Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Podsumowanie

Protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży metylotroficznych Pichia pastoris. Przeprowadzono również przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, transformację wektora z genem zainteresowania do P. pastoris oraz oczyszczanie DNA drożdży. Ostatnie etapy tego protokołu ekspresji białek stanowią analiza Western blot oraz oczyszczanie białek.

Streszczenie

Ekspresja białek w mikrobowym eukariotycznym gospodarzu Pichia pastoris umożliwia uzyskanie dużych ilości białka rekombinowanego w szybkim i łatwym w użyciu systemie ekspresyjnym.

Jako jednokomórkowy mikroorganizm P. pastoris jest łatwy w manipulacji i szybko rośnie na tanich pożywkach, osiągając wysoką gęstość komórek. Będąc organizmem eukariotycznym, P. pastoris jest zdolny do przeprowadzania wielu modyfikacji potranslacyjnych typowych dla komórek wyższych eukariotów, a otrzymane białka rekombinowane podlegają fałdowaniu białek, przetwarzaniu proteolitycznemu, tworzeniu mostków dwusiarczkowych oraz glikozylacji [1].

Jako drożdże metylotroficzne P. pastoris są zdolne do metabolizowania metanolu jako jedynego źródła węgla. Silny promotor oksydazy alkoholowej, AOX1, jest ściśle regulowany i indukowany przez metanol, a wykorzystuje się go do ekspresji genu docelowego. W związku z tym ekspresję obcego białka można indukować poprzez dodanie metanolu do pożywki wzrostowej [2; 3].

Kolejną istotną zaletą jest sekrecja białka rekombinowanego do pożywki hodowlanej, z wykorzystaniem sekwencji sygnałowej w celu skierowania obcego białka do szlaku sekrecyjnego P. pastoris. Dzięki temu, że drożdże wydzielają do pożywki jedynie niewielkie ilości białek endogennych, a do pożywki nie dodawano żadnych białek, białko heterologiczne stanowi większość całkowitej ilości białka w pożywce, co ułatwia kolejne etapy oczyszczania białka [3; 4].

Wektor użyty w tej procedurze (pPICZαA) zawiera promotor AOX1 umożliwiający ściśle regulowaną, indukowaną metanolem ekspresję genu zainteresowania; sygnał sekrecyjny czynnika α służący do sekrecji białka rekombinowanego, gen oporności na Zeocyn do selekcji zarówno w E. coli, jak i Pichia oraz peptyd C-końcowy zawierający epitop c-myc i znacznik polihistydynowy (6xHis) do detekcji i oczyszczania białka rekombinowanego. Przedstawiamy również analizę western blot białka rekombinowanego z użyciem specyficznego przeciwciała Anti-myc-HRP rozpoznającego epitop c-myc w wektorze macierzystym.

Protokół

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotroficznym drożdżu Pichia pastoris

Przed rozpoczęciem tego protokołu gen zainteresowania powinien zostać sklonowany w odpowiedniej ramce odczytu w wektorze rodzicielskim P. pastoris, a jego sekwencja powinna zostać zweryfikowana w celu potwierdzenia prawidłowej insercji genu zainteresowania do wektora.

Krok I: Generowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, linearyzacja konstruktu i transformacja do P. pastoris

Do tego etapu będą Państwo potrzebować następujących pożywek i płytek:

• płytki YPDS
• 600 mL pożywki YPD
• lodowata sterylna woda
• 1 M sorbitolu
• urządzenie do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4
• jednostka do filtrowania odśrodkowego Microcon YM-30
• kuweta do elektroporacji 0,2 cm
• sterylna szklana probówka 15 mL
• sterylna szklana pipeta Pasteura
• płytki YPDS zawierające Zeocin

Część 1: Przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdżowych

1. Na cztery dni przed planowaną transformacją wykonaj posiew smugowy komórek P. pastoris na płytce YPDS bez Zeocinu i inkubuj je w temperaturze 30°C przez 1-2 dni lub do czasu powstania pojedynczych kolonii.
2. Na dwa dni przed planowaną transformacją wyhoduj 5 ml szczepu P. pastoris w podłożu YPD w probówce Falcon o pojemności 50 ml w temperaturze 30°C przez noc. Umieść probówkę Falcon w kolbie, aby ustabilizować ją w wytrząsarce.
3. Dzień przed transformacją zaszczep 500 mL świeżego podłoża YPD w kolbie o pojemności 2 litrów, dodając 0,25 mL kultury nocnej, i inkubuj ponownie przez noc w wytrząsarce w temperaturze 30°C do uzyskania OD₆₀₀ = 1,3-1,5.
   Uwaga: przed pomiarem na spektrofotometrze rozcieńcz próbkę, aby uzyskać dokładny wynik.
4. W dniu transformacji przygotuj lodowatą sterylną wodę oraz 1 M sorbitol. Odwiruj komórki przy 1500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Resuspenduj osad w 500 mL lodowatej, sterylnej wody.
5. Ponownie odwiruj komórki zgodnie z krokiem 4. Resuspenduj osad w 250 mL lodowatej, sterylnej wody.
6. Ponownie odwiruj komórki zgodnie z krokiem 4. Resuspenduj osad w 20 mL lodowatego 1 M sorbitolu.
7. Ponownie odwiruj komórki zgodnie z krokiem 4. Resuspenduj osad w 1 mL lodowatego 1 M sorbitolu do uzyskania końcowej objętości ok. 1,5 mL. Przechowuj komórki na lodzie lub w temperaturze 4°C do momentu użycia.
   Uwaga: przygotowujemy więcej komórek elektrokompetentnych niż jest wymagane i przechowujemy je w aliquotach po 80 μl w probówkach do mikrocentryfugi w temperaturze -80 °C. Przechowywanych komórek używamy nie dłużej niż przez jeden miesiąc.

Część 2: Linearyzacja i zagęszczanie konstruktu pPICZαA

W celu transformacji należy zlinearyzować wektor zawierający geny zainteresowania poprzez trawienie restrykcyjne. W tej procedurze stosujemy enzym PmeI, choć możliwe jest użycie innych miejsc restrykcyjnych. Należy upewnić się, że wstawka nie zawiera miejsca restrykcyjnego wykorzystywanego do linearyzacji wektora. Do transformacji P. pastoris wymagane jest 5-20 μg zlinearyzowanego DNA w 5-10 μl sterylnej wody.

Należy również zlinearyzować, skoncentrować i wprowadzić pusty wektor (bez wkładki) do P. pastoris. Wektor macierzysty bez wkładki służy jako kontrola dla tła ekspresji wewnątrzkomórkowej i pozwala na interpretację wyników ekspresji.

1. Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, połączyć następujące składniki i krótko odwirować probówkę, aby cały płyn znalazł się na dnie, stuknąć probówką i ponownie odwirować:
   • x μl sterylnej wody
   • 5,0 μl 10X NEBuffer 4
   • 0,5 μl 100X BSA
   • do 2 μg DNA wektora (~ 100 ng/μl)
   • 2,0 μl mieszaniny enzymu PmeI
   → 50 μl całkowitej objętości reakcji
   Uwaga: aby uzyskać wystarczającą ilość zlinearyzowanego DNA wektora, przygotować powyższą mieszaninę 3 lub 4 razy w oddzielnych probówkach i połączyć roztwory podczas zagęszczania trawionego DNA za pomocą urządzenia odśrodkowego Amicon Ultra.
2. Inkubować w temperaturze 37°C przez 3 godziny, a następnie inaktywować termicznie mieszaninę enzymatyczną w temperaturze 65°C przez 20 minut.
3. W międzyczasie wstępnie wypłukać urządzenie do filtracji odśrodkowej Amicon Ultra-4 za pomocą 1 mL wody Milli-Q  , wirować probówkę przy 4000 x g przez 6-8 minut i usunąć filtrat.
   Uwaga: po namoczeniu nie dopuścić do wyschnięcia membrany. Jeśli urządzenie nie jest używane bezpośrednio po wstępnym płukaniu, pozostawić wodę na membranie aż do momentu użycia urządzenia.
4. Przenieść inaktywowany termicznie roztwór z kroku 2 do wstępnie wypłukanej jednostki filtrującej Amicon, wirować probówkę przy 4000 x g przez 6-8 minut i usunąć filtrat.
   Uwaga: jeśli przygotowano więcej niż jedną mieszaninę do linearyzacji, połączyć wszystkie roztwory w jednej jednostce filtrującej Amicon.
5. Wirować do momentu, aż objętość roztworu na filtrze Amicon zostanie zredukowana do około 100 ~ 150 μl. Do pustej probówki dodać od góry kolejne 1,5 mL sterylnej wody, przenieść roztwór do probówki Amicon i powtórzyć etap wirowania. Przemyć drugi raz 1,5 mL sterylnej wody i ponownie usunąć filtrat. Zredukować objętość końcową do ~ 150 μl. Etapy płukania usuwają pozostałe sole z buforu, aby zapobiec powstawaniu łuku elektrycznego podczas elektroporacji komórek.
   Uwaga: w etapie wirowania stosujemy rotor z koszyczkami wahadłowymi; zamkniętą jednostkę filtrującą Amicon należy po prostu umieścić w probówce Falcon 50 mL, aby utrzymać ją w stabilnej pozycji podczas wirowania. Urządzenia filtrujące Amicon zatrzymują 50 μl roztworu na filtrze nawet po przedłużonym wirowaniu.
6. W celu dalszego zagęszczenia preparatu DNA przenieść pozostały roztwór DNA z urządzenia filtrującego Amicon do wstępnie wypłukanej jednostki filtrującej Microcon YM-30 i wypłukać probówkę Amicon dodatkowymi 50 μl sterylnej wody, aby odzyskać całe DNA. Wirować jednostkę filtrującą Microcon w mikrowirówce przy 10 000 x g, aż filtr będzie wciąż lekko pokryty cieczą. Wirować tylko przez krótki czas i co minutę sprawdzać, czy na filtrze pozostała tylko niewielka ilość cieczy. Aby odzyskać roztwór DNA, umieścić filtr odwróconym do góry w nowej probówce do mikrowirówki i wirować w drugim etapie przy 1000 x g przez 3 minuty. Objętość końcowa nie powinna przekraczać łącznie 10-15 μl, w przeciwnym razie DNA może być zbyt rozcieńczone dla etapu transformacji.
   Uwaga: nie wirować urządzenia filtrującego zbyt długo i nie dopuścić do jego całkowitego wyschnięcia, aby zapobiec potencjalnej utracie próbki. Jeśli membrana wyschnie, dodać na nią 10-15 μl sterylnej wody, delikatnie mieszać przez 30 sekund i odzyskać DNA w opisany wyżej sposób.

Część 3: Transformacja P. pastoris metodą elektroporacji

1. Zlinearyzowany i skoncentrowany pPICZαA DNA zawierający insert jest teraz gotowy do transformacji do elektrokompetentnych komórek P. pastoris (patrz krok I, część 2). Około 15 minut przed transformacją należy przygotować następujące odczynniki i urządzenia: napełnić probówkę do mikrocentryfugi 1 mL 1 M sorbitolu i umieścić ją w lodzie; umieścić kuwetę do elektroporacji 0,2 cm w lodzie; oznakować sterylną szklaną probówkę 15 mL oraz przygotować sterylną szklaną pipetę Pasteura.
2. Przenieść 80 μl komórek z kroku I, części 2.7 do schłodzonej w lodzie kuwety do elektroporacji 0,2 cm. Dodać skoncentrowany roztwór zlinearyzowanego pPICZαA DNA z kroku I, części 3.6 i wymieszać, przesuwając końcówkę pipety z boku na bok w kuwecie do elektroporacji.
   Uwaga: podczas dodawania DNA należy nacisnąć pipetę tylko do pierwszego stopnia. Po wymieszaniu DNA z komórkami należy nacisnąć pipetę do drugiego stopnia i powoli wyjąć ją z kuwety.
3. Inkubować kuwetę z komórkami w lodzie przez 5 minut.
4. Wytrzeć zewnętrzną stronę kuwety chusteczką i poddać komórki impulsowi zgodnie z parametrami dla drożdży (Saccharomyces cerevisiae) sugerowanymi przez producenta konkretnego urządzenia do elektroporacji.
   Uwaga: stosujemy Bio-Rad GenePulser z następującymi warunkami:
   • Napięcie ładowania (V): 1500;
   • Pojemność (μF): 25;
   • Opór (Ω): 200.
   Przy użyciu kuwety do elektroporacji 0,2 cm protokół generuje impuls o długości ~10 ms z natężeniem pola ~7500 V/cm.
5. Natychmiast dodać do kuwety 1 mL schłodzonego w lodzie 1 M sorbitolu. Przenieść zawartość kuwety do sterylnej probówki 15 mL za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.
6. Inkubować probówkę w temperaturze 30°C bez wytrząsania przez 1,5 godziny.
7. Dodać 5-7 sterylizowanych szklanych kulek na cztery oznakowane płytki YPDS zawierające 100 μg/mL Zeocyny. Rozsiać 250 μl mieszaniny po elektroporacji z szklanej probówki 15 mL na każdą płytkę. Potrząsać płytką w poziomie, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki. Pozostawić płytkę do wyschnięcia przez 15 minut, a następnie usunąć kuleczki z agaru poprzez odwrócenie płytki.
   Uwaga: stosujemy 100 μg/mL Zeocyny do selekcji transformantów przy użyciu szczepu Pichia GS115. Warunki selekcji mogą się różnić w przypadku stosowania innego szczepu Pichia.
8. Inkubować płytki odwrócone do góry dnem przez 2 do 3 dni w temperaturze 30°C aż do pojawienia się kolonii. Owinąć płytki czarną folią, aby zapobiec degradacji światłoczułej Zeocyny. Mniejsza ilość antybiotyku na płytkach może doprowadzić do powstania fałszywie dodatnich klonów.
9. Po uformowaniu się kolonii wybrać 12 kolonii i oczyścić je poprzez wykreślenie klonów na świeżych płytkach YPDS zawierających 100 μg/mL Zeocyny.

Krok II: Ekspresja białka w Pichia pastoris

Do tego etapu będą Państwo potrzebować następujących pożywek, płytek i odczynników:

• podłoże BMGY
• glicerol, wysterylizowany
• podłoże BMMY
• metanol, wysterylizowany
• zestaw do oczyszczania DNA drożdży EPICENTRE Yeast DNA purification kit

Niezbędne będą również następujące kolby:

• kolba 250 mL, autoklawowana
• kolba z przegrodami 1 L, autoklawowana
• zlewka 200 mL, autoklawowana

Część 1: Ekspresja białka w Pichia pastoris

Wszystkie poniższe kroki są również wykonywane dla transformowanego wektora kontrolnego (bez wstawki).

1. Wybrać pojedynczą kolonię z oczyszczonych kolonii Pichia z kroku I, część 3.9 i zaszczepić w 25 mL BMGY w sterylnej kolbie o pojemności 250 mL. Hodować w temperaturze 30°C w inkubatorze wytrząsowym (250-300 rpm), aż kultura osiągnie OD₆₀₀ = 2-6 (około 16-18 godzin).
   Uwaga: przed pomiarem na spektrofotometrze należy rozcieńczyć próbkę, aby uzyskać dokładny wynik. Komórki będą znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego.
2. Po osiągnięciu odpowiedniej wartości OD₆₀₀ przygotować stok glicerolowy. Przenieść 800 μl z 25 mL kultury komórkowej do 2 mL kriopowieczki Corning i dodać 200 μl sterylizowanego glicerolu. Zamrozić stok glicerolowy i przechowywać w temperaturze -80°C.
3. Do oczyszczania DNA drożdży przenieść 1,5 mL z 25 mL kultury komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1300 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Komórki te służą do analizy integrantów Pichia w celu potwierdzenia, czy gen zainteresowania został wbudowany w genom Pichia (patrz krok II, część 2). Przechowywać osad komórkowy w temperaturze 4°C do czasu dalszej analizy.
4. Przenieść pozostałą część kultury (25 mL) do probówki Falcon 50 mL i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant i ustawić probówki dnem do góry na chusteczce, aby usunąć pozostałości pożywki. Aby wyprać osad komórkowy, resuspender go w 20 mL BMMY, aby usunąć resztki pożywki BMGY, ponieważ glicerol z pożywki BMGY może hamować późniejszą ekspresję. Wirować ponownie przy 3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odlać supernatant.
5. Resuspender osad komórkowy w pożywce BMMY do uzyskania OD₆₀₀ = 1,0 w celu indukcji ekspresji (około 100-200 mL) i przenieść kulturę do kolby z przegrodami o pojemności 1 litra. Przykryć kolbę zlewką 200 mL i ponownie umieścić w inkubatorze, aby kontynuować wzrost w temperaturze 30°C.
   Uwaga: ważne jest, aby temperatura nie przekroczyła 30°C. Jeśli temperatura w inkubatorze ulega wahaniom, ustawić ją na 28°C. Odpowiednie napowietrzanie jest również istotnym parametrem dla efektywnej ekspresji podczas indukcji metanolem (podczas indukcji ekspresji objętość kultury nigdy nie powinna przekraczać > 10-30% całkowitej objętości kolby). Wysoce zalecamy stosowanie kolb z przegrodami, ponieważ wprowadzają one więcej tlenu do pożywki hodowlanej.
6. Dodać sterylizowany czysty metanol do stężenia końcowego 0,5% metanolu co 24 godziny w celu utrzymania indukcji.
7. W określonych punktach czasowych po rozpoczęciu ekspresji przenieść 1 mL kultury do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Wirować przy 1300 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do oddzielnej probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Przechowywać supernatant i osady komórkowe w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. Próbki z różnych punktów czasowych zostaną przeanalizowane w celu ustalenia optymalnego czasu ekspresji białka po indukcji.
   Uwaga: jako punkty czasowe do pobierania próbek wybrano 6h, 12h, 24h, 36h i 48h. Możliwy jest dalszy wzrost do 4 dni. Optymalne punkty czasowe różnią się w zależności od ekspresjonowanych białek.
8. Przeanalizować supernatanty i osady komórkowe pod kątem ekspresji białek za pomocą SDS-PAGE z barwieniem Coomassie oraz western blot (nieopisane w niniejszym protokole).

Część 2: Oczyszczanie DNA drożdży i analiza PCR integranta Pichia

Wszystkie odczynniki niezbędne do etapu oczyszczania DNA drożdży z kultury Pichia w pożywce BMGY są zawarte w zestawie MasterPure Yeast DNA Purification Kit firmy EPICENTRE.
Uwaga: analiza ta jest dodatkowa i jest przeprowadzana w celu ustalenia, czy gen zainteresowania został zintegrowany z genomem Pichia. Wykorzystuje się do tego osad komórkowy z próbki o objętości 1,5 mL pobranej z kultury w BMGY (patrz krok II, część 1.3).

Postępuj zgodnie z instrukcjami z instrukcji Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification i przeprowadź reakcję PCR z użyciem DNA drożdżowego oraz specyficznych starterów dla wstawki. Przeanalizuj 3 μl produktu PCR na żelu agarozowym zawierającym 1 μl bromku etydyny. W jednej z dołków umieść marker wielkości 1 Kb⁺, aby określić wielkość wstawki, a następnie zwizualizuj DNA za pomocą systemu dokumentacji żeli.

Białko rekombinowane można analizować za pomocą metody western blot. Oczyszczanie białka można przeprowadzić poprzez oczyszczanie za pomocą znacznika His na żywicy naładowanej metalami (nieopisane w niniejszym protokole).

Dodatek, lista przepisów

Krok I:

1. Pożywka YPD:
   Aby przygotować 600 mL pożywki YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium), należy rozpuścić 5 g ekstraktu drożdżowego i 12 g peptonu w 540 mL wody. Autoklawować przez 20 minut w cyklu dla cieczy.
   W międzyczasie przygotować 70 mL 20% dekstrozy i wysterylizować ją przez filtr przed użyciem.
   Pozostawić autoklawowany roztwór do schłodzenia do ~60°C i dodać 60 mL wysterylizowanej przez filtr 20% dekstrozy.
2. Szalki YPDS (+ Zeocin):
   Aby przygotować 500 mL agaru YPDS + Zeocin (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium with Sorbitol), należy rozpuścić 5 g ekstraktu drożdżowego, 91,1 g sorbitolu i 10 g peptonu w 450 mL wody. Dodać 10 g agaru oraz pasek magnetyczny i autoklawować przez 20 minut w cyklu dla cieczy.
   W międzyczasie przygotować 60 mL 20% dekstrozy i wysterylizować ją przez filtr przed użyciem.
   Pozostawić autoklawowany roztwór do schłodzenia do ~ 60°C, następnie dodać 50 mL wysterylizowanej przez filtr 20% dekstrozy.
   Przed dodaniem antybiotyku wylać kilka szalek w celu uzyskania podłoża YPDS bez Zeociny. Następnie dodać 500 μl Zeociny z roztworu zapasu o stężeniu 100 mg/ml, aby uzyskać stężenie końcowe 100 μg/ml Zeociny w agarze. Podczas dodawania antybiotyku mieszać na mieszadle magnetycznym, a następnie mieszać przez dodatkowe około 2 minuty do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
   Wylać pożywkę do szalek Petriego i przykryć czarną folią plastikową. Pozostawić szalki do wyschnięcia na blacie przez noc. Przechowywać szalki YPD zawierające Zeocinę w temperaturze 4°C. Okres ważności wynosi od jednego do dwóch tygodni.
   Uwaga: przykrycie folią jest konieczne, ponieważ Zeocina jest światłoczuła.

Krok II:

1. BMGY (buforowana pożywka z kompleksem glicerolu) i BMMY (buforowana pożywka z kompleksem metanolu):
   Dla każdej pożywki rozpuścić 8 g ekstraktu drożdżowego i 16 g peptonu w 560 mL wody. Autoklawować przez 20 minut w cyklu dla cieczy.
   W tym czasie przygotować następujące roztwory:
   • Bufor fosforan potasu 1 M, pH 6.0:
   Połączyć 24 mL 1M K₂HPO₄ i 156 mL 1M K₂HPO₄ i potwierdzić, że pH = 6.0 (w razie potrzeby skorygować pH za pomocą kwasu fosforowego lub KOH). Sterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze pokojowej. Okres przydatności tego roztworu wynosi ponad rok.
   • 10X YNB (13,4% Yeast Nitrogen Base z siarczanem amonu, bez aminokwasów):
   Rozpuścić 26,8 g bazy azotowej dla drożdży (YNB) z siarczanem amonu i bez aminokwasów w 200 mL wody, a następnie sterylizować przez filtr. Podgrzać roztwór, aby całkowicie rozpuścić YNB w wodzie. Przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około roku. Uwaga: alternatywnie można użyć 3,4 g YNB bez siarczanu amonu i bez aminokwasów, dodając 10 g siarczanu amonu.
   • 500X B (0,02% biotyny):
   Rozpuścić 10 mg biotyny w 50 mL wody i sterylizować przez filtr. Przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około roku.
   • 10X M (5% metanolu):
   Zmieszać 5 mL metanolu z 90 mL wody. Sterylizować przez filtr i przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około dwóch miesięcy.
   • 10X GY (10% glicerolu):
   Zmieszać 10 mL glicerolu z 90 mL wody. Sterylizować przez filtr. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Okres przydatności tego roztworu wynosi ponad rok.
   Pozostawić autoklawowany roztwór do wystygnięcia do temperatury pokojowej, następnie dodać następujące składniki i dobrze wymieszać:
   • 80 mL buforu fosforan potasu 1 M, pH 6.0;
   • 80 mL 10X YNB
   • 0,16 mL 500X B
   • 80 mL 10X GY
   W celu przygotowania BMMY dodać 80 mL 10X M zamiast glicerolu.
   Przechowywać pożywki w 4°C. Okres przydatności tych roztworów wynosi około dwóch miesięcy.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Ten obraz western blot przedstawia cztery ekspresowane białka (oznaczone jako 1605, 0537, 1228 i 1682) po 24 godzinach ekspresji. Do immunoblottingu użyto przeciwciała c-myc-HRP. Druga ścieżka (oznaczona jako N) stanowi kontrolę negatywną i została załadowana supernatantem z komórek, które nie wykazują ekspresji białka rekombinowanego, ponieważ zostały one przekształcone za pomocą wektora macierzystego (pustego).

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano ekspresję białek z wykorzystaniem metylotroficznych drożdży Pichia pastoris jako systemu gospodarza. W zależności od zastosowanego wektora klonującego białko może być wydzielane do pożywki. Sekrecja białka rekombinowanego ułatwia jego późniejsze oczyszczanie. Przedstawione jednak warunki mogą wymagać optymalizacji w przypadku ekspresji różnych białek, a zmiany w warunkach i czasie ekspresji mogą prowadzić do zwiększenia poziomu białka. Wektor użyty w tym protokole posiada epitop