Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Podsumowanie

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Streszczenie

Rejestracja z kluczowych nerwów i mięśniAplysiapodczas zachowań żerowania pozwala nam badać wzorce kontroli neuronalnej u nienaruszonego zwierzęcia. Jednoczesne rejestrowanie sygnałów z wielu nerwów i mięśni dostarcza nam precyzyjnych informacji o czasie trwania aktywności neuronalnej. Poprzednie metody rejestracji sprawdzały się w przypadku dwóch elektrod, jednak badanie dodatkowych nerwów lub mięśni wymagało łączenia i uśredniania zapisów z wielu zwierząt, co utrudniało określenie szczegółów dotyczących czasu i fazowania ze względu na zmienność między poszczególnymi odpowiedziami oraz osobnikami. Implantacja czterech oddzielnych elektrod charakteryzuje się bardzo niskim wskaźnikiem sukcesu z powodu tworzenia się zrostów, które uniemożliwiają zwierzętom wykonywanie normalnych ruchów żerowania. Opracowaliśmy nową metodę wytwarzania elektrod, która zmniejsza ich objętość wewnątrz organizmu zwierzęcia, umożliwiając naturalne ruchy podczas żerowania. Zastosowanie kombinacji klejów do mocowania elektrod skutkuje bardziej niezawodną izolacją elektrody, która utrzymuje się dłużej, co pozwala na rejestrację przez okresy do jednego tygodnia. Opisana przez nas technika wytwarzania mogłaby zostać rozszerzona o kilka dodatkowych elektrod i byłaby możliwa do zastosowania u zwierząt kręgowców.

Protokół

1. Wykonanie elektrody

1. Aby przygotować elektrodę, należy za pomocą nożyczek odciąć fragment drutu ze stali nierdzewnej w izolacji emaliowanej o średnicy 0,01 cala i długości około 2 stóp. Do każdego końca drutu należy przymocować małą kulkę masy plastycznej, złożyć drut na pół i skręcić końce, tworząc parę splotową, zwaną elektrodą różnicową.
2. Przyklej taśmą oba końce przewodu, aby zapobiec jego rozplątaniu. Wykonaj cztery elektrody różnicowe, używając dla każdej z nich taśmy w innym kolorze w celu ich identyfikacji (Rycina 1A).
3. Spleć ze sobą dwie elektrody różnicowe, pozostawiając dwa cale niesplecionych na jednym końcu i jeden cal na drugim końcu. Powtórz tę czynność z pozostałą parą elektrod różnicowych (Rysunek 1B).
4. Skręć ze sobą obie pary elektrod różnicowych, dbając o to, aby ich końce pozostały nieskręcone. Podnieś zestaw elektrod i nałóż domowy klej silikonowy w miejscu połączenia czterech elektrod różnicowych, pozostawiając końce wolne. Zawieś zestaw i pozostaw do wyschnięcia kleju na co najmniej 4 godziny (Rycina 1C).
5. Aby odizolować odnogi, położyć zespół elektrod na płaskiej, ruchomej powierzchni, na przykład na kawałku drewna. Rozłożyć końce w kształcie wachlarza i zabezpieczyć je taśmą. Użyć niewielkiego kawałka plastiku, aby unieść zespół elektrod tuż przed miejscem rozgałęzienia, a następnie zabezpieczyć go taśmą.
6. Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą pęsety, pokryć odnogi klejem silikonowym. Końce o długości 1 cala będą znajdować się wewnątrz organizmu, dlatego powinny zostać pokryte bardzo cienką warstwą kleju. Pozostawić klej do wyschnięcia przez co najmniej 3 godziny.
7. Skróć 1-calowy koniec jednej elektrody różnicowej do dwóch centymetrów. Z każdego przewodu usuń 1 cm silikonu i emalii. Zagnieć jeden odsłonięty przewód w kształt haczyka do rejestracji. Zegnij drugi przewód w górę, odsuwając go od haczyka; będzie on służył jako przewód uziemiający. Powtórz czynność dla pozostałych trzech elektrod.
8. Wybierz jedną z czterech elektrod znajdujących się na 2-calowym końcu. Za pomocą pęsety zeskrob silikon i emalię, odsłaniając 1 cm gołego drutu ze stali nierdzewnej na każdym z dwóch przewodów. Do każdego z dwóch przewodów przylutuj złącze złote. Użyj kawałka taśmy laboratoryjnej, aby zabezpieczyć koniec i zachować odstęp między pinem uziemiającym a rejestrującym. Powtórz czynność dla pozostałych trzech elektrod.
9. Przytwierdź do kabla kuleczkę kleju silikonowego o średnicy 1-2 cm, około 1,5 cala od końca z haczykiem, aby zakotwiczyć elektrody wewnątrz organizmu zwierzęcia. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę (Rysunek 1D).
   
   
   Rycina 1. Wytwarzanie zestawu elektrod. (A) Pojedyncza elektroda różnicowa składająca się zgiętego i skręconego drutu z końcami zabezpieczonymi taśmą. (B) Dwie elektrody różnicowe skręcone ze sobą, z pozostawieniem nieskręconych odcinków na końcach. Do zidentyfikowania końców należy użyć taśmy w innym kolorze lub innego oznaczenia. (C) Wszystkie cztery elektrody różnicowe połączone w jeden zestaw elektrod, tworzący pojedynczy kabel z oddzielnymi odnogami poszczególnych elektrod na każdym końcu, oznaczonymi taśmami w różnych kolorach. (D) Końcowa forma zestawu elektrod. Po lewej stronie znajdują się zwinięte haczyki dla przewodów rejestrujących oraz przewodów uziemiających dla każdej elektrody różnicowej. Po prawej stronie do przewodów przylutowano złote piny złącza w celu podłączenia do wzmacniacza. Po lewej stronie zestawu umieszczono również kotwiczącą kulkę kleju silikonowego.

2. Przygotowanie zwierzęcia do implantacji

1. Należy wybrać zdrowe zwierzę o masie około 350-450 g. W reakcji na małe kawałki wodorostów zwierzę powinno wykonywać ruchy chwytne (kęsy) w odstępach od 3 do 5 sekund. Cały zabieg chirurgiczny wraz z implantacją elektrody powinien potrwać około godziny.
2. Aby znieczulić zwierzę, należy wstrzyknąć mu 30% (w/v) izotoniczny roztwór MgCl2₂Aby zapobiec utracie hemolimfy i MgCl2₂miejsce wstrzyknięcia można pokryć superglue przed wyjęciem igły.
   
   Rysunek 2. Schemat przedstawiający sposób unieruchomienia zwierzęcia do implantacji elektrod oraz miejsce nacięcia (oznaczone paskiem).
   
   
3. Umieść znieczulone zwierzę w kuwecie sekcyjnej z stopą skierowaną w dół. Patrząc na zwierzę od strony głowy, przesuń obszar skrzeli w lewo w taki sposób, aby zwierzę znajdowało się częściowo na boku, odchylone w przeciwną stronę. Przypnij przednie czułki (Rysunek 2).
4. Umieść tackę na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Podstaw tackę tak, aby znajdowała się pod kątem około 20 stopni, co pozwoli unieść głowę i spowoduje spłynięcie hemolimfy do ogona, z dala od miejsca nacięcia.
5. Za pomocą nożyczek do sekcji wykonaj nacięcie nieco na prawo od plamki ocznej, prowadząc je w kierunku przednim na odległość od 1 do 1,5 cm. Użyj rozwieraczy przymocowanych do krawędzi tacki, aby utrzymać nacięcie otwarte (Rysunek 2; pasek w pobliżu plamki ocznej wskazuje miejsce nacięcia).
6. Aby odsłonić masę policzkową, należy użyć pęsety do uniesienia przezroczystej błony znajdującej się pod skórą, a następnie nożyczek, aby wyciąć otwór odpowiadający głównemu nacięciu. Brzegi błony należy odsunąć i zabezpieczyć za pomocą retraktorów.

3. Implantacja elektrod

1. Umieść zespół elektrod na mikromanipulatorze i przesuń go nad nacięcie w ciele zwierzęcia.
2. Nerw radularny (radular nerve) jest najtrudniejszy do uzyskania dostępu i do niego należy podejść w pierwszej kolejności. Istnieją dwie opcje dostępu do nerwu radularnego.
3. Pierwszą, preferowaną opcją jest zajrzenie pod zwoj buccalny pomiędzy BN1 a BN2. Jeśli widoczna jest gałąź nerwu radularnego, należy użyć cienkich pęsetek wygiętych w haczyk, aby wyciągnąć gałąź (Rysunek 3, pętla RN pod zwojem oznaczona cyfrą 1).
4. Jeśli gałąź nerwu radularnego nie jest dostępna nad mięśniem, drugą opcją jest uzyskanie do niej dostępu poprzez małe nacięcie w I2 obok tkanki łącznej u podstawy zwoju buccalnego (Rysunek 3, RN pod mięśniem oznaczone cyfrą 2). Nacięcie w I2 musi przejść przez dwie warstwy mięśnia I2. Przytrzymaj krawędź nacięcia mięśnia prostą pęsetą i użyj pęsety z haczykiem, aby wyciągnąć gałąź RN.
5. Trzymając nerw pęsetą z haczykiem, użyj drugiej pęsety, aby nasunąć haczyk elektrody na nerw.
6. Użyj mikromanipulatora, aby podnieść haczyk tak, aby nerw został uniesiony z dala od masy buccalnej i oddzielony od innych nerwów lub tkanek. Nie naciągaj nadmiernie nerwu.
7. Osusz elektrodę za pomocą chusteczki Kim-Wipe lub odessać nadmiar płynu strzykawką. Napięcie powierzchniowe wody może spowodować zapadnięcie się nerwu lub utworzenie się szczelnej warstwy wody pod nerwem. W obu przypadkach obszar ten należy całkowicie osuszyć przed nałożeniem kleju.
8. Nałóż małą ilość superglue w miejscu, gdzie podstawa haczyka styka się z dolną częścią nerwu. Nałóż kroplę soli fizjologicznej dla Aplysia lub hemolimfy, aby utwardzić superglue. Gdy klej jest mokry, nie wolno niczego przesuwać, ponieważ dostanie się kleju pomiędzy drut a nerw zablokowałoby połączenie elektryczne.
9. Ponownie osusz haczyk. Wymieszaj klej Kwik-Sil na okładzie z lodu.
10. Użyj końcówki szpilki, aby nałożyć niewielką ilość kleju Kwik-Sil, całkowicie pokrywając każdy odsłonięty drut haczyka, z wyjątkiem drutu uziemiającego.
11. Pozostaw klej do utwardzenia na około 5 minut, poprawiając go, jeśli odklei się od fragmentów haczyka. Klej jest utwardzony, gdy nie klei się już przy dotykaniu szpilką (Rysunek 4 przedstawia końcową konfigurację).
12. Po utwierdzeniu elektrody nerwu radularnego można uzyskać dostęp do mięśnia I2. W obszarze między BN1 a BN2 użyj pęsety z haczykiem, aby zaczepić i oddzielić 2 pasma mięśnia I2 od reszty mięśnia, delikatnie ciągnąc pasma do góry. Przymocuj elektrodę stosując tę samą procedurę.
13. Nerwy buccalne 2 i 3 są łatwo dostępne, a elektrody mocuje się według tej samej procedury.
14. Po przymocowaniu wszystkich elektrod wsuń zespół elektrod do ciała zwierzęcia aż do silikonowej kotwicy.
15. Zaszyj nacięcie wokół wystającego kabla elektrod, pozostawiając kotwicę wewnątrz zwierzęcia. Zabeziecz szwy superglue, aby zapewnić dobrą szczelność.
16. Wsuń złote końcówki złączy z drugiego końca elektrody w mały blok styropianu. Przenieś zwierzę do głównego zbiornika w napowietrzanym pojemniku izolacyjnym w celu rekonwalescencji przez noc.

Rycina 3. Schemat Aplysia aparat pokarmowy znany jako masa bukkalna. Przedstawiono nerwy bukkalne (BN1, BN2, BN3), nerw radularny (RN), który wychodzi z dołu zwoju bukkalnego, a następnie zanurza się pod mięśniem, oraz miejsce na mięśniu I2, w którym przymocowano elektrodę.

Rycina 4. Schematyczny rysunek pojedynczej elektrody przymocowanej do nerwu (lub mięśnia) i przyklejonej w miejscu implantacji. Należy zwrócić uwagę, że odizolowany fragment zakrzywionego haczyka znajduje się w bezpośrednim kontakcie z nerwem (lub mięśniem), jest unieruchomiony za pomocą superkleju i odizolowany elektrycznie od ośrodka płynnego za pomocą Kwik-Sil. Należy również zauważyć, że odizolowany koniec elektrody uziemiającej jest wystawiony na działanie ośrodka płynnego.

4. Rejestracja

1. Aklimatyzować zwierzę w napowietrzonym pojemniku, będąc podłączonym do sprzętu rejestrującego, przez co najmniej 1,5 godziny. Monitorować sygnał podczas aklimatyzacji zwierzęcia, aby zweryfikować poprawność działania wszystkich elektrod oraz niski poziom szumów.
2. Użyć kamery wideo do rejestracji zachowań żywieniowych, jednocześnie wykorzystując komputer do zapisu sygnałów z elektrod nerwowych i mięśniowych. Zsynchronizować nagrania wideo i elektrod za pomocą sygnału prostokątnego, który steruje licznikiem cyfrowym w widoku kamery, będąc jednocześnie rejestrowanym jako dodatkowy kanał w programie Axoscope na komputerze.
3. Zachowania żywieniowe wywołuje się technikami opisanymi w pracy Morton and Chiel 193.

Chociaż zwierzęta bezkręgowe nie wymagają formalnej zgody instytucjonalnej komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt, zapewniliśmy, że wszystkie zabiegi przeprowadzane na Aplysia minimalizują krzywdę i cierpienie zwierzęcia, a wszystkie techniki chirurgiczne są wykonywane przy pełnym znieczuleniu zwierzęcia.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 5. (A) Symultaniczne zapisy z czterech kanałów pochodzące z mięśnia (mięsień protraktor I2) oraz z trzech nerwów policzkowych (nerw radularny, RN, nerw policzkowy 2, BN2 i nerw policzkowy 3, BN3) podczas reakcji połykania. (B) Klatka z symultanicznego nagrania wideo zwierzęcia w stanie wolnego zachowania podczas połykania wstępnie przeciętego paska wodorostów (o szerokości 0,5 cm), który został zaznaczony białymi prążkami w odstępach 0,5 cm, aby umożliwić łatwą wizualizację jego ruchów podczas żerowania zwierzęcia.

Dyskusja

Kluczową innowacją, która przyczyniła się do sukcesu tych pomiarów, jest połączenie elektrod w jednym kablu. Wcześniej stosowano rejestrację z dwóch elektrod, jednak zwiększenie ich liczby do czterech osobnych elektrod prowadziło do powstawania zrostów chirurgicznych, które często uniemożliwiały zwierzęciu wykonywanie naturalnych ruchów podczas żerowania. Połączenie elektrod w jednym kablu zmniejsza objętość elektrod wewnątrz organizmu zwierzęcia, co z kolei ogranicza odpowiedź immunologiczną i pozwala zwierzęciu na swob...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stalowy drut powlekany emalią	California Fine Wire Company		0.001D, powłoka h
Domowy klej silikonowy Silicone II	GE Healthcare
Klej Kwik-Sil	World Precision Instruments, Inc.
Superglue Duro Qwik-Gel	Henkel Corp
Wzmacniacz A-M Systems model 1700	A-M Systems		Ustawienia filtra: 100-1000Hz nerwy, 10-1000Hz mięsień I2
Axoscope 10.1	Molecular Devices
Złote piny złącza	Bulgin	SA3148/1
Złote gniazda złącza	Bulgin	SA3149/1