Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Podsumowanie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Streszczenie

MSC to populacja dorosłych komórek macierzystych, która stanowi obiecujące źródło w zastosowaniach terapeutycznych. Komórki te można wyizolować ze szpiku kostnego i łatwo oddzielić od hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) dzięki ich zdolności do przylegania do tworzywa sztucznego. Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji MSC z kości udowych i piszczeli szczura. Wyizolowane komórki zostały następnie wzbogacone pod kątem dwóch markerów powierzchniowych MSC, CD54 i CD90, za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych CD54 i CD90 potwierdzono następnie analizą cytometrii przepływowej. Włączono również marker HSC CD45, aby sprawdzić, czy z posortowanych MSC usunięto komórki HSC. MSC są naturalnie dość heterogeniczne. Istnieją subpopulacje komórek o różnych kształtach, zdolnościach do proliferacji i różnicowania. Wszystkie te subpopulacje wykazują ekspresję znanych markerów MSC i nie zidentyfikowano dotąd żadnego unikalnego markera dla poszczególnych subpopulacji. Dlatego alternatywnym podejściem do wydzielenia różnych subpopulacji jest zastosowanie cylindrów klonujących w celu odseparowania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Komórki pochodzące z pojedynczych kolonii mogą być następnie hodowane i oceniane oddzielnie.

Protokół

1. Izolacja MSC szczura

Mezenchymalne komórki macierzyste wyizolowano od samic szczurów Sprague-Dawley w wieku 6–8 tygodni zgodnie z wcześniejszym opisem ^{1, 2}. Wyizolowane MSCs wykazują zdolność do przylegania do plastikowej powierzchni i łatwo namnażają się podczas hodowli in vitro.

1. Zwierzę umieszczono w komorze anestezjologicznej i poddano narkozie przez około pięć minut. Podczas anestezji należy obserwować częstotliwość mrugania, oddech oraz aktywność motoryczną. Zwierzę należy wyjąć z komory natychmiast po ustaniu aktywności motorycznej i rzadkim mruganiu.
2. Zwierzę położono na stanowisku operacyjnym i uśmiercono poprzez zwichnięcie szyi. Odcięto kości udowe i piszczeli z kończyn tylnych, a następnie usunięto skórę i mięśnie.
3. Wypreparowane kości udowe i piszczeli umieszczono w 70% izopropanolu na kilka sekund, a następnie przeniesiono do 1X D-PBS.
4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza kości udowe i piszczeli przeniesiono do szalki 10 cm zawierającej DMEM. Każdą kość trzymano pęsetą i przecięto oba końce nożyczkami. Do strzykawki 3 ml przyłączono igłę 22G i napełniono ją DMEM, a następnie wypłukano szpik do probówki 50 ml, wprowadzając igłę w jeden z otwartych końców kości. Czynność powtórzono 2~3 razy dla każdej kości. Po uzyskaniu całego szpiku zawiesinę komórkową resuspendowano i przepuszczono przez sitko komórkowe 70μm w celu usunięcia resztek kostnych i agregatów krwi.
5. Komórki odwirowano przy 200g, 4°C przez 5 minut, a nadsącz usunięto za pomocą aspiratora. Komórki resuspendowano w 25ml pożywki MSC (DMEM zawierającej 10% FBS i 1% Pen-Strep). Po 10ml zawiesiny komórkowej wysiano do każdej z dwóch szalek hodowlanych o średnicy 10 cm. Szalki hodowlane przechowywano w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 1~2 tygodnie. Pożywkę wymieniano co 2~3 dni.

2. Wzbogacanie MSC szczura

W celu wzbogacenia populacji MSC stosowano szereg białek powierzchniowych, w tym CD54, CD90, CD73, CD105 oraz CD271 ^3-5. W naszym badaniu wykorzystaliśmy CD54 i CD90 jako markery do wzbogacenia MSC za pomocą magnetycznej separacji komórek.

1. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, odessać medium i dodać 4~5ml trypsyny-EDTA do każdej płytki. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora i inkubować przez około 5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek. Po odłączeniu komórek dodać taką samą ilość medium hodowlanego, aby zneutralizować trypsynę. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki 15ml i odwirować komórki przy 200g, 4°C przez 5 minut.
2. Kolejne kroki opisują sposób wzbogacania MSC za pomocą dwóch markerów powierzchniowych CD54 i CD90 zgodnie z instrukcją separacji komórek przy użyciu BD IMagnet. Osad komórkowy resuspendowano w buforze do barwienia komórek (3% inaktywowane termicznie FBS w 1X D-PBS) w stężeniu 20 milionów komórek/ml. Dodano biotynulowane przeciwciało CD54 (0,25μg na milion komórek) oraz biotynulowane przeciwciało CD90 (0,15μg na milion komórek) i delikatnie wymieszano z zawiesiną komórkową. Po inkubacji na lodzie przez 15 minut oznakowane komórki przemyto nadmiarową objętością buforu 1X BD IMag. Oznakowane komórki odwirowano przy 200g, 4°C przez 5 minut.
3. Dokładnie wymieszać w wirówce (vortex) cząsteczki streptawidyny BD IMag, dodać 40μl cząsteczek na każde 10 milionów komórek. Dokładnie wymieszać cząsteczki z oznakowanymi komórkami i inkubować komórki w temperaturze 6~12°C przez 30 minut. Pozwala to cząsteczkom streptawidyny związać się z biotynulowanymi przeciwciałami anty-CD54 i anty-CD90, które są odpowiednio związane z białkami powierzchniowymi CD54 i CD90.
4. W czasie inkubacji opisać probówkę z okrągłym dnem do zbierania frakcji pozytywnej. Po inkubacji doprowadzić objętość oznakowania do 20 milionów komórek/ml za pomocą buforu 1X BD IMag i przenieść oznakowane komórki do probówki do zbierania frakcji pozytywnej. Umieścić probówkę z frakcją pozytywną na BD IMagnet i pozostawić na 6 minut, a następnie usunąć nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura, podczas gdy probówka z frakcją pozytywną wciąż znajduje się na BD IMagnet.
5. Zdjąć probówkę z frakcją pozytywną z BD IMagnet i umieścić ją na lodzie. Dodać 1ml schłodzonego do temperatury lodowej buforu 1X BD IMag i resuspendować komórki poprzez delikatne mieszanie. Umieścić probówkę z powrotem na BD IMagnet i pozostawić na 2~4 minuty. Usunąć nadsącz nową szklaną pipetą Pasteura. Powtórzyć przemywanie zgodnie z opisem w punkcie 2.5 jeszcze jeden raz.
6. Zdjąć probówkę z BD IMagnet i resuspendować komórki w medium hodowlanym, wysiać do jednej kolby 75cm² w celu utrzymania komórek oraz do płytki 10cm do cytometrii przepływowej.

3. Weryfikacja ekspresji markerów powierzchniowych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeprowadzono analizę cytometryczną w celu potwierdzenia, że uzyskane komórki wykazują ekspresję CD54 i CD90. Marker HSC CD45 wykorzystano do potwierdzenia, że MSC są pozbawione HSC.

1. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie ~80%, przeprowadzić trypsynizację za pomocą trypsyny-EDTA i zebrać komórki do probówki 15ml. Wirować przy 200g w temperaturze 4°C przez 5 minut w celu zebrania komórek.
2. Odessać supernatant i raz przemyć komórki 1X D-PBS. Resuspendować komórki w buforze do barwienia komórek (1X D-PBS zawierający 2% FBS i 0,05% azotku sodu) do końcowego stężenia 5~10 milionów komórek/ml i przechowywać komórki w lodzie. Odmierzyć 100μl zawiesiny komórkowej do sześciu oznakowanych probówek (1. same komórki; 2. kontrola izotypowa IgG2a; 3. kontrola izotypowa IgG1; 4. CD45; 5. CD54; 6. CD90).
3. Dodać kontrole izotypowe i przeciwciała pierwotne w odpowiednich stężeniach (IgG2a i IgG1: 20μl na milion komórek; CD45: 0,5μg na milion komórek; CD54: 0,25μg na milion komórek; CD90: 0,15μg na milion komórek) i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut.
4. Przemyć komórki dwukrotnie 1X D-PBS, a następnie resuspendować komórki w 100μl bufora do barwienia komórek. Dodać SA-PE (streptawidyna-fikoeCerytryna, stosować 0,15μg na milion komórek) i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut w ciemności.
5. Przemyć znakowane komórki dwukrotnie 1X D-PBS. Resuspendować komórki w 400μl bufora do barwienia komórek i przenieść do probówki typu Falcon do analizy cytometrii przepływowej.

4. Separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

MSC stanowią heterogenną populację składającą się z różnych subpopulacji o odmiennych kształtach komórek, tempach wzrostu oraz zdolnościach do różnicowania ⁶. Jednakże wszystkie subpopulacje wykazują ekspresję znanych markerów MSC, przez co nie jest możliwe wykorzystanie markerów do wyodrębnienia tych subpopulacji. W związku z tym zastosowaliśmy cylindry do klonowania w celu wyodrębnienia poszczególnych subpopulacji, które stanowią kolonie utworzone z pojedynczych komórek.

1. Wysiać komórki w gęstości około 50~100 komórek na szalkę 10 cm. Inkubować w inkubatorze przy 37°C i 5% CO₂ przez 1~2 tygodnie. W tym okresie badać dobrze odizolowane kolonie za pomocą mikroskopu odwróconego. Gdy kolonie osiągną odpowiednio duży rozmiar (najlepiej powyżej 100 komórek w każdej kolonii), zaznaczyć je markerem na dnie szalki. Wybierając kolonię do zaznaczenia, należy upewnić się, że w jej pobliżu nie znajdują się inne kolonie.
2. Odessać medium i raz przemyć szalkę 1X D-PBS. Za pomocą sterylnej pęsety pobrać sterylny cylinder do klonowania i ostrożnie umieścić go wokół zaznaczonej kolonii. Powtarzać czynność, aż nad każdą z zaznaczonych kolonii zostanie umieszczony cylinder. Wybrane kolonie powinny być od siebie oddalone tak, aby każdy cylinder zawierał tylko jedną kolonię.
3. Dodać 100μl trypsyny-EDTA do każdego cylindra do klonowania i umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze na około 5 minut. Po 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki przyjmują zaokrąglony kształt. Po odlepieniu się komórek dodać taką samą ilość medium hodowlanego w celu inaktywacji trypsyny. Pomieszać zawiesinę komórkową za pomocą mikropipety 200μl i przenieść ją do szalki 60 mm zawierającej 3ml uprzednio ogrzanego medium hodowlanego. Odpowiednio oznakować szalki i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Monitorować zmiany morfologiczne w ciągu kolejnych kilku dni.

5. Reprezentatywne wyniki

Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji dotyczącej izolacji MSC szczura, plastikowo przylegające MSC powinny być widoczne następnego dnia po wysianiu. W miarę proliferacji komórek, komórki konfluencyjne powinny wyglądać tak, jak komórki przedstawione na Rysunku 1A. Gdy komórki osiągną ~80% konfluencji (Rysunek 1B), można przystąpić do subkultywacji. Podczas subkultywacji do odklejenia komórek zastosowano trypsynę z EDTA; odklejone komórki są małe i okrągłe, co pokazano na Rysunku 1C.

Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym MSC szczura. (A) Konfluencyjne MSC. Większość komórek ma kształt wrzecionowaty lub gwiaździsty. (B) MSC przy konfluencji około 80%. (C) Komórki oderwane po trypsynizacji są małe i okrągłe.

Po wzbogaceniu MSC za pomocą magnetycznego sortowania komórek, przeprowadza się analizę cytometryczną w celu weryfikacji ekspresji markerów powierzchniowych. W przypadku prawidłowego wzbogacenia komórki powinny wykazywać pozytywne barwienie dla markerów MSC CD54 i CD90, natomiast negatywne dla markera HSC CD45 (Rysunek 2). Kontrole izotypowe IgG2a i IgG1 służą jako kontrole negatywne.

Rycina 2. Analiza cytometryczna MSC pod kątem markerów powierzchniowych. MSC oznakowano przeciwciałami przeciwko IgG2a (kontrola izotypowa 1), IgG1 (kontrola izotypowa 2), CD45, CD54 oraz CD90. MSC wykazaly ekspresję CD54 i CD90, ale nie CD45.

Gdy komórki zostaną wysiane z odpowiednią gęstością klonalną, z pojedynczych komórek powinny wyrosnąć kolonie. Rycina 3A przedstawia kolonię powstałą z jednej komórki. Do oddzielenia kolonii można następnie zastosować cylindry do klonowania, a komórki pochodzące z tych kolonii można hodować oddzielnie. Ryciny 3B i 3C przedstawiają komórki pochodzące z dwóch oddzielnych kolonii. Komórki pochodzące z kolonii 1 mają kształt wrzecionowaty (Rycina 3B), natomiast komórki pochodzące z kolonii 2 są okrągłe (Rycina 3C).

Rysunek 3. Tworzenie kolonii przez MSC i komórki pochodzące z pojedynczych kolonii. MSC hodowane w gęstości klonalnej tworzą pojedyncze kolonie. Kolonie te można oddzielić za pomocą cylindrów do klonowania, a komórki z różnych kolonii można hodować osobno. (A) Reprezentatywna kolonia utworzona przez MSC po wysianiu w gęstości klonalnej. (B) Komórki wrzecionowate pochodzące z jednej kolonii. (C) Komórki okrągłe pochodzące z innej kolonii.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i namnażania MSC. Uwzględniono w nim również metodę oddzielania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Istnieje kilka kroków kluczowych dla pomyślnej izolacji, namnażania i separacji kolonii. Podczas izolacji komórek od szczura zaleca się filtrowanie przez sitko komórkowe lub sterylną siatkę nylonową o podobnych oczkach w celu usunięcia skrzepów krwi i fragmentów kości. Po wysianiu komórek i inkubacji przez noc w medium będzie unosić się wiele martwych komórek; ich usunięc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X D-PBS	Invitrogen	14040-133
DMEM	Invitrogen	11885-084
Sito do oddzielania komórek	BD Biosciences	352350
pł Tks (płytkowa surowica bydlęca)	Invitrogen	26140-079
Pen-Strep	Invitrogen	15140
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
Biotynowana mysia IgG2a	BD Biosciences	555572
biotynilowana mysia IgG1	BD Biosciences	555747
Biotynilowane przeciwciało anty-CD54 szczura	Cedarlane Labs	CL054B
Biotynilowane przeciwciało anty-CD90 szczura	Cedarlane Labs	CL005B
Biotynilowane przeciwciało anty-CD45 szczura	Cedarlane Labs	CL001B
bufor BD Imag	BD Biosciences	552362
Probówka z okrągłym dnem	BD Biosciences	352063
Cząsteczki streptawidyny	BD Biosciences	557812
SA-PE	R&R&D Systems	F0040
cylinder do klonowania	Sigma-Aldrich	C2059