Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Podsumowanie

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Streszczenie

System frakcjonowania GELFREE 8100 to nowoczesny system frakcjonowania białek zaprojektowany w celu maksymalizacji odzysku białek podczas frakcjonowania opartego na masie cząsteczkowej. System składa się z jednorazowych kartridży o pojemności 8 próbek oraz laboratoryjnego instrumentu do frakcjonowania GELFREE. Podczas rozdziału między zbiornikami anody i katody przyłożone jest stałe napięcie, a każda mieszanina białek jest przemieszczana elektroforetycznie z komory załadunkowej do specjalnie zaprojektowanej kolumny żelowej. Białka są zagęszczane w wąskim pasmie w żelu koncentrującym, a następnie rozdzielane na podstawie ich odpowiednich ruchliwości elektroforetycznych w żelu rozdzielczym. W miarę jak białka wypłukiwane są z kolumny, są one wychwytywane i zagęszczane w fazie ciekłej w komorze zbiorczej, wolne od żelu. Następnie instrument jest zatrzymywany w określonych odstępach czasu, a frakcje są pobierane za pomocą pipety. Proces ten jest powtarzany do momentu zebrania wszystkich pożądanych frakcji. Jeśli w kartridżu analizowanych jest mniej niż 8 próbek, niewykorzystane komory mogą zostać użyte w kolejnych rozdziałach.

Ta nowatorska technologia umożliwia szybkie i proste, jednoczesne rozdzielanie do 8 złożonych mieszanin białek i oferuje szereg zalet w porównaniu do wcześniej dostępnych metod frakcjonowania. System ten pozwala na frakcjonowanie do 1mg całkowitego białka na kanał, co daje łącznie 8mg na wkład. Nienaruszone białka z szerokiego zakresu mas są rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej, przy zachowaniu istotnych właściwości fizykochemicznych analitytu. Pułapkowanie w fazie ciekłej zapewnia wysoką odzyskalność, eliminując jednocześnie konieczność wycinania prążków lub plamek, co sprawia, że proces frakcjonowania jest wysoce powtarzalny¹.

Protokół

1. Przygotowanie próbki białka

1. W probówce do wirówki o pojemności 500 μl połączyć następujące składniki:

Odczynnik	Objętość do dodania:
*Próbka białka (do 1 mg)	Do 112 μL
Bufor do próbek (5X) dołączony do zestawu z kartridżem	30 μL
DTT 1M	8μL
18 Ω H2O	x μL do uzyskania całkowitej objętości próbki 150μL**

2. Próbki poddać denaturacji w temperaturze 95°C przez 5 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej.

*Całkowita ilość białka do rozdzielenia będzie zależeć od złożoności próbki. W przypadku bardziej złożonych próbek, takich jak homogenat tkankowy, zaleca się 150-200 μg na kanał.

**Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 112 μL, należy dodać 18 Ω H₂O, aby uzyskać objętość końcową 150 μL.

2. Załadunek kartridża GELFREE

1. Wyjmij kartridż GELFREE 8100 z foliowej torebki.
2. Zdejmij i wyrzuć uszczelniacz płytki.
3. Usuń bufor do przechowywania z komór kartridża za pomocą pipety. Jeśli używane będą wszystkie 8 komór kartridża, można go odwrócić, aby zlać bufor do przechowywania z komór.
4. Przygotuj kartridż do załadunku, dodając bufor do elektroforezy GELFREE do każdej z komór kartridża w następujący sposób:

Komora kartridża GELFREE	Objętość buforu do elektroforezy GELFREE do dodania
Rezerwuar buforu anodowego	8 mL
Rezerwuar buforu katodowego	6 mL
Komory zbiorcze	po 100 μL każda

5. Usuń i zutylizuj wszelki bufor z komory ładowania próbek.
6. Nanieś próbki o objętości 150 μL do komór ładowania, używając pipety 8-kanałowej.
7. Umieść załadowany kartridż w stacji frakcjonującej GELFREE 8100. Opuść układy elektrod i zamknij pokrywę.

3. Uruchomienie kartridża

1. Używając ekranu dotykowego urządzenia, naciśnij przycisk method, aby wyświetlić listę zaprogramowanych metod. Każda z zaprogramowanych metod składa się z określonych napięć i przerw czasowych zaprojektowanych w celu rozdzielenia białek w konkretnym zakresie mas cząsteczkowych. System GELFREE 8100 automatycznie zatrzyma pracę w celu pobrania frakcji w odstępach czasu określonych w metodzie.
2. Po zidentyfikowaniu odpowiedniej metody naciśnij przycisk retrieve i wprowadź numer żądanej zaprogramowanej metody za pomocą klawiatury ekranowej. Naciśnij ok, a następnie przycisk apply. Zastosowana metoda pojawi się w dolnej części głównego ekranu.
3. Aby wybrać kanały (liczbę próbek), które będą wykorzystane w przebiegu, naciśnij przycisk channel na głównym ekranie. Aby wybrać wszystkie osiem kanałów, naciśnij all. Następnie naciśnij done, aby powrócić do głównego ekranu.
4. Upewnij się, że pokrywa zabezpieczająca jest zamknięta, a kontrolka na dole ekranu świeci na zielono.
5. Aby rozpocząć rozdział białek, naciśnij start. Stacja frakcjonowania automatycznie zatrzyma pracę, gdy nadejdzie czas pobrania frakcji. Uwaga: Podczas pracy systemu okręgi widoczne w polu po lewej stronie ekranu obrazują status każdego kanału. Zielony okrąg oznacza, że kanał jest aktywny, żółty okrąg oznacza, że urządzenie zostało wstrzymane, a czerwony okrąg oznacza awarię kanału. Przyłożone napięcia i natężenia prądu są wyświetlane po prawej stronie okręgów stanu kanałów. Frakcje należy usuwać tylko wtedy, gdy okręgi stanu zmienią kolor na żółty i na ekranie urządzenia pojawi się powiadomienie tekstowe.
6. Aby usunąć frakcje, otwórz pokrywę urządzenia i za pomocą pipety 8-kanałowej pobierz 150 μL z każdej z komór zbiorczych.
7. Po usunięciu frakcji przemyj dwukrotnie komorę zbiorczą buforem do elektroforezy GELFREE Running Buffer, dodając 100 μl na kanał i pipetując w górę i w dół dwukrotnie.
8. Po przemyciu dodaj ponownie 100 μL buforu GELFREE Running Buffer do komór zbiorczych, zamknij pokrywę i naciśnij przycisk resume.
9. System GELFREE 8100 będzie pracować do następnego odstępu czasu. Całkowity pozostały czas eksperymentu jest wyświetlany po prawej stronie ekranu. Aby przełączać widok między time remaining, time elapsed a time to pause, naciśnij przycisk nad polem wyświetlającym czas.
10. Po zebraniu wszystkich frakcji można je natychmiast wykorzystać do dalszego przygotowania, takiego jak ogniskowanie izoelektryczne lub elektroforeza w żelu, lub do analizy z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas lub immunoafinności.

4. Reprezentatywne wyniki

200 μg homogenatu wątroby bydlęcej podzielono na 12 frakcji przy użyciu systemu frakcjonowania GELFREE. 6 μL każdej frakcji naniesiono na standardowy żel SDS PAGE 1D i zabarwiono srebrem. Jak pokazano na Rysunku 1, próbka białka została rozdzielona na 12 oddzielnych frakcji, obejmujących zakres masy cząsteczkowej od 3,5kDa do 150kDa. W ścieżkach 1 i 14 przedstawiono również marker masy cząsteczkowej (ColorBurst, Sigma). Przedstawiony żel podkreśla wysoką wydajność odzyskiwania białek osiągniętą dzięki zastosowaniu systemu GELFREE 8100 do frakcjonowania białek. Widoczny żel reprezentuje 4% białka odzyskanego z 200 μg.

Rysunek 1. Białka z homogenatu wątroby bydlęcej rozdzielone za pomocą systemu frakcjonowania GELFREE. Na żel do elektroforezy 1D SDS-PAGE naniesiono i przeprowadzono 6 μL z każdej frakcji o objętości 150 μL, a następnie zastosowano barwienie srebrem. Zgodnie z oznaczeniem naniesiono również wzorzec masy cząsteczkowej (MW). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Dyskusja

System frakcjonowania GELFREE 8100 zapewnia szybką, prostą i powtarzalną metodę podziału złożonych próbek białek na oddzielne frakcje w oparciu o masę cząsteczkową. Ta nowatorska metoda frakcjonowania eliminuje konieczność wycinania prążków lub plamek, umożliwiając izolację białek z szerokiego zakresu mas w ciągu 90 minut. Możliwość naniesienia stosunkowo dużych ilości próbki i odzyskania frakcji w fazie ciekłej jest szczególnie użyteczna przy izolacji i analizie białek o niskiej obfitości, które są zazwyczaj trudniejsze do wykrycia. Uzyskane frakcje mogą być następnie wykorzystane w szerokim spektrum zastosowań, takich jak LC-MS, MALDI-TOF oraz immunoblotting.