Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Podsumowanie

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Streszczenie

W niniejszym artykule opisano i porównano procedurę usuwania nabłonka z poduszki tłuszczowej opracowaną przez DeOme KB et al.¹ oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al.², a następnie przedstawiono procedurę transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego. Procedura transplantacji gruczołu mlekowego jest powszechnie stosowana przez biologów badających gruczoły mlekowe, ponieważ wykorzystuje fakt, że znaczny rozwój nabłonka gruczołu mlekowego nie następuje przed okresem dojrzewania. W 3. tygodniu życia wzrost drzewa nabłonkowego gruczołu mlekowego ogranicza się do okolicy sutka, a poduszka tłuszczowa jest w znacznym stopniu pozbawiona nabłonka gruczołu mlekowego, natomiast do 7. tygodnia życia drzewo przewodowe nabłonka rozprzestrzenia się na całą poduszkę tłuszczową. W związku z tym, jeśli ta niewielka część poduszki tłuszczowej zawierająca nabłonek, czyli obszar między sutkiem a węzłem chłonnym, zostanie usunięta w 3. tygodniu życia, nabłonek endogenny nigdy nie zasiedli poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego, a taką poduszkę określa się jako „oczyszczoną”. W tym czasie do oczyszczonej poduszki tłuszczowej można przeszczepić nabłonek gruczołu mlekowego z innego źródła, gdzie ma on potencjał do rozbudowy drzew przewodowych w całej poduszce tłuszczowej. Procedura ta była wykorzystywana w wielu modelach eksperymentalnych, w tym do badania fenotypu guza w transgenicznej tkance nabłonkowej gruczołu mlekowego bez zakłócającego wpływu genotypu na cały organizm³, do identyfikacji komórek macierzystych gruczołu mlekowego poprzez transplantację komórek w ograniczonym rozcieńczeniu^4,5, określania, czy guzki hiperplastyczne przekształcają się w guzy gruczołu mlekowego⁶, oraz do oceny wpływu wcześniejszej ekspozycji hormonalnej na zachowanie nabłonka gruczołu mlekowego^7,8.

Trzytygodniowe myszy biorcy są znieczulane, oczyszczane i unieruchamiane na stole operacyjnym. Wykonuje się nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej w skórze, nie przechodząc przez otrzewną, rozciągające się od kości łonowej do mostka. Wykonuje się skośne nacięcia skóry od linii pośrodkowej przez miednicę w kierunku każdej z kończyn. Skórę odsuwa się od otrzewnej, aby odsłonić 4. gruczoł mlekowy pachwinowy. Poduszka tłuszczowa jest oczyszczana poprzez usunięcie tkanki tłuszczowej przedwęzłowej. Fragmenty nabłonka lub komórki nabłonkowe są przeszczepiane do pozostałej oczyszczonej poduszki tłuszczowej, a następnie ranę myszy zszywa się.

Protokół

1. Przygotowanie nabłonka do przeszczepu

Świeżą lub mrożoną tkankę nabłonkową dawcy można przeszczepić do oczyszczonej tkanki tłuszczowej, jednak wcześniejsze przygotowanie mrożonego nabłonka dawcy jest wygodniejsze, przy minimalnym spadku wydajności przeszczepu (>85% wydajności). Protokół przygotowania mrożonego nabłonka dawcy jest następujący:

Przed przygotowaniem nabłonka dawcy do przeszczepu, należy przygotować medium do zamrażania nabłonka i rozdzielić około 1ml do krioprobówek. Medium to można przechowywać w temperaturze 4°C do 6 miesięcy do momentu użycia. Medium do zamrażania zawiera podłoże DMEM/F12 buforowane HEPES i NaHCO₃, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).

Pobierz nabłonek gruczołu mlekowego od niedawno uśmierconej samicy myszy.

1. Przemyć mysz 70% EtOH.
2. Wykonaj cięcie wzdłuż linii pośrodkowej w płaszczyźnie strzałkowej przez ścianę ciała, prowadząc je od spojenia łonowego do mostka, tak aby nie przebić błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Wykonaj cięcie ukośne od początkowego nacięcia w okolicy spojenia łonowego w kierunku każdej z tylnych kończyn (Rysunek 1).
3. Oddziel ścianę ciała od błon surowiczych, aby odsłonić 5^th pachwinowy gruczoł mlekowy przytwierdzony do powięzi na wewnętrznej stronie ściany ciała. Najlepiej zrobić to, ostrożnie chwytając błony surowicze zakrzywioną częścią pęsety zakrzywionej, uważając, aby nie przebić brzusznej jamy ciała. Jednocześnie chwycić odciętą krawędź powłok skórnych pęsetą prostą z ząbkami i odsunąć ścianę ciała od błon surowiczych.
4. Zidentyfikuj węzeł chłonny w obrębie gruczołu mlekowego. Węzeł chłonny znajduje się na przecięciu trzech głównych naczyń krwionośnych w gruczole mlekowym i jest wyczuwalny jako gęsty guzek w obrębie poduszki tłuszczowej (rycina 2). Za pomocą końcówki nożyczek okulistycznych odetnij tkankę tłuszczową otaczającą węzeł. Naciskając palcem wskazującym od strony naskórka skóry, unieś węzeł z poduszki tłuszczowej i chwyć go pęsetą zakrzywioną. Usuń węzeł chłonny.
5. Trzymając brzegi skóry, chwyć tkankę tłuszczową gruczołu mlekowego zakrzywioną krawędzią zakrzywionej pęsety i stopniowo odrywaj tkankę tłuszczową od ściany ciała. Postępuj zgodnie z kierunkiem tkanki tłuszczowej w stronę powierzchni grzbietowej myszy, usuwając cały gruczoł mlekowy w jednym kawałku.
6. Umieść gruczoł mlekowy na sterylnym plastikowym bloku do cięcia. Dodaj niewielką ilość pożywki, około 200 μl, na powierzchnię gruczołu, aby utrzymać jego wilgotność. Rozdrobnij gruczoł na kawałki o wielkości 1 mm za pomocą nowego ostrza do golenia. Podziel rozdrobniony gruczoł na cztery części i za pomocą pęsety rozdziel je pomiędzy cztery krioprobówki zawierające medium do mrożenia. Umieść krioprobówki w zamrażarce do komórek Nalgene „Mr. Frosty”, w której zewnętrznej komorze znajduje się 250 ml alkoholu izopropylowego. Umieść zamrażarkę Nalgene w -70°C zamrażarkę na 24 godziny. Zamrożone probówki z fragmentami gruczołu mlekowego należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu ich wykorzystania w transplantacji. Każda krio-probówka będzie zawierać wystarczającą liczbę fragmentów gruczołu mlekowego do transplantacji do oczyszczonych poduszek tłuszczowych od 4 do 8 myszy biorców.

2. Przygotowanie komórek do transplantacji

W naszym laboratorium przeprowadzaliśmy transplantacje różnych typów komórek, w tym unieśmiertelnionych linii komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego, linii komórek nowotworowych gruczołu mlekowego lub pierwotnych komórek gruczołu mlekowego, do oczyszczonej poduszki tłuszczowej myszy. Protokół przygotowania komórek Comma-D do transplantacji przedstawia się następująco:

1. Komórki Comma-D hoduje się w standardowym medium MECL składającym się z DMEM:F12 uzupełnionego o 2% surowicy bydlęcej dla dorosłych (ABS), mEGF, insulinę oraz antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy (AB/AM).
2. Komórki Comma-D zbiera się, gdy osiągną 85%-90% konfluencji.
3. Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 1200rpm przez 5 minut w celu utworzenia osadu komórkowego. Komórki resuspensuje się w świeżym medium MECL i dostosowuje ich stężenie do 5 x 10⁶/ml.

W celu transplantacji pierwotnych komórek gruczołu mlekowego, pierwotne komórki nabłonka gruczołu mlekowego izoluje się z 5^th par gruczołów mlekowych myszy poprzez dysocjację mechaniczną i enzymatyczną. Komórki resuspenduje się w pożywce DMEM:F12 i dostosowuje do pożądanego stężenia, zazwyczaj 5 x 10⁶/ml.

3. Standardowa procedura oczyszczania tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego myszy

1. Zanurz mysz gospodarza w wieku trzech tygodni w narkozie. Wybierz myszy o masie <12 g, aby mieć pewność, że wzrost przewodów mlecznych nie został jeszcze zainicjowany. Stosujemy 200mg/kg masy ciała 2,2,2-tribromoetanolu.
2. Po znieczuleniu myszy, unieruchom ją pewnie na stole chirurgicznym w pozycji brzusznej, z rozpostartymi kończynami, tak aby brzuch był napięty. Przed operacją podaj podskórnie leki przeciwbólowe: bupiwakainę (<1mg/kg) lub buprenorfinę (0.05mg/kg).
3. Chwyć skórę pęsetą kilka milimetrów powyżej miednicy i unieś ją od brzucha. Nacinając skórę nożyczkami, wykonaj cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż sagi przez ścianę ciała, rozciągając je od łonka do mostka. Nie przebijaj błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Nie wykonuj początkowego nacięcia zbyt blisko cewki moczowej, aby klipsy chirurgiczne nie utrudniały myszy oddawania moczu.
4. Od miejsca początkowego nacięcia wykonaj ukośne cięcia skóry od linii środkowej przez miednicę w kierunku każdej z tylnych kończyn.
5. Używając zakrzywionej części pęsety zakrzywionej, delikatnie chwyć błony surowicze. Użyj pęsety tkankowej, aby chwycić krawędź naciętej skóry i odsunąć ścianę ciała od błon surowiczych, odsłaniając 5^tą gruczoł mlekowy pachwinowy znajdujący się na powięzi na spodniej stronie ściany ciała.
6. Wypal elektrokoagulacyjnie suteczek, węzeł i dwie tętnice prowadzące do węzła (Rycina 2).
7. Oddziel czwarty i piąty gruczoł. Wypal krawędź piątego gruczołu, aby zapobiec wrośnięciu tkanki z 6^tego gruczołu.
8. Podziel poduszeczkę tłuszczową czwartego gruczołu mlekowego, przecinając ją nożyczkami w poprzek, tuż brzusznie (od strony suteczka) od węzła. Użyj pęsety zakrzywionej, aby pewnie chwycić brzuszną część poduszeczki tłuszczowej i odsunąć ją od ściany ciała w jednym kawałku. Przyciśnij brzuszną część poduszeczki tłuszczowej między dwa szkiełka i umieść w szklanej kuwecie do barwienia histologicznego zawierającej utrwalacz Carnoy'a. Tkanka ta zostanie później utrwalona i zabarwiona roztworem karminu ałunowego w celu sprawdzenia czystości marginesów (Rycina 3). Oczyść powięź wokół obszaru usuniętej części poduszeczki tłuszczowej za pomocą pęsety zakrzywionej, aby usunąć wszelkie pozostałości gruczołu mlekowego.

4. Alternatywna „procedura oszczędzająca” usuwania tkanki tłuszczowej z poduszeczki tłuszczowej

Po opanowaniu standardowej procedury oczyszczania tkanki tłuszczowej poduśmielkowej myszy, można spróbować zastosować mniej inwazyjną procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill et al. (2008)².

1. Przygotować mysz zgodnie ze standardową procedurą.
2. Chwycić sutek czwartej pachwinowej gruczołu mlekowego i wyciąć końcówką nożyczek okrąg o obwodzie 3-5 mm wokół sutka.
3. Odciągnąć sutek od ciała, aby oddzielić wycięty fragment skóry, a następnie wyciągnąć czwarty pachwinowy gruczoł mlekowy przez otwór.
4. Zidentyfikować węzeł. Użyć kauteryzatora, aby wypalić węzeł oraz 6^th gruczoł mlekowy przez otwór.
5. Wyciąć i oddzielić najbardziej powierzchowną część 5^th gruczołu mlekowego bezpośrednio przed węzłem. Sutek, kolisty obszar skóry oraz część tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego zawierająca nabłonek zostają usunięte w jednym kawałku.

5. Transplantacja tkanek/komórek

1. W przypadku przeszczepiania fragmentów nabłonka, rozmrozić krio probówkę z nabłonkiem i przenieść fragmenty nabłonka do szalki Petriego zawierającej świeże medium w celu rozcieńczenia DMSO. Końcówką nożyczek wykonać mały otwór lub kieszeń w oczyszczonej poduszce tłuszczowej dla nowego nabłonka. Za pomocą pęsety igłowej umieścić 1 mm fragment nabłonka dawcy w kieszeni. Podczas wycofywania pęsety igłowej, zamknąć kieszeń za pomocą pęsety tkankowej, aby tkanka pozostała na miejscu.
2. W przypadku przeszczepiania komórek, wstrzyknąć 50 000 komórek w 10 μl medium do każdej poduszki tłuszczowej, używając strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl z igłą o rozmiarze 22g.

6. Uśpienie/wybudzenie myszy

1. Przygotuj skórę do zamknięcia. Chwyć przeciwległe brzegi skóry, przytrzymaj je pęsetą, unieś je znad błon surowiczych brzusznej jamy ciała i zamknij za pomocą klipsów ranowych. Typowo, w standardowej procedurze, konieczne jest użycie dwóch klipsów do zamknięcia nacięcia w linii pośrodkowej oraz jednego klipsa dla każdego nacięcia ukośnego. Unikaj blokowania cewki moczowej. Może być konieczne zamknięcie przerw w skórze na przecięciu nacięć pośrodkowego i ukośnych za pomocą szwu. Procedura oszczędzająca wymaga użycia tylko jednego klipsa ranowego na każdą stronę.
2. Umieść mysz w klatce i trzymaj klatkę pod lampą grzewczą, aż mysz dojdzie do siebie.
3. Klipsy ranowe należy usunąć po 2 tygodniach.

Rycina 1. Prezentacja schematu nacięć.

Rysunek 2. Lokalizacja węzła chłonnego, naczyń krwionośnych, sutka i nabłonka endogennego. Przeprowadzić kauteryzację w zaznaczonych miejscach.

Rycina 3. Preparat całego organu wykazuje, że endogenne nabłonkowe ograniczone jest do obszaru wewnątrz koła, w związku z czym marginesy są „czyste”.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 4. Preparat całego usuniętego płata tłuszczowego od 3-tygodniowej myszy, wykazujący oczyszczone krawędzie.

Rysunek 5. Preparat całego organu od 10-tygodniowej myszy, przedstawiający poduszkę tłuszczową oczyszczoną z endogennego nabłonka gruczołu mlekowego.

Rysunek 6. Przekrój podkładki tłuszczowej myszy w wieku 10 tygodni, barwiony hematoksyliną i eozyną.

Rycina 7. Preparat całego organu od 10-tygodniowej myszy, przedstawiający prawidłowo rozwinięte drzewo przewodów mlecznych powstałe z przeszczepionego nabłonka.

Rycina 8. Przekrój przewodów mlecznych wykształconych z przeszczepionego nabłonka, barwiony hematoksyliną i eozyną.

Rysunek 9. Przekrój guza piersi rozwiniętego z przeszczepionego nabłonka, barwiony hematoksyliną i eozyną.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiamy dwie alternatywne metody usuwania tkanki tłuszczowej z poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy w ramach przygotowania do przeszczepów nabłonka gruczołu mlekowego. Procedura standardowa jest stosowana od czasu jej opracowania w 1959 roku przez DeOme et al.¹ Choć jest bardziej inwazyjna, metoda standardowa jest preferowana w szkoleniu osób początkujących, ponieważ pozwala na łatwą obserwację struktury i orientacji gruczołu mlekowego. Jednak bardziej doświadczony...