Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Podsumowanie

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Streszczenie

W niniejszym artykule opisano i porównano procedurę usuwania nabłonka z poduszki tłuszczowej opracowaną przez DeOme KB et al.¹ oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al.², a następnie przedstawiono procedurę transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego. Procedura transplantacji gruczołu mlekowego jest powszechnie stosowana przez biologów badających gruczoły mlekowe, ponieważ wykorzystuje fakt, że znaczny rozwój nabłonka gruczołu mlekowego nie następuje przed okresem dojrzewania. W 3. tygodniu życia wzrost drzewa nabłonkowego gruczołu mlekowego ogranicza się do okolicy sutka, a poduszka tłuszczowa jest w znacznym stopniu pozbawiona nabłonka gruczołu mlekowego, natomiast do 7. tygodnia życia drzewo przewodowe nabłonka rozprzestrzenia się na całą poduszkę tłuszczową. W związku z tym, jeśli ta niewielka część poduszki tłuszczowej zawierająca nabłonek, czyli obszar między sutkiem a węzłem chłonnym, zostanie usunięta w 3. tygodniu życia, nabłonek endogenny nigdy nie zasiedli poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego, a taką poduszkę określa się jako „oczyszczoną”. W tym czasie do oczyszczonej poduszki tłuszczowej można przeszczepić nabłonek gruczołu mlekowego z innego źródła, gdzie ma on potencjał do rozbudowy drzew przewodowych w całej poduszce tłuszczowej. Procedura ta była wykorzystywana w wielu modelach eksperymentalnych, w tym do badania fenotypu guza w transgenicznej tkance nabłonkowej gruczołu mlekowego bez zakłócającego wpływu genotypu na cały organizm³, do identyfikacji komórek macierzystych gruczołu mlekowego poprzez transplantację komórek w ograniczonym rozcieńczeniu^4,5, określania, czy guzki hiperplastyczne przekształcają się w guzy gruczołu mlekowego⁶, oraz do oceny wpływu wcześniejszej ekspozycji hormonalnej na zachowanie nabłonka gruczołu mlekowego^7,8.

Trzytygodniowe myszy biorcy są znieczulane, oczyszczane i unieruchamiane na stole operacyjnym. Wykonuje się nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej w skórze, nie przechodząc przez otrzewną, rozciągające się od kości łonowej do mostka. Wykonuje się skośne nacięcia skóry od linii pośrodkowej przez miednicę w kierunku każdej z kończyn. Skórę odsuwa się od otrzewnej, aby odsłonić 4. gruczoł mlekowy pachwinowy. Poduszka tłuszczowa jest oczyszczana poprzez usunięcie tkanki tłuszczowej przedwęzłowej. Fragmenty nabłonka lub komórki nabłonkowe są przeszczepiane do pozostałej oczyszczonej poduszki tłuszczowej, a następnie ranę myszy zszywa się.

Protokół

1. Przygotowanie nabłonka do przeszczepienia

Świeżą lub zamrożoną tkankę nabłonkową dawcy można przeszczepić do oczyszczonej poduszki tłuszczowej, jednak wcześniejsze przygotowanie zamrożonego nabłonka dawcy jest bardziej wygodne przy minimalnym spadku wydajności przeszczepienia (wydajność >85%). Protokół przygotowania zamrożonego nabłonka dawcy jest następujący:

Przed przygotowaniem nabłonka dawcy do przeszczepu należy przygotować medium do mrożenia nabłonka i rozdzielić około 1ml do krio-probówek. Może być ono przechowywane w temperaturze 4°C do 6 miesięcy aż do momentu użycia. Medium do mrożenia zawiera pożywkę DMEM/F12 buforowaną HEPES i NaHCO₃, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 10% dimetylosulfoksydu (DMSO).

Pobierz nabłonek gruczołów mlekowych od niedawno uśpistej samicy myszy.

1. Przemyj mysz 70% EtOH.
2. Wykonaj cięcie pośrodkowo-strzałkowe przez ścianę ciała, rozciągając je od kości łonowej do mostka, nie przebijając błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Wykonaj cięcie ukośne od początkowego nacięcia przy kości łonowej w kierunku każdej z tylnych kończyn (Rycina 1).
3. Odsuń ścianę ciała od błon surowiczych, aby odsłonić 5^th gruczoł mlekowy pachwinowy przytwierdzony do powięzi na spodniej stronie ściany ciała. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest ostrożne chwycenie błon surowiczych zakrzywioną częścią pęsety anatomicznej, dbając o to, by nie przebić brzusznej jamy ciała. Jednocześnie chwyć przeciętą krawędź powłok za pomocą prostej pęsety ząbkowanej i odsuń ścianę ciała od błon surowiczych.
4. Zidentyfikuj węzeł chłonny w obrębie gruczołu mlekowego. Węzeł chłonny znajduje się na przecięciu trzech wyraźnych naczyń krwionośnych w gruczole mlekowym i jest wyczuwalny jako gęsty guzek wewnątrz poduszki tłuszczowej (Rycina 2). Końcem nożyczek okularowych odetnij tkankę tłuszczową otaczającą węzeł. Kładąc palec wskazujący na stronie epidermalnej skóry, wywieraj nacisk, aby unieść węzeł z poduszki tłuszczowej, a następnie chwyć go i odetnij pęsetą anatomiczną. Usuń węzeł chłonny.
5. Trzymając brzegi skóry, chwyć poduszkę tłuszczową gruczołu mlekowego zakrzywioną krawędzią pęsety anatomicznej i stopniowo oddzielaj poduszkę tłuszczową od ściany ciała. Podążaj zgodnie z kierunkiem poduszki tłuszczowej w stronę grzbietowej powierzchni myszy, usuwając cały gruczoł mlekowy w jednym kawałku.
6. Umieść gruczoł mlekowy na sterylnym plastikowym bloku do cięcia. Dodaj niewielką ilość medium, około 200 μl, na powierzchnię gruczołu, aby utrzymać go w wilgoci. Rozdrobnij gruczoł na fragmenty o wielkości 1mm za pomocą świeżego ostrza żyletki. Podziel rozdrobniony gruczoł na cztery porcje i rozdziel je pęsetą pomiędzy cztery kryjowialki z medium do mrożenia. Umieść kryjowialki w pojemniku Nalgene „Mr. Frosty”, w którego zewnętrznej komorze znajduje się 250ml alkoholu izopropylowego. Włóż pojemnik Nalgene do zamrażarki o temperaturze -70°C na 24 godziny. Przechowuj zamrożone fiolki z fragmentami gruczołu mlekowego w ciekłym azocie do czasu transplantacji. Każda kryjowialka będzie zawierać wystarczającą ilość fragmentów gruczołu mlekowego do transplantacji do oczyszczonych poduszek tłuszczowych od 4 do 8 myszy biorców.

2. Przygotowanie komórek do transplantacji

W naszym laboratorium przeszczepialiśmy różne typy komórek, w tym unieśmiertelnione linie komórkowe nabłonka gruczołu mlekowego, linie komórkowe guzów piersi oraz pierwotne komórki gruczołu mlekowego, do oczyszczonej poduszki tłuszczowej myszy. Protokół przygotowania komórek Comma-D do transplantacji przedstawia się następująco:

1. Komórki Comma-D hoduje się w standardowym medium MECL składającym się z DMEM:F12 uzupełnionego o 2% surowicy bydlęcej dla dorosłych (ABS), mEGF, insulinę oraz antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy (AB/AM).
2. Komórki Comma-D zbiera się, gdy osiągną 85%-90% konfluencji.
3. Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 1200rpm przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Komórki resuspenduje się w świeżym medium MECL i dostosowuje ich stężenie do poziomu 5 x 10⁶/ml.

W celu transplantacji pierwotnych komórek gruczołu piersiowego, pierwotne komórki nabłonka gruczołu piersiowego izoluje się z 5^th par gruczołów piersiowych myszy poprzez dysocjację mechaniczną i enzymatyczną. Komórki resuspenduje się w pożywce DMEM:F12 i dostosowuje do pożądanej koncentracji, zazwyczaj 5 x 10⁶/ml.

3. Standardowa procedura oczyszczania tkanki tłuszczowej poduśnice piersiowej myszy

1. Zapodaj znieczulenie myszy gospodyni w wieku trzech tygodni. Wybierz myszy o masie <12 g, aby mieć pewność, że nie rozpoczęło się jeszcze wzrostowe różnicowanie przewodów mlecznych. Stosujemy 200mg/kg masy ciała 2,2,2-tribromoetanolu.
2. Po znieczuleniu myszy należy ją mocno unieruchomić na stole operacyjnym w pozycji brzusznej z rozpostartymi kończynami, tak aby brzuch był napięty. Przed operacją podaj podskórnie leki przeciwbólowe: bupiwakainę (<1mg/kg) lub buprenorfinę (0.05mg/kg).
3. Chwyć skórę pęsetą kilka milimetrów powyżej miednicy i unieś ją znad brzucha. Natnij skórę nożyczkami, wykonując cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż osi ciała od spojwienia do mostka. Nie przebijaj błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Pierwsze nacięcie nie powinno znajdować się zbyt blisko cewki moczowej, aby klipsy chirurgiczne nie utrudniały myszy oddawania moczu.
4. Od miejsca pierwszego nacięcia wykonaj ukośne cięcia skóry od linii środkowej przez miednicę w kierunku każdej z tylnych kończyn.
5. Za pomocą zakrzywionej części pęsety delikatnie chwyć błony surowicze. Używając pęsety tkankowej, chwyć krawędź cięcia skóry i odsuń ścianę ciała od błon surowiczych, aby odsłonić 5^tą gruczoł mleczny pachwinowy znajdujący się na powięzi po stronie brzusznej ściany ciała.
6. Wypal elektrokoagulacyjnie sutek, węzeł oraz dwie tętnice prowadzące do węzła (Rysunek 2).
7. Oddziel czwarty i piąty gruczoł. Wypal krawędź piątego gruczołu, aby zapobiec wrośnięciu 6^tego gruczołu.
8. Podziel tkankę tłuszczową czwartego gruczołu mlecznego, przecinając ją nożyczkami w poprzek, tuż brzusznie (od strony sutka) od węzła. Użyj zakrzywionej pęsety, aby mocno chwycić część brzuszną tkanki tłuszczowej i oderwać ją od ściany ciała w jednym kawałku. Przyciśnij część brzuszną tkanki tłuszczowej między dwa szkiełka i umieść w szklanej kuwecie do barwienia histologicznego zawierającej utrwalacz Carnoy'a. Tkanka ta zostanie później utrwalona i zabarwiona roztworem karminu ałunowego w celu sprawdzenia czystości marginesów (Rysunek 3). Oczyść powięź wokół obszaru usuniętej części tkanki tłuszczowej za pomocą zakrzywionej pęsety, aby usunąć wszelkie pozostałości gruczołu mlecznego.

4. Alternatywna „procedura oszczędzająca” oczyszczania podskórnej tkanki tłuszczowej

Po opanowaniu standardowej procedury usuwania tkanki tłuszczowej z poduszki mlecznej myszy, można spróbować zastosować mniej inwazyjną procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill et al. (2008)².

1. Przygotuj mysz zgodnie ze standardową procedurą.
2. Chwyć sutek czwartego pachwinowego gruczołu mlekowego i wytnij końcem nożyczek okrąg o obwodzie 3-5 mm wokół sutka.
3. Odciągnij sutek od ciała, aby oddzielić wyciętą część skóry, i wyciągnij czwarty pachwinowy gruczoł mlekowy przez otwór.
4. Zidentyfikuj węzeł. Użyj kauteryzatora, aby wypalić węzeł oraz 6^th gruczoł mlekowy przez otwór.
5. Wytnij i oddziel najbardziej powierzchowną część 5^th gruczołu mlekowego bezpośrednio przed węzłem. Sutek, okrągły obszar skóry oraz część tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego zawierająca nabłonek zostają usunięte w jednym kawałku.

5. Transplantacja tkanek/komórek

1. W celu przeszczepienia fragmentów nabłonka, rozmrozić krioampułkę z nabłonkiem i przenieść fragmenty nabłonka do szalki Petriego zawierającej świeżą pożywkę w celu rozcieńczenia DMSO. Za pomocą końcówki nożyczek wykonać mały otwór lub kieszeń w oczyszczonej poduszce tłuszczowej dla nowego nabłonka. Umieścić fragment nabłonka dawcy o rozmiarze 1mm w kieszeni, używając pęsety igłowej. Podczas wycofywania pęsety igłowej, przytrzymać zamkniętą kieszeń pęsetą tkankową, aby tkanka pozostała na miejscu.
2. W celu przeszczepienia komórek, wstrzyknąć 50 000 komórek w 10 μl pożywki do każdej poduszki tłuszczowej, używając strzykawki Hamiltona o pojemności 50μl z igłą o rozmiarze 22G.

6. Zamykanie/reanimacja myszy

1. Przygotuj skórę do zamknięcia. Chwyć przeciwległe brzegi skóry, przytrzymaj je pęsetą, unieś je znad błon surowiczych brzusznej jamy ciała i zamknij za pomocą klipsów chirurgicznych. Typowo, w standardowej procedurze, konieczne jest użycie dwóch klipsów do zamknięcia nacięcia pośrodkowego strzałkowego oraz jednego klipsa dla każdego nacięcia skośnego. Unikaj zasłaniania cewki moczowej. Może być konieczne zamknięcie przerw w skórze na przecięciu nacięć pośrodkowego strzałkowego i skośnych za pomocą szwu. Procedura oszczędzająca będzie wymagała jedynie jednego klipsa chirurgicznego na każdą stronę.
2. Umieść mysz w klatce i trzymaj klatkę pod lampą grzewczą, aż mysz odzyska przytomność.
3. Klipsy chirurgiczne należy usunąć po 2 tygodniach.

Rycina 1. Prezentacja schematu nacięć.

Rycina 2. Położenie węzła chłonnego, naczyń krwionośnych, sutka i nabłonka endogennego. Wykonać kauteryzację w zaznaczonych miejscach.

Rysunek 3. Preparat całego organu wykazuje, że nabłonek endogenny ogranicza się do obszaru w obrębie okręgu, w związku z czym marginesy są „czyste”.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 4. Całkowity preparat usuniętej poduszeczki tłuszczowej od 3-tygodniowej myszy, wykazujący oczyszczone krawędzie.

Rysunek 5. Preparat całego narządu od 10-tygodniowej myszy, przedstawiający tkankę tłuszczową oczyszczoną z endogennego nabłonka gruczołu mlekowego.

Rysunek 6. Przekrój oczyszczonej poduszki tłuszczowej 10-tygodniowej myszy, barwiony hematoksyliną i eosiną.

Rycina 7. Preparat całego organu z 10-tygodniowej myszy, przedstawiający prawidłowo rozwinięte drzewo przewodów mlekowych powstałe z przeszczepionego nabłonka.

Rysunek 8. Przekrój przewodów mlekowych rozwiniętych z przeszczepionego nabłonka, barwiony hematoksyliną i eozyną.

Rysunek 9. Przekrój guza gruczołu mlekowego rozwiniętego z przeszczepionego nabłonka, barwiony hematoksyliną i eozyną.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiamy dwie alternatywne metody usuwania tkanki tłuszczowej z poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy w ramach przygotowania do przeszczepów nabłonka gruczołu mlekowego. Procedura standardowa jest stosowana od czasu jej opracowania w 1959 roku przez DeOme et al.¹ Choć jest bardziej inwazyjna, metoda standardowa jest preferowana w szkoleniu osób początkujących, ponieważ pozwala na łatwą obserwację struktury i orientacji gruczołu mlekowego. Jednak bardziej doświadczony...