyskane w widoku przymostkowym serca w celu wizualizacji morfologii serca myszy przed IR.

Rysunek 6. Film w osi krótkiej przedstawiający pomiar odkształcenia LV po IR
Reprezentatywny film w przekroju osiowym lewej komory (LV) myszy, z obrysem wsierdzia, obrazujący wektory odkształcenia tkanki z uwzględnieniem pięciu konkretnych punktów pomiarowych.

Rysunek 7. Film z badania kolorowego Dopplera w osi długiej przymostkowej
Nagranie w trybie kolorowego Dopplera obrazujące przepływ krwi z lewego przedsionka przez zastawkę mitralną do lewej komory podczas rozkurczu oraz wypływ krwi przez aortę podczas fazy skurczu serca, gdzie kierunek przepływu jest zaznaczony kolorem niebieskim (od przodu) i czerwonym (w stronę) głowicy ultradźwiękowej (BART).