Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Krystalografia elektronowa ewoluowała jako metoda, która może być stosowana alternatywnie lub w połączeniu z krystalizacją trójwymiarową i krystalografią rentgenowską w celu badania zależności między strukturą a funkcją białek błonowych, a także białek rozpuszczalnych. Przesiewanie kryształów dwuwymiarowych (2D) za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (EM) jest krytycznym etapem w wyszukiwaniu, optymalizacji i wyborze próbek do zbierania danych o wysokiej rozdzielczości metodą cryo-EM. W niniejszym materiale opisujemy podstawowe kroki identyfikacji zarówno dużych i uporządkowanych, jak i małych macierzy 2D, które mogą dostarczyć kluczowych informacji niezbędnych do optymalizacji warunków krystalizacji.
Dzięki pracy z różnymi powiększeniami w EM uzyskuje się dane dotyczące szeregu krytycznych parametrów. Niższe powiększenie dostarcza cennych informacji o morfologii i rozmiarze błon. Przy wyższych powiększeniach określa się możliwy stopień uporządkowania oraz wymiary kryształów 2D. W tym kontekście opisano, w jaki sposób kamery CCD oraz transformacje Fouriera w czasie rzeczywistym są wykorzystywane przy wyższych powiększeniach do oceny uporządkowania i rozmiaru proteoliposomów.
Choć dwuwymiarowe (2D) kryształy białek błonowych najczęściej hoduje się poprzez rekonstytucję z wykorzystaniem dializy, opisana technika przesiewowa ma jednak jednakowe zastosowanie w przypadku kryształów otrzymywanych przy użyciu monowarstw, natywnych kryształów 2D oraz uporządkowanych macierzy białek rozpuszczalnych. Ponadto metody opisane w niniejszym opracowaniu można stosować do przesiewania kryształów 2D białek błonowych o jeszcze mniejszej, jak i większej masie cząsteczkowej; w przypadku białek mniejszych identyfikacja wymaga takiej samej staranności jak w przedstawionych przykładach, natomiast sieć krystaliczna większych białek może być łatwiejsza do zidentyfikowania na wcześniejszych etapach przesiewania.
Protokół
1. Przygotowanie siatki prób krystalizacji 2D
- Miedziane siatki EM o oczkach 400, powlekane węglem, są przygotowywane metodą barwienia negatywowego. Często stosuje się octan uranylu, który zapewnia trwałe barwienie, zarówno w kontekście przechowywania roztworu przez kilka miesięcy przed użyciem, jak i długoterminowego przechowywania samych siatek. W przeciwieństwie do niego, inne barwniki negatywowe, takie jak mrówczan uranylu, mimo że zapewniają doskonałe barwienie, muszą być przygotowywane bezpośrednio przed użyciem 1. Do szybkiego przygotowania dużej liczby siatek przeznaczonych do przesiewowych prób krystalizacji 2D stosuje się zmodyfikowaną wersję barwienia negatywowego. Objętość 2 μL próbki jest pipetowana na powlekaną węglem siatkę EM i inkubowana przez 60 s. Następnie nadmiar cieczy jest odsączany z krawędzi za pomocą rozerwanego kawałka papieru filtrowanego Whatman #4 (Rysunek 1; wideo), a następnie natychmiast nanosi się 2 μL 1% octanu uranylu, który po 30 s jest ponownie odsączany z krawędzi siatki. Dotykanie krawędzi siatki rozerwanym brzegiem papieru filtrowanego zapewnia optymalne usunięcie cieczy bez usuwania proteoliposomów. Ponadto osuszanie na krawędzi siatki zapewnia lepszą konserwację filmu węglowego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas przygotowania i obchodzenia się z siatkami, ponieważ uszkodzenie delikatnej warstwy węgla uniemożliwia przyleganie próbki i może prowadzić do nieprawidłowej reprezentacji materiału. Choć tradycyjnie do przygotowania siatek rutynowo stosowano i stosuje się większe objętości próbek (5 μL), cenne próbki można oszczędzać, redukując objętość do 2 μL lub mniej 2.
- Aby uzyskać membrany o jak największym rozmiarze, niektóre z naszych próbek wymagają obecności wysokich stężeń glicerolu lub sacharozy (10-20%) w buforze do dializy. Może to mieć negatywny wpływ na przygotowanie siatek, ponieważ glicerol lub sacharoza charakteryzują się wysoką lepkością, co utrudnia odpowiednią penetrację buforu przez octan uranylu i w konsekwencji prowadzi do niepełnego zabarwienia membran. W rezultacie potencjalna sieć krystaliczna może zostać przesłonięta. W takim przypadku można wymienić bufor poprzez wirowanie próbek i zastąpienie go buforem wolnym od glicerolu/sacharozy (nie pokazano), lub można przemyć siatki buforem lub buforem wolnym od glicerolu/sacharozy w jednym lub kilku cyklach przed barwieniem negatywowym, podobnie jak w technice stosowanej w cryo-EM 3,4.
2. Ocena prób krystalizacji 2D za pomocą EM
- W zależności od rodzaju uchwytu próbek ładuje się jedną lub kilka siatek. Powiększenie 2-10K, określane tutaj jako powiększenie pośrednie, pozwala na wstępną ocenę średniego rozkładu i stopnia dyspersji membran, ich morfologii oraz rozmiaru, co odnotowuje się w dzienniku laboratoryjnym 5. Odpowiednie obszary są rejestrowane jako reprezentatywne przeglądy za pomocą kamery CCD lub, w przypadku braku kamery CCD, na kliszy.
- Niskie powiększenie w zakresie około 400-800x stosuje się w sytuacjach, gdy wymagany jest przegląd całej próbki/siatki. Choć nie jest ono stosowane przy każdej siatce, niskie powiększenie dostarcza cennych informacji pomagających w ocenie przygotowania siatki pod kilkoma względami: zarówno w kwestii barwienia negatywowego, jak i potencjalnego częściowego przerwania folii węglowej, stężenia próbki na siatce, a także ewentualnie nierównomiernego rozkładu proteoliposomów. Poszczególne pola siatki można oglądać za pomocą binokularów lub kamery CCD. W niektórych mikroskopach elektronowych (EM) możliwe jest zapisywanie pozycji o szczególnym znaczeniu, które można przywołać do późniejszej inspekcji przy wyższych powiększeniach.
- Po zidentyfikowaniu obszaru siatki o szczególnym znaczeniu przy niskim lub pośrednim powiększeniu, zmienia się powiększenie na około 50K-60K. W zależności od rozmiaru membrany, kryształu i komórki elementarnej (jeśli są znane), stosuje się powiększenia od 30K do 80K. Zakres powiększeń 30-80K będzie określany jako powiększenie wysokie w celu przesiewania kryształów 2D. Ustawianie ostrości odbywa się albo w ustawieniu focus w konfiguracji niskiej dawki, z późniejszym przełączeniem na ustawienie obrazu/zdjęcia, albo w bezpośrednim sąsiedztwie obszaru zainteresowania.
- W przypadku niepewności, czy obszar zainteresowania jest rzeczywiście membraną, sprawdza się, czy nie jest to folia węglowa w rozmiarze proteoliposomów, mika lub inne artefakty. W tym celu krawędzie ujawniają typowe fałdowania i morfologię.
- Następnie obszar zainteresowania jest oglądany za pomocą kamery CCD. Obraz CCD jest zbierany przy powiększeniu 30K-80K, w zależności od rozmiaru membrany, białka lub komórki elementarnej, bądź znanego obszaru krystalicznego. Sieć mniejszego i/lub głównie hydrofobowego białka błonowego nie musi być widoczna podczas samej wizualnej oceny obrazu CCD. Wówczas cały obraz jest wykorzystywany do transformaty Fouriera online (FT lub szybkiej transformaty FT – FFT). Ta transformata FT będzie jednak zawierać znaczną ilość szumu, jeśli uporządkowana macierz jest mała. Zatem zmniejszenie rozmiaru ramki obrazu pozwoli na poprawę stosunku sygnału do szumu dla mniejszego kryształu i łatwiejszą identyfikację. W tym celu ramkę przesuwa się nad obrazem i ocenia dynamiczną transformatę FT.
Intensywność/jasność wiązki jest regulowana z uwzględnieniem warunków niskiej dawki dla próbki oraz ustawień kamery CCD. W zależności od zastosowanej kamery CCD, wartość gamma dynamicznej transformaty FT jest dostrajana w celu optymalnej identyfikacji uporządkowanych macierzy. Zbyt wysoka wartość może przesłonić plamki z powodu udziału szumu, a nadmiernie niska wartość gamma uniemożliwi identyfikację słabszych plamek. Te słabsze plamki mogą wynikać z mniejszych macierzy krystalicznych z plamkami w FT znajdującymi się tuż powyżej poziomu szumu.
Choć dla niewielkiej liczby próbek zebrano dane o wyższej rozdzielczości 6, zazwyczaj rozdzielczość kryształów 2D barwionych negatywowo jest ograniczona do lub nie powinna być lepsza niż około 15Å. Przy defokusie wynoszącym około -400 nm oczekuje się, że łatwo będzie zidentyfikować nie więcej niż 1-3 rzędy plamek. Próbki zazwyczaj nie są oceniane pod kątem rozdzielczości, ponieważ zbieranie danych cryo-EM dostarczy właściwej informacji o najwyższej osiągalnej rozdzielczości. Odnotowuje się jednak ostrość plamek i możliwą mozaikowość.
- Różne membrany, jak i morfologie membran, są oceniane pod kątem uporządkowania przy wysokim powiększeniu. Jest to szczególnie krytyczne na początku lub w pośrednich etapach prób krystalizacji 2D, ponieważ mniejsze, a nie większe proteoliposomy lub fragmenty membran mogą zawierać najbardziej obiecujące obszary. Bardzo niski odsetek kryształów 2D będzie wymagał akwizycji obrazów i wykonania FT lub dyfrakcji optycznej dla dużej liczby zdjęć, ponieważ wstępna identyfikacja uporządkowanych macierzy często prowadzi do szybkiej poprawy rozmiaru i jakości 2,4,7.
3. Reprezentatywne wyniki
Idealnie uporządkowane proteoliposomy wykazują łatwo rozpoznawalne, wyraźne plamki. Duże i dobrze uporządkowane kryształy można łatwo zidentyfikować za pomocą analizy online-FT obrazów CCD lub dyfrakcji optycznej mikrografii.
Przykład przedstawia kryształy 2D małego białka błonowego o masie 18kDa, które osiągają rozmiary do kilku mikronów. Plamki na FT są wyraźne i łatwo identyfikowalne. Ruch ramki live-FT pokazuje, że sieć jest ciągła i pozbawiona mozaikowości. Sieć większego białka z bardziej rozbudowaną domeną rozpuszczalną można zidentyfikować na małym ekranie EM. Gromadzenie obrazów CCD oraz FT jest niezbędne, aby zapewnić lepszą ocenę i uzyskać informacje np. o ewentualnej mozaikowości (pokaż FT). Podczas obliczania FT proteoliposomu, który nie jest uporządkowany, szum może zostać początkowo pomylony z plamkami. Jednakże podczas przesuwania ramki live-FT plamki te znikną. Z drugiej strony, w przypadku małych struktur o wątpliwej krystaliczności, plamki pozostaną stacjonarne, nawet gdy ramka live-FT zostanie lekko przesunięta nad obszarem obrazu. Co więcej, małe kryształy można rozpoznać po tym, że zazwyczaj mają takie same rozmiary komórki elementarnej, a odległości między plamkami w różnych FT można mierzyć na różne sposoby, np. za pomocą okręgu o określonej wielkości. Kryształy lipidów wykazują odmienną morfologię sieci i FT.
W początkowych próbach często zdarza się występowanie osadu. Należy jednak odróżnić wytrącanie białek bez rekonstytucji od małych agregatów lipidowych. Próbki, które przy niskim powiększeniu sprawiają wrażenie osadu, po obejrzeniu przy większym powiększeniu często okazują się być agregatami lipidowymi. Podczas inspekcji przy 30-50K krawędzie tych ciemnych struktur ujawniają, że składają się one z membran, bez wytrącania białka. Są to istotne obserwacje, ponieważ w kolejnych eksperymentach agregaty lipidowe mogą powiększyć się do postaci dużych membran.
Słabe wyniki podczas oceny próbek są niekiedy związane z niskim stężeniem błon, co uniemożliwia właściwy i szybki screening. Można temu często zaradzić, stosując wyższe stężenie białka podczas krystalizacji 2D metodą dializy. Alternatywnie, podczas przechowywania można pozostawić błony na kilka dni, aby osadziły się na dnie probówki Eppendorf. W niektórych przypadkach następuje szybkie lub niemal natychmiastowe osadzanie się błon, a pipetowanie z dna probówki pozwoli uzyskać większą gęstość błon na siatce. Inną, znacznie szybszą opcją jest wirowanie próbek (przy 3000-8000 rpm przez 1-3 minuty) z późniejszym pobraniem materiału z dna probówki.
Próbki przygotowane w optymalnych warunkach będą zawierać wysoki odsetek kryształów 2D. Homogeniczny wygląd membran nie jest konieczny, ponieważ do gromadzenia danych wybiera się wizualnie największe i najlepiej uporządkowane kryształy 2D. Próbki tego typu będą łatwo rozpoznawalne podczas powtarzania prób krystalizacji, a także podczas ich wykorzystania do gromadzenia danych w krio-EM, co pozwoli na uzyskanie maksymalnej liczby obrazów o wysokiej rozdzielczości.
Rysunek 1. Na tym rysunku przedstawiono osuszanie krawędzi siatki za pomocą kawałka papieru filtracyjnego Whatman #4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Prawidłowa ocena próbek wymaga starannego przeanalizowania wystarczającej liczby membran. Na przykład próbki, w których jedynie 2% obrazowanych proteoliposomów (spośród ponad 180) wykazywało obecność struktur krystalicznych, dostarczyły kluczowych informacji pozwalających na szybką optymalizację warunków krystalizacji 2D 7.
W przypadku wystąpienia wytrącania białka, siatka może zostać odrzucona z dalszego przesiewu po inspekcji przy niskim powiększeniu, choć sporadycznie zdarza się...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy naszym współpracownikom za dostarczenie cennych próbek białek, które przyczyniły się do zdobycia doświadczenia i sformułowania obserwacji w niektórych z naszych metod. Günther Schmalzing uprzejmie umożliwił FR dołączenie do tego projektu. Dziękujemy Barbarze Armbruster, Jacobowi Brinkowi i Deryckowi Millsowi za wyjątkową pomoc i wkład w zakresie aparatury. Finansowanie zostało zapewnione z grantu NIH HL090630.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| siatki TEM miedziane 400-mesh pokryte warstwą węgla | |||
| pincety: standardowe i antykapilarne | Dumont #5 i Dumont N5AC lub podobne | ||
| Mikropipeta i końcówki do pipet | |||
| papier filtracyjny Whatman #4 | |||
| 1% octan uranylu | |||
| próbka dializowana do badania pod kątem kryształów 2D | |||
| bufor do dializy bez glicerolu/sacharozy | Opcjonalnie | ||
| transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) JEOL-1400 | podobny TEM 80 – 120kV wyposażony w włókno Lab6 lub wolframowe oraz kamery filmowe i/lub CCD (kamery CCD Gatan Orius SC1000 i/lub UltraScan1000 oraz pakiet oprogramowania Gatan Digital Micrograph lub kamery Tietz (TVIPS)) |
Bibliografia
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
