Ocena dwuwymiarowych prób krystalizacji białek o małej błonie do badań biologii strukturalnej za pomocą krystalografii elektronowej

Summary

Ocena dwuwymiarowych (2D) prób krystalizacji w celu tworzenia uporządkowanych matryc białek błonowych jest bardzo krytycznym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Tutaj opisujemy nasze podejście do badań przesiewowych i identyfikacji kryształów 2D głównie małych białek błonowych w zakresie 15 – 90 kDa.

Abstract

Krystalografia elektronowa rozwinęła się jako metoda, która może być używana alternatywnie lub w połączeniu z trójwymiarową krystalizacją i krystalografią rentgenowską do badania zagadnień struktura-funkcja białek błonowych, jak również białek rozpuszczalnych. Badania przesiewowe kryształów dwuwymiarowych (2D) za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (EM) są kluczowym krokiem w znajdowaniu, optymalizacji i selekcji próbek do zbierania danych o wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-EM. W tym miejscu opisujemy podstawowe kroki w identyfikacji zarówno dużych, uporządkowanych, jak i małych macierzy 2D, które mogą potencjalnie dostarczyć krytycznych informacji do optymalizacji warunków krystalizacji.

Pracując z różnymi powiększeniami w EM, uzyskuje się dane o szeregu krytycznych parametrów. Mniejsze powiększenie dostarcza cennych danych na temat morfologii i wielkości błony. Przy większych powiększeniach określana jest możliwa kolejność i wymiary kryształów 2D. W tym kontekście opisano, w jaki sposób kamery CCD i transformaty Fouriera online są używane przy większych powiększeniach do oceny proteoliposomów pod kątem kolejności i wielkości.

Podczas gdy kryształy 2D białek błonowych są najczęściej hodowane przez rekonstytucję przez dializę, technika przesiewowa jest równie przydatna dla kryształów wytworzonych za pomocą monowarstw, natywnych kryształów 2D i uporządkowanych tablic rozpuszczalnych białek. Ponadto opisane tutaj metody mają zastosowanie do badań przesiewowych pod kątem kryształów 2D nawet mniejszych, jak i większych białek błonowych, gdzie mniejsze białka wymagają takiej samej staranności w identyfikacji, jak nasze przykłady, a sieć większych białek może być łatwiejsza do zidentyfikowania na wcześniejszych etapach badań przesiewowych.

Protocol

1. Przygotowanie siatki do prób krystalizacji 2D

1. Siatki miedziane EM powlekane węglem o oczkach 400 są przygotowywane przez barwienie ujemne. Octan uranylu jest często stosowany i zapewnia długotrwałą plamę pod względem przechowywania roztworu przez kilka miesięcy przed użyciem, a także nadaje się do długotrwałego przechowywania siatek. Natomiast inne negatywne plamy, takie jak mrówczan uranylu, zapewniając doskonałe barwienie, muszą być świeżo wykonane ¹. W celu szybkiego przygotowania dużej liczby siatek do wykorzystania do badań przesiewowych w próbach krystalizacji 2D, stosuje się zmodyfikowaną wersję barwienia negatywowego. Objętość 2 μl próbki pipetuje się na pokrytą węglem siatkę EM i inkubuje przez 60 s. Następnie należy osuszyć krawędź podartym kawałkiem bibuły filtracyjnej Whatman #4 (Rysunek 1; wideo), a następnie natychmiast nakłada się 2 μl 1% octanu uranylu, które po 30 s ponownie usuwa się z krawędzi siatki. Dotknięcie siatki na krawędzi rozdartą krawędzią bibuły filtracyjnej zapewnia optymalne usuwanie cieczy bez usuwania proteoliposomów. Ponadto suszenie na krawędzi kratki zapewnia lepszą ochronę filmu węglowego. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania siatek i obchodzenia się z nimi, ponieważ pęknięcie delikatnej warstwy węglowej zapobiega przyleganiu próbki i może skutkować niedokładnym odwzorowaniem próbki. Podczas gdy tradycyjnie do przygotowania siatki rutynowo stosowano próbki o większej objętości wynoszącej 5 μl, cenne próbki można zaoszczędzić, zmniejszając objętość do 2 μl lub ^mniej2.
2. Aby wyprodukować jak największe membrany, niektóre z naszych próbek wymagają obecności w buforze dializacyjnym wysokich stężeń glicerolu lub sacharozy (10-20%). Może to mieć negatywny wpływ na przygotowanie siatki, ponieważ glicerol lub sacharoza są bardzo lepkie i uniemożliwiają octan uranylu prawidłowe przenikanie do buforu, a tym samym niepełne zabarwienie błon. W związku z tym ewentualna krata zostanie zasłonięta. Bufor może być wymieniony przez odwirowanie próbek i zastąpienie go buforem wolnym od glicerolu/sacharozy (nie pokazano), albo siatki mogą być przemyte buforem lub buforem wolnym od glicerolu/sacharozy w jednym do kilku cykli przed barwieniem ujemnym, podobnym do techniki stosowanej w przypadku cryo-EM ^3,4.

2. Ocena prób krystalizacji 2D przez EM

1. W zależności od rodzaju uchwytu na próbkę ładowana jest jedna lub wiele siatek. Powiększenie 2-10K, które będzie tutaj określane jako powiększenie pośrednie, pozwala na pierwsze wrażenie średniego rozkładu i zakresu dyspersji błon, morfologii i rozmiaru, co jest odnotowane w zeszycie laboratoryjnym ⁵. Odpowiednie obszary są rejestrowane jako reprezentatywne przeglądy za pomocą kamery CCD lub, jeśli kamera CCD nie jest dostępna, na kliszy.
2. Niskie powiększenie w zakresie około 400-800x jest stosowane w momentach, gdy pożądany jest przegląd całej próbki/siatki. Chociaż nie jest stosowana w przypadku każdej siatki, małe powiększenie dostarcza cennych informacji, które mogą pomóc w ocenie przygotowania siatki pod kątem kilku aspektów: zarówno barwienia ujemnego, jak i potencjalnego częściowego pęknięcia filmu węglowego, koncentracji próbki na siatce i ewentualnie nierównomiernego rozkładu proteoliposomów. Poszczególne kwadraty siatki można oglądać za pomocą lornetki lub kamery CCD. W przypadku niektórych EM-ów możliwe jest zapisanie pozycji o szczególnym znaczeniu, które można przywołać w celu późniejszej kontroli przy większych powiększeniach.
3. Po zidentyfikowaniu obszaru zainteresowania siatki przy małym lub średnim powiększeniu, powiększenie zmienia się na około 50K-60K. W zależności od wielkości membrany, kryształu i komórki elementarnej, jeśli są znane, stosuje się powiększenia od 30 K do 80 K. Zakres powiększeń 30-80K będzie określany jako duże powiększenie na potrzeby badania przesiewowego kryształów 2D. Ustawianie ostrości odbywa się albo w ustawieniu ostrości konfiguracji niskiej dawki, z późniejszym przełączeniem na ustawienie obrazu/zdjęcia, albo w pobliżu obszaru zainteresowania.
   1. W przypadku niejasności co do tego, czy obszar zainteresowania jest rzeczywiście membraną, próbka jest sprawdzana pod kątem filmu węglowego o wielkości proteoliposomów, miki lub innych artefaktów. W tym celu krawędzie ujawniają typowe fałdowanie i morfologię.
   2. Teraz obszar zainteresowania jest sprawdzany za pomocą kamery CCD. Obraz CCD jest zbierany w powiększeniu 30K-80K, w zależności od rozmiaru błony, rozmiaru białka lub komórki cząsteczkowej lub znanego obszaru krystalicznego. Sieć mniejszego i/lub w większości hydrofobowego białka błonowego niekoniecznie jest widoczna na podstawie wizualnej oceny samego obrazu CCD. Albo cały obraz jest używany do transformaty Fouriera online (FT, albo szybkiego FT -FFT). Ten FT będzie jednak zawierał znaczną ilość szumu, jeśli uporządkowana tablica jest mała. W ten sposób zmniejszony rozmiar obrazu w ramce pozwoli na poprawę stosunku sygnału do szumu mniejszego kryształu i łatwiejszą identyfikację. W tym celu pole jest przesuwane nad obrazem i oceniany jest aktywny FT.
      
      Intensywność/jasność wiązki jest regulowana z uwzględnieniem warunków niskiej dawki dla próbki, a także ustawień kamery CCD. W zależności od zastosowanej kamery CCD, gamma aktywnego FT jest dostosowywana w celu optymalnej identyfikacji uporządkowanych matryc. Zbyt wysoka wartość może zasłaniać miejsca z powodu udziału szumu, a zbyt niska wartość gamma uniemożliwi identyfikację słabszych punktów. Te słabsze punkty mogą być spowodowane mniejszymi układami krystalicznymi, z plamami w FT ledwo powyżej poziomu szumu.
      
      Chociaż dane w wyższej rozdzielczości zostały zebrane z niewielkiej liczby próbek ⁶, zwykle rozdzielczość ujemnie barwionych kryształów 2D jest ograniczona lub nie należy oczekiwać, że będzie lepsza niż rozdzielczość około 15A. Przy rozogniskowaniu około -400 nm oczekuje się, że nie więcej niż 1-3 rzędy plamek będzie łatwo zidentyfikowanych. Próbki na ogół nie są oceniane pod kątem rozdzielczości, ponieważ zbieranie danych krio-EM da właściwe wskazanie najwyższej osiągalnej rozdzielczości. Zwraca się jednak uwagę na ostrość plam i możliwą mozaikowatość.
4. Różne błony, a także morfologie błon, są oceniane pod kątem kolejności przy dużym powiększeniu. Jest to szczególnie ważne na początkowych lub pośrednich etapach prób krystalizacji 2D, ponieważ mniejsze, a nie większe proteoliposomy lub łaty błony mogą zawierać najbardziej obiecujące obszary. Bardzo niski procent kryształów 2D będzie wymagał akwizycji obrazu i FT, czyli dyfrakcji optycznej, dużej liczby obrazów, ponieważ wstępna identyfikacja uporządkowanych matryc często prowadzi do szybkiej poprawy rozmiaru i jakości ^2,4,7.

3. Reprezentatywne wyniki

Idealnie uporządkowane proteoliposomy mają łatwo rozpoznawalne, ostre punkty. Duże i dobrze uporządkowane kryształy można łatwo zidentyfikować za pomocą obrazów CCD online-FT lub dyfrakcji optycznej mikrofotografii.

Przykład pokazuje kryształy 2D małego białka błonowego o rozmiarze 18 kDa o wielkości do kilku mikronów. Plamy na FT są łatwe do zidentyfikowania i ostre. Ruch pudełka live-FT pokazuje, że sieć jest ciągła bez mozaikowości. Sieć większego białka z bardziej rozległą rozpuszczalną domeną można zidentyfikować na małym ekranie EM. Gromadzenie obrazów CCD i FT jest konieczne, aby zapewnić środki lepszej oceny i uzyskać informacje na temat, np. możliwej mozaikowości (pokaż FT). Obliczając FT proteoliposomu, który nie jest uporządkowany, szum można początkowo pomylić z plamkami. Jednak podczas gdy pole na live-FT zostanie przesunięte, plamy znikną. Z drugiej strony, małe matryce, o wątpliwej krystaliczności, będą miały swoje plamki pozostające nieruchome, gdy live-FT zostanie przesunięty nawet nieznacznie nad obszar obrazu. Co więcej, te małe kryształy można rozpoznać po tym, że zwykle mają te same rozmiary komórek elementarnych, a odległości między plamkami w różnych FT można mierzyć na różne sposoby, na przykład za pomocą okręgu o określonym rozmiarze. Kryształy lipidów wykazują wyraźną morfologię sieci i FT.

Nierzadko zdarza się, że podczas początkowych prób występują opady. W tym przypadku należy jednak odróżnić wytrącanie białek bez rekonstytucji od małych agregatów lipidowych. Próbki, które wydają się być osadami w małym powiększeniu, często okazują się agregatami lipidowymi, gdy są oglądane w większym powiększeniu. Po oględzinach w temperaturze 30-50 K, krawędzie tych ciemnych struktur ujawniają, że składają się one z błon bez wytrącania się białka. Są to ważne obserwacje, ponieważ w poniższych eksperymentach agregaty lipidowe mogą zostać powiększone do dużych błon.

Słabe wyniki w ocenie próbek są czasami związane z niskim stężeniem w błonie, co uniemożliwia prawidłowe i szybkie badanie. Często można to przezwyciężyć za pomocą wyższego stężenia białka do krystalizacji 2D przez dializę. Alternatywnie, membrany można pozostawić na kilka dni na dnie rurki Eppendorf podczas przechowywania. W niektórych przypadkach dochodzi do szybkiego lub niemal natychmiastowego osiadania membran, a pipetowanie od dna probówki spowoduje większą gęstość membrany na siatce. Inną, znacznie szybszą opcją jest wirowanie (przy 3000-8000 obr./min przez 1-3 minuty) próbek z późniejszym pobraniem próbki z dna probówki.

Próbki w optymalnych warunkach będą zawierały duży procent kryształów 2D. Nie jest konieczne dążenie do jednorodnego wyglądu membran, ponieważ największe i najbardziej uporządkowane kryształy 2D są wybierane wizualnie do zbierania danych. Tego typu próbki będą łatwo rozpoznawalne, gdy próby krystalizacji zostaną powtórzone, a także gdy próbki zostaną wykorzystane do zbierania danych krio-EM, co skutkuje maksymalną liczbą obrazów o wysokiej rozdzielczości.

Rysunek 1. Ten rysunek pokazuje osuszanie krawędzi siatki podartym kawałkiem bibuły filtracyjnej Whatman #4.

Discussion

Właściwa ocena próbek wymaga starannej oceny wystarczającej liczby membran. Na przykład próbki z ponad 180 zobrazowanymi proteoliposomami o zawartości zaledwie 2% dostarczyły krytycznych informacji do szybkiej optymalizacji warunków krystalizacji 2D ⁷.

Gdy dochodzi do wytrącania się białka, siatka może zostać porzucona z dalszego badania przesiewowego po kontroli w małym powiększeniu, chociaż czasami dochodzi do częściowego wytrącania białka. Nawet bardzo małe membrany o długości...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miedziane siatki TEM o oczkach 400 pokryte kleszczykami z folii
: zwykłe i antykapilarne			Dumont #5 i Dumont N5AC lub podobne
			do mikropipet i pipet
Bibuła filtracyjna Whatman #4 1
% octan
Próbka dializy do badania przesiewowego pod kątem 2D Kryształy
			dializacyjny bez glicerolu/sacharozy
transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)			podobny 80 i #8211; TEM 120kV wyposażony w Lab6 lub żarnik wolframowy i kamery filmowe i/lub CCD (kamery CCD Gatan Orius SC1000 i/lub UltraScan1000 oraz pakiet oprogramowania Gatan Digitial Micrograph lub kamery Tietz (TVIPS))