Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Podsumowanie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Streszczenie

MSC to populacja dorosłych komórek macierzystych, która stanowi obiecujące źródło w zastosowaniach terapeutycznych. Komórki te można wyizolować ze szpiku kostnego i łatwo oddzielić od hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) dzięki ich zdolności do przylegania do tworzywa sztucznego. Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji MSC z kości udowych i piszczeli szczura. Wyizolowane komórki zostały następnie wzbogacone pod kątem dwóch markerów powierzchniowych MSC, CD54 i CD90, za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych CD54 i CD90 potwierdzono następnie analizą cytometrii przepływowej. Włączono również marker HSC CD45, aby sprawdzić, czy z posortowanych MSC usunięto komórki HSC. MSC są naturalnie dość heterogeniczne. Istnieją subpopulacje komórek o różnych kształtach, zdolnościach do proliferacji i różnicowania. Wszystkie te subpopulacje wykazują ekspresję znanych markerów MSC i nie zidentyfikowano dotąd żadnego unikalnego markera dla poszczególnych subpopulacji. Dlatego alternatywnym podejściem do wydzielenia różnych subpopulacji jest zastosowanie cylindrów klonujących w celu odseparowania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Komórki pochodzące z pojedynczych kolonii mogą być następnie hodowane i oceniane oddzielnie.

Protokół

1. Izolacja MSC szczura

Mezenchymalne komórki macierzyste wyizolowano od samic szczurów Sprague-Dawley w wieku 6-8 tygodni zgodnie z wcześniejszym opisem ^{1, 2}. Wyizolowane MSC potrafią przylegać do plastikowej powierzchni i łatwo namnażać się podczas hodowli in vitro.

1. Zwierzę umieszczono w komorze anestezjologicznej i znieczulono przez około pięć minut. Podczas znieczulenia należy obserwować częstotliwość mrugania, oddychania oraz aktywność motoryczną. Zwierzę należy wyjąć z komory natychmiast po ustaniu aktywności motorycznej i rzadkim mruganiu.
2. Położyć zwierzę na stanowisku operacyjnym i uśmiercić je poprzez zwichnięcie szyi. Odciąć kości udowe i piszczelowe z kończyn tylnych, a następnie usunąć skórę i mięśnie.
3. Wypreparowane kości udowe i piszczelowe umieścić w 70% izopropanolu na kilka sekund, a następnie przenieść do 1X D-PBS.
4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza kości udowe i piszczelowe przeniesiono do szalki 10 cm zawierającej DMEM. Każdą kość przytrzymywano pęsetą, a oba jej końce przecięto nożyczkami. Do strzykawki 3 ml przymocowano igłę 22G i napełniono ją DMEM, a następnie wypłukano szpik do probówki 50 ml, wprowadzając igłę do jednego z otwartych końców kości. Procedurę powtórzono 2~3 razy dla każdej kości. Po uzyskaniu całego szpiku komórki resuspendowano i przepuszczono zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 70 μm, aby usunąć fragmenty kostne i agregaty krwi.
5. Komórki odwirowano przy 200g, 4°C przez 5 minut i usunięto nadsącz za pomocą aspiratora. Komórki resuspendowano w 25 ml pożywki MSC (DMEM zawierającej 10% FBS i 1% Pen-Strep). 10 ml zawiesiny komórkowej wysiano do każdej z dwóch szalek hodowlanych 10 cm. Szalki hodowlane inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 1~2 tygodnie. Pożywkę wymieniano co 2~3 dni.

2. Wzbogacanie MSC szczura

Do wzbogacania populacji MSC wykorzystano szereg białek powierzchniowych, w tym CD54, CD90, CD73, CD105 oraz CD271 ^3-5. W naszym badaniu zastosowano CD54 i CD90 jako markery do wzbogacania MSC za pomocą magnetycznej separacji komórek.

1. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, odessać medium i dodać 4~5 ml trypsyny-EDTA do każdej płytki. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i inkubować przez około 5 minut, aby umożliwić odlepienie komórek. Po odlepieniu komórek dodać równą ilość medium hodowlanego, aby dezaktywować trypsynę. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki 15 ml i odwirować komórki przy 200g w temperaturze 4°C przez 5 minut.
2. Kolejne kroki opisują sposób wzbogacania MSCs za pomocą dwóch markerów powierzchniowych CD54 i CD90 zgodnie z instrukcją separacji komórek przy użyciu BD IMagnet. Osad komórkowy resuspendowano w buforze do barwienia komórek (3% nieaktywowanej termicznie FBS w 1X D-PBS) do stężenia 20 milionów komórek/ml. Dodano biotynilowane przeciwciało CD54 (0,25μg na milion komórek) oraz biotynilowane przeciwciało CD90 (0,15μg na milion komórek) i delikatnie wymieszano z zawiesiną komórkową. Po 15-minutowej inkubacji na lodzie komórki znakowane przemyto nadmiarem buforu 1X BD IMag. Znakowane komórki odwirowano przy 200g w temperaturze 4°C przez 5 minut.
3. Dokładnie wymieszać na wortexie cząsteczki streptawidyny BD IMag; dodać 40μl cząsteczek na każde 10 milionów komórek. Dokładnie wymieszać cząsteczki z znakowanymi komórkami i inkubować komórki w temperaturze 6~12°C przez 30 minut. Pozwala to cząsteczkom streptawidyny związać się z biotynilowanymi przeciwciałami anty-CD54 i anty-CD90, które są odpowiednio związane z białkami powierzchniowymi CD54 i CD90.
4. Podczas inkubacji opisać probówkę z rundowanym dnem do zbierania frakcji pozytywnej. Po inkubacji uzupełnić objętość znakowanych komórek do stężenia 20 milionów komórek/ml za pomocą buforu 1X BD IMag i przenieść znakowane komórki do probówki przeznaczonej do zbierania frakcji pozytywnej. Umieścić probówkę z frakcją pozytywną na BD IMagnet i pozostawić na 6 minut, a następnie usunąć nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura, podczas gdy probówka z frakcją pozytywną wciąż znajduje się na BD IMagnet.
5. Zdjąć probówkę z frakcją pozytywną z BD IMagnet i umieścić ją na lodzie. Dodać 1 ml lodowatego buforu 1X BD IMag i resuspendować komórki poprzez delikatne mieszanie. Umieścić probówkę z powrotem na BD IMagnet i pozostawić na 2~4 minuty. Usunąć nadsącz nową szklaną pipetą Pasteura. Powtórzyć przemywanie opisane w punkcie 2.5 jeszcze raz.
6. Zdjąć probówkę z BD IMagnet i resuspendować komórki w medium hodowlanym; zasiać jedną kolbę 75cm² do utrzymania komórek oraz płytkę 10cm do cytometrii przepływowej.

3. Weryfikacja ekspresji markerów powierzchniowych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeprowadzono analizę cytometryczną w celu zweryfikowania, czy uzyskane komórki wykazują ekspresję CD54 oraz CD90. Marker HSC CD45 został wykorzystany do potwierdzenia, że MSC są pozbawione HSC.

1. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, poddać je trypsynizacji za pomocą trypsyny z EDTA i zebrać do probówki o pojemności 15ml. Wirować przy 200g w temperaturze 4°C przez 5 minut w celu zebrania komórek.
2. Odessać supernatant i jednokrotnie wypłukać komórki za pomocą 1X D-PBS. Resuspendować komórki w buforze do barwienia komórek (1X D-PBS zawierający 2% FBS i 0,05% azotku sodu) do końcowego stężenia 5~10 milionów komórek/ml i przechowywać komórki w lodzie. Odmierzyć alikwoty 100μl zawiesiny komórkowej do sześciu oznakowanych probówek (1. same komórki; 2. kontrola izotypowa IgG2a; 3. kontrola izotypowa IgG1; 4. CD45; 5. CD54; 6. CD90).
3. Dodać kontrole izotypowe i przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich stężeniach (IgG2a i IgG1: 20μl na milion komórek; CD45: 0,5μg na milion komórek; CD54: 0,25μg na milion komórek; CD90: 0,15μg na milion komórek) i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut.
4. Dwukrotnie wypłukać komórki za pomocą 1X D-PBS, a następnie resuspendować komórki w 100μl bufora do barwienia komórek. Dodać SA-PE (streptawidyna-fikocyjanina, użyć 0,15μg na milion komórek) i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut w ciemności.
5. Dwukrotnie wypłukać oznakowane komórki za pomocą 1X D-PBS. Resuspendować komórki w 400μl bufora do barwienia komórek i przenieść do probówki typu falcon do analizy cytometrycznej.

4. Separacja MSC wywodzących się z pojedynczych kolonii

MSC to heterogenna populacja składająca się z różnych subpopulacji o odmiennym kształcie komórek, tempie wzrostu oraz zdolności do różnicowania ⁶. Jednak wszystkie subpopulacje wykazują ekspresję znanych markerów MSC, w związku z czym nie jest możliwe wykorzystanie markerów do wyizolowania tych subpopulacji. Zastosowaliśmy zatem cylindry do klonowania w celu odseparowania poszczególnych subpopulacji, które stanowią kolonie powstałe z pojedynczych komórek.

1. Wysiać komórki w zagęszczeniu około 50~100 komórek na szalkę 10cm. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 1~2 tygodnie. W tym okresie badać dobrze odizolowane kolonie za pomocą mikroskopu odwróconego. Po osiągnięciu przez kolonie odpowiedniej wielkości (najlepiej powyżej 100 komórek w każdej kolonii), zaznaczyć kolonie markerem na spodzie szalki. Wybierając kolonię do zaznaczenia, należy upewnić się, że w jej bezpośrednim sąsiedztwie nie znajdują się inne kolonie.
2. Odessać pożywkę i przemyć szalkę raz roztworem 1X D-PBS. Za pomocą sterylnej pincety chwycić sterylny cylinder do klonowania i ostrożnie umieścić go wokół zaznaczonej kolonii. Powtarzać czynność, aż wszystkie zaznaczone kolonie zostaną przykryte cylindrami. Wybrane kolonie powinny być od siebie oddalone w taki sposób, aby każdy cylinder zawierał tylko jedną kolonię.
3. Dodać 100μl trypsyny-EDTA do każdego cylindra do klonowania i umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze na około 5 minut. Po 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zaokrąglają się. Po oddzieleniu się komórek dodać równą ilość pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny. Wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą mikropipety 200μl i przenieść zawiesinę do szalki 60mm zawierającej 3ml uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej. Odpowiednio opisać szalki i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Monitorować zmiany morfologiczne w ciągu kolejnych kilku dni.

5. Reprezentatywne wyniki

Zgodnie z protokołem opisanym w części dotyczącej izolacji MSC szczura, adherentne MSC przylegające do plastiku powinny być widoczne następnego dnia po wysianiu. W miarę dalszej proliferacji komórki konfluentne powinny wyglądać jak komórki przedstawione na rysunku 1A. Gdy komórki osiągną konfluencję na poziomie ~80% (rysunek 1B), można przystąpić do subkultury. Podczas subkultury do odrywania komórek zastosowano trypsynę-EDTA; odseparowane komórki są małe i okrągłe, co pokazano na rysunku 1C.

Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym szczurzych MSC. (A) Konfluencyjne MSC. Większość komórek ma kształt wrzecionowaty lub gwieździsty. (B) MSC przy konfluencji około 80%. (C) Ododerwane komórki po trypsynizacji są małe i okrągłe.

Po wzbogaceniu MSC za pomocą magnetycznego sortowania komórek, przeprowadzana jest analiza cytometryczna w celu weryfikacji ekspresji markerów powierzchniowych. Przy prawidłowym wzbogaceniu komórki powinny wykazywać pozytywne barwienie w odniesieniu do markerów MSC CD54 i CD90, ale negatywne w odniesieniu do markera HSC CD45 (Rysunek 2). Kontrole izotypowe IgG2a i IgG1 służą jako kontrole negatywne.

Rysunek 2. Analiza cytometryczna MSC pod kątem markerów powierzchniowych. MSC znakowano przeciwciałami przeciwko IgG2a (kontrola izotypowa 1), IgG1 (kontrola izotypowa 2), CD45, CD54 i CD90.  MSC wykazywały ekspresję CD54 i CD90, ale nie CD45.

Gdy komórki zostaną wysiane z odpowiednią gęstością klonalną, kolonie powinny powstać z pojedynczych komórek. Rycina 3A przedstawia kolonię powstałą z jednej komórki. Następnie można użyć cylindrów do klonowania, aby oddzielić kolonie, a komórki pochodne z tych kolonii można hodować osobno. Ryciny 3B i 3C przedstawiają komórki pochodne z dwóch poszczególnych kolonii. Komórki pochodne z kolonii 1 mają kształt wrzecionowaty (Rycina 3B), natomiast komórki pochodne z kolonii 2 są okrągłe (Rycina 3C).

Rysunek 3. Tworzenie kolonii przez MSC i komórki pochodzące z pojedynczych kolonii. MSC hodowane w zagęszczeniu klonalnym tworzą poszczególne kolonie. Kolonie te można oddzielić za pomocą cylindrów do klonowania, a komórki z różnych kolonii można hodować osobno. (A) Reprezentatywna kolonia utworzona przez MSC po wysianiu w zagęszczeniu klonalnym. (B) Komórki wrzecionowate pochodzące z jednej kolonii. (C) Komórki okrągłe pochodzące z innej kolonii.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i namnażania MSC. Uwzględniono w nim również metodę oddzielania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Istnieje kilka kroków kluczowych dla pomyślnej izolacji, namnażania i separacji kolonii. Podczas izolacji komórek od szczura zaleca się filtrowanie przez sitko komórkowe lub sterylną siatkę nylonową o podobnych oczkach w celu usunięcia skrzepów krwi i fragmentów kości. Po wysianiu komórek i inkubacji przez noc w medium będzie unosić się wiele martwych komórek; ich usunięc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X D-PBS	Invitrogen	14040-133
DMEM	Invitrogen	11885-084
Sito do oddzielania komórek	BD Biosciences	352350
pł Tks (płytkowa surowica bydlęca)	Invitrogen	26140-079
Pen-Strep	Invitrogen	15140
Trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
Biotynowana mysia IgG2a	BD Biosciences	555572
biotynilowana mysia IgG1	BD Biosciences	555747
Biotynilowane przeciwciało anty-CD54 szczura	Cedarlane Labs	CL054B
Biotynilowane przeciwciało anty-CD90 szczura	Cedarlane Labs	CL005B
Biotynilowane przeciwciało anty-CD45 szczura	Cedarlane Labs	CL001B
bufor BD Imag	BD Biosciences	552362
Probówka z okrągłym dnem	BD Biosciences	352063
Cząsteczki streptawidyny	BD Biosciences	557812
SA-PE	R&R&D Systems	F0040
cylinder do klonowania	Sigma-Aldrich	C2059