Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Podsumowanie

Protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży metylotroficznych Pichia pastoris. Przeprowadzono również przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, transformację wektora z genem zainteresowania do P. pastoris oraz oczyszczanie DNA drożdży. Ostatnie etapy tego protokołu ekspresji białek stanowią analiza Western blot oraz oczyszczanie białek.

Streszczenie

Ekspresja białek w mikrobowym eukariotycznym gospodarzu Pichia pastoris umożliwia uzyskanie dużych ilości białka rekombinowanego w szybkim i łatwym w użyciu systemie ekspresyjnym.

Jako jednokomórkowy mikroorganizm P. pastoris jest łatwy w manipulacji i szybko rośnie na tanich pożywkach, osiągając wysoką gęstość komórek. Będąc organizmem eukariotycznym, P. pastoris jest zdolny do przeprowadzania wielu modyfikacji potranslacyjnych typowych dla komórek wyższych eukariotów, a otrzymane białka rekombinowane podlegają fałdowaniu białek, przetwarzaniu proteolitycznemu, tworzeniu mostków dwusiarczkowych oraz glikozylacji [1].

Jako drożdże metylotroficzne P. pastoris są zdolne do metabolizowania metanolu jako jedynego źródła węgla. Silny promotor oksydazy alkoholowej, AOX1, jest ściśle regulowany i indukowany przez metanol, a wykorzystuje się go do ekspresji genu docelowego. W związku z tym ekspresję obcego białka można indukować poprzez dodanie metanolu do pożywki wzrostowej [2; 3].

Kolejną istotną zaletą jest sekrecja białka rekombinowanego do pożywki hodowlanej, z wykorzystaniem sekwencji sygnałowej w celu skierowania obcego białka do szlaku sekrecyjnego P. pastoris. Dzięki temu, że drożdże wydzielają do pożywki jedynie niewielkie ilości białek endogennych, a do pożywki nie dodawano żadnych białek, białko heterologiczne stanowi większość całkowitej ilości białka w pożywce, co ułatwia kolejne etapy oczyszczania białka [3; 4].

Wektor użyty w tej procedurze (pPICZαA) zawiera promotor AOX1 umożliwiający ściśle regulowaną, indukowaną metanolem ekspresję genu zainteresowania; sygnał sekrecyjny czynnika α służący do sekrecji białka rekombinowanego, gen oporności na Zeocyn do selekcji zarówno w E. coli, jak i Pichia oraz peptyd C-końcowy zawierający epitop c-myc i znacznik polihistydynowy (6xHis) do detekcji i oczyszczania białka rekombinowanego. Przedstawiamy również analizę western blot białka rekombinowanego z użyciem specyficznego przeciwciała Anti-myc-HRP rozpoznającego epitop c-myc w wektorze macierzystym.

Protokół

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotroficznych drożdżach Pichia pastoris

Przed rozpoczęciem tego protokołu gen zainteresowania powinien zostać sklonowany w odpowiedniej ramce odczytu w wektorze macierzystym P. pastoris, a następnie poddany sekwencjonowaniu w celu potwierdzenia prawidłowej insercji genu w wektorze.

Krok I: Generowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, linearyzacja konstruktu i transformacja do P. pastoris

Do tego kroku będą Państwo potrzebować następujących pożywek i płytek:

• płytki YPDS
• 600 mL pożywki YPD
• lodowata sterylna woda
• 1 M sorbitol
• urządzenie do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4
• jednostka do filtrowania odśrodkowego Microcon YM-30
• kuweta do elektroporacji 0,2 cm
• sterylna szklana probówka 15 mL
• sterylna szklana pipeta Pasteura
• płytki YPDS zawierające Zeocin

Część 1: Przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży

1. Na cztery dni przed planowaną transformacją wykonaj posiew smugowy komórek P. pastoris na płytkę YPDS bez Zeocyny i inkubuj je w temperaturze 30°C przez 1-2 dni lub do momentu powstania pojedynczych kolonii.
2. Na dwa dni przed planowaną transformacją wyhoduj 5 ml szczepu P. pastoris w medium YPD w 50 ml probówce typu Falcon w temperaturze 30°C przez noc. Umieść probówkę Falcon w kolbie, aby unieruchomić ją w inkubatorze z wytrząsaniem.
3. Dzień przed transformacją zaszczep 500 mL świeżego medium YPD w kolbie o pojemności 2 litrów za pomocą 0,25 mL kultury nocnej i ponownie inkubuj przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30°C do osiągnięcia OD₆₀₀ = 1,3-1,5.
   Uwaga: przed pomiarem na spektrofotometrze rozcieńcz próbkę, aby uzyskać dokładny wynik.
4. W dniu transformacji przygotuj lodowatą sterylną wodę oraz 1 M sorbitol. Wirowarkuj komórki przy 1500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Resuspenduj osad w 500 mL lodowatej, sterylnej wody.
5. Ponownie odwirowuj komórki zgodnie z krokiem 4. Resuspenduj osad w 250 mL lodowatej, sterylnej wody.
6. Ponownie odwirowuj komórki zgodnie z krokiem 4. Resuspenduj osad w 20 mL lodowatego 1 M sorbitolu.
7. Ponownie odwirowuj komórki zgodnie z krokiem 4. Resuspenduj osad w 1 mL lodowatego 1 M sorbitolu do uzyskania objętości końcowej ~ 1,5 mL. Przechowuj komórki na lodzie lub w temperaturze 4°C do czasu dalszego użycia.
   Uwaga: przygotowujemy więcej komórek elektrokompetentnych niż jest to wymagane i przechowujemy je w aliquotach po 80 μl w probówkach do mikrocentryfugi w temperaturze -80 °C. Przechowywanych komórek używamy nie dłużej niż przez jeden miesiąc.

Część 2: Linearyzacja i zagęszczanie konstruktu pPICZαA

W celu transformacji należy zlinearyzować wektor zawierający interesujący gen za pomocą trawienia restrykcyjnego. W tej procedurze stosujemy enzym PmeI. Możliwe jest wykorzystanie innych miejsc restrykcyjnych. Należy upewnić się, że insert nie zawiera miejsca restrykcyjnego użytego do linearyzacji wektora. Do transformacji P. pastoris wymagane jest 5-20 μg zlinearyzowanego DNA w 5-10 μl sterylnej wody.

Należy również zlinearyzować, skoncentrować i wprowadzić pusty wektor (bez wstawki) do P. pastoris. Wektor macierzysty bez wstawki służy jako kontrola tła ekspresji wewnątrzkomórkowej i pozwala na interpretację wyników ekspresji.

1. Odmrozić wszystkie odczynniki na lodzie, połączyć poniższe składniki i krótko odwirować probówkę, aby zgromadzić cały płyn na dnie, opukać probówkę i ponownie odwirować:
   • x μl wody sterylnej
   • 5,0 μl 10X NEBuffer 4
   • 0,5 μl 100X BSA
   • do 2 μg wektora DNA (~ 100 ng/μl)
   • 2,0 μl mieszaniny enzymu PmeI
   → całkowita objętość reakcji 50 μl
   Uwaga: aby uzyskać wystarczającą ilość zlinearyzowanego DNA wektora, przygotować powyższą mieszaninę 3 lub 4 razy w oddzielnych probówkach i połączyć roztwory podczas zagęszczania trawionego DNA za pomocą urządzenia do wirowania Amicon Ultra.
2. Inkubować w temperaturze 37°C przez 3 godziny, a następnie przeprowadzić inaktywację termiczną mieszaniny enzymu w temperaturze 65°C przez 20 minut.
3. W międzyczasie wypłukać wstępnie urządzenie do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4 przy użyciu 1 mL wody Milli-Q, wirować probówkę przy 4000 x g przez 6–8 minut i odrzucić filtrat.
   Uwaga: nie dopuszczać do wyschnięcia membrany po jej zwilżeniu. Jeśli urządzenie nie jest używane bezpośrednio po wstępnym płukaniu, pozostawić wodę na membranie do momentu rozpoczęcia pracy.
4. Przenieść inaktywowany termicznie roztwór z etapu 2 do wstępnie wypłukanego urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon, wirować probówkę przy 4000 x g przez 6–8 minut i odrzucić filtrat.
   Uwaga: w przypadku przygotowania więcej niż jednej mieszaniny do linearyzacji, połączyć wszystkie roztwory w jednym urządzeniu do filtrowania odśrodkowego Amicon.
5. Wirować do momentu, aż objętość roztworu na filtrze Amicon zostanie zredukowana do około 100–150 μl. Dodać kolejne 1,5 mL wody sterylnej do pustej probówki zbiorczej, przenieść roztwór do probówki Amicon i powtórzyć etap wirowania. Przepłukać drugi raz 1,5 mL wody sterylnej i ponownie odrzucić filtrat. Zredukować objętość końcową do ~ 150 μl. Etapy płukania usuwają pozostałą sól z buforu, aby zapobiec przeskakiwaniu łuku elektrycznego podczas elektroporacji komórek.
   Uwaga: do etapu wirowania stosujemy wirnik z koszyczkami wahadłowymi; wystarczy umieścić zamknięte urządzenie do filtrowania odśrodkowego Amicon w probówce Falcon 50 mL, aby utrzymać je w stabilnej pozycji podczas wirowania. Urządzenia filtrujące Amicon zatrzymują 50 μl roztworu na filtrze nawet po przedłużonym wirowaniu.
6. W celu dalszego zagęszczenia preparatu DNA przenieść pozostały roztwór DNA z urządzenia filtrującego Amicon do wstępnie wypłukanego urządzenia do filtrowania odśrodkowego Microcon YM-30 i wypłukać probówkę Amicon dodatkowymi 50 μl wody sterylnej, aby odzyskać całe DNA. Wirować urządzenie do filtrowania odśrodkowego Microcon w mikrowirówce przy 10 000 x g, aż filtr będzie wciąż lekko pokryty cieczą. Wirować tylko przez krótki czas i sprawdzać co minutę, czy na filtrze pozostała jedynie niewielka ilość płynu. Aby odzyskać roztwór DNA, umieścić filtr dnem do góry w nowej probówce do mikrowirówki i wirować w drugim etapie przy 1000 x g przez 3 minuty. Całkowita objętość końcowa nie powinna przekraczać 10–15 μl, w przeciwnym razie DNA może być zbyt rozcieńczone do etapu transformacji.
   Uwaga: nie wirować urządzenia filtrującego zbyt długo i nie dopuścić do jego całkowitego wyschnięcia, aby zapobiec potencjalnej utracie próbki. Jeśli membrana wyschnie, dodać na nią 10–15 μl wody sterylnej, delikatnie mieszać przez 30 sekund i odzyskać DNA zgodnie z powyższym opisem.

Część 3: Transformacja P. pastoris metodą elektroporacji

1. Zlinearyzowane i zagęszczone DNA pPICZαA zawierające insert jest teraz gotowe do transformacji do elektrokompetentnych komórek P. pastoris (patrz krok I, część 2). Około 15 minut przed transformacją należy przygotować następujące odczynniki i urządzenia: napełnić probówkę do mikrocentryfugi 1 mL 1 M sorbitolu i umieścić ją w lodzie; umieścić kuwetę do elektroporacji 0,2 cm w lodzie; oznakować sterylną szklaną probówkę 15 mL i przygotować sterylną szklaną pipetę Pasteura.
2. Przenieść 80 μl komórek z kroku I, części 2.7 do schłodzonej do temperatury lodu kuwety do elektroporacji 0,2 cm. Dodać zagęszczony roztwór zlinearyzowanego DNA pPICZαA z kroku I, części 3.6 i wymieszać, przesuwając końcówkę pipety z boku na bok w kuwecie do elektroporacji.
   Uwaga: podczas dodawania DNA docisnąć tłok pipety tylko do pierwszego stopnia. Po wymieszaniu DNA z komórkami docisnąć tłok pipety do drugiego stopnia i powoli wyciągnąć ją z kuwety.
3. Inkubować kuwetę z komórkami w lodzie przez 5 minut.
4. Wytrzeć zewnętrzną stronę kuwety chusteczką i poddać komórki impulsowi zgodnie z parametrami dla drożdży (Saccharomyces cerevisiae) zasugerowanymi przez producenta konkretnego urządzenia do elektroporacji.
   Uwaga: używamy urządzenia Bio-Rad GenePulser z następującymi warunkami:
   • Napięcie ładowania (V): 1500;
   • Pojemność (μF): 25;
   • Opór (Ω): 200.
   Przy użyciu kuwety do elektroporacji 0,2 cm protokół generuje długość impulsu ~10 ms przy natężeniu pola ~7500 V/cm.
5. Natychmiast dodać do kuwety 1 mL schłodzonego do temperatury lodu 1 M sorbitolu. Przenieść zawartość kuwety do sterylnej probówki 15 mL za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura.
6. Inkubować probówkę w temperaturze 30°C bez wytrząsania przez 1,5 godziny.
7. Dodać 5-7 wysterylizowanych szklanych kulek na cztery oznakowane płytki YPDS zawierające 100 μg/mL Zeociny. Wysiać 250 μl mieszaniny po elektroporacji z szklanej probówki 15 mL na każdą płytkę. Potrząsać płytką w poziomie, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki. Pozostawić płytkę do wyschnięcia na 15 minut, a następnie usunąć kuleczki z agaru, odwracając płytkę.
   Uwaga: używamy 100 μg/mL Zeociny do selekcji transformantów przy użyciu szczepu Pichia GS115. Warunki selekcji mogą się różnić w przypadku użycia innego szczepu Pichia.
8. Inkubować płytki odwrócone do góry dnem przez 2 do 3 dni w temperaturze 30°C aż do pojawienia się kolonii. Owinąć płytki czarną folią, aby zapobiec degradacji światłoczułej Zeociny. Zbyt mała ilość antybiotyku na płytkach może prowadzić do powstania fałszywie dodatnich klonów.
9. Po pojawieniu się kolonii wybrać 12 kolonii i oczyścić je poprzez posiew klonów na świeże płytki YPDS zawierające 100 μg/mL Zeociny.

Krok II: Ekspresja białka w Pichia pastoris

Do tego etapu będą Państwo potrzebować następujących pożywek, płytek i odczynników:

• podłoże BMGY
• glicerol, wysterylizowany
• podłoże BMMY
• metanol, wysterylizowany
• zestaw do oczyszczania DNA drożdży EPICENTRE Yeast DNA purification kit

Potrzebne będą również następujące kolby:

• kolba 250 mL, autoklawowana
• kolba z przegrodami 1 L, autoklawowana
• zlewka 200 mL, autoklawowana

Część 1: Ekspresja białka w Pichia pastoris

Wszystkie poniższe kroki są wykonywane również w przypadku przetransformowanego wektora kontrolnego (bez wstawki).

1. Wybrać pojedynczą kolonię z oczyszczonej Pichia kolonie z kroku I, część 3.9 i zaszczepić w 25 ml pożywki BMGY w sterylnej kolbie o pojemności 250 ml. Hodować w 30°C w inkubatorze z wytrząsaniem (250-300 obr./min), aż kultura osiągnie gęstość optyczną (OD)₆₀₀ = 2-6 (około 16-18 godzin).
   Uwaga: przed pomiarem na spektrofotometrze należy rozcieńczyć próbkę, aby uzyskać dokładny wynik. Komórki będą znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego.
2. Gdy komórki osiągną odpowiednią wartość OD₆₀₀ przygotować zamrożony stok w glicerolu. Przenieść 800 μl 25 ml hodowli komórkowej do 2 ml krioprobówki Corning i dodać 200 μl sterylizowanego glicerolu. Zamrozić zapas glicerolu i przechowywać w temperaturze -80°C.
3. W celu puryfikacji DNA drożdży przenieś 1,5 ml z 25 ml hodowli komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Zbierz komórki, wirując je przy 1300 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Komórki te są wykorzystywane do analizy Pichia integranty w celu potwierdzenia, czy gen docelowy został zintegrowany z Pichia genom (patrz krok II, część 2). Osad komórkowy należy przechowywać w 4°C do czasu dalszej analizy.
4. Przenieś pozostałą część 25 ml kultury do probówki Falcon o pojemności 50 ml i zbierz komórki, wirując je z prędkością 3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odlej nadsącz i umieść probówki dnem do góry na chusteczce, aby usunąć pozostałości medium. Aby wyprać osad komórkowy, resuspenduj go w 20 ml BMMY w celu usunięcia resztek medium BMGY, ponieważ zawarty w nim glicerol może hamować późniejszą ekspresję. Ponownie wiruj z prędkością 3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odlej nadsącz.
5. Resuspender osad komórkowy do określonej gęstości optycznej (OD)₆₀₀ do 1,0 w medium BMMY w celu indukcji ekspresji (około 100–200 ml) i przenieść hodowlę do 1-litrowej kolby z przegrodami. Przykryć kolbę zlewką o pojemności 200 ml i ponownie umieścić w inkubatorze, aby kontynuować wzrost w 30°C.
   Uwaga: ważne jest, aby temperatura nie przekroczyła 30°CJeśli temperatura w inkubatorze ulega wahaniom, ustaw temperaturę na 28°COdpowiednie napowietrzanie jest również istotnym parametrem dla wydajnej ekspresji podczas indukcji metanolem (podczas indukowania ekspresji nigdy nie należy przekraczać objętości hodowli > (10-30% całkowitej objętości kolby). Zdecydowanie zalecamy stosowanie kolb z przegrodami (baffled flasks), ponieważ zapewniają one lepsze napowietrzenie pożywki hodowlanej.
6. Co 24 godziny dodawać wysterylizowany czysty metanol do końcowego stężenia 0,5%, aby utrzymać indukcję.
7. W określonych punktach czasowych po rozpoczęciu transferu ekspresji przenieś 1 ml hodowli do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Wiruj przy 1300 x g przez 2,5 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieś nadsącz do osobnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przechowuj nadsącz oraz osad komórkowy w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy. Próbki pobrane w różnych punktach czasowych zostaną poddane analizie w celu ustalenia optymalnego czasu ekspresji białka po indukcji.
   Uwaga: jako punkty czasowe dla pobierania próbek wybrano 6 h, 12 h, 24 h, 36 h oraz 48 h. Możliwa jest dalsza inkubacja do 4 dni. Optymalne punkty czasowe różnią się w zależności od ekspresjonowanych białek.
8. Przeanalizowano nadsącz oraz osady komórkowe pod kątem ekspresji białek za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem Coomassie oraz analizy western blot (nieopisanych w niniejszym protokole).

Część 2: Oczyszczanie DNA drożdży i analiza PCR integranta Pichia

Wszystkie odczynniki niezbędne do etapu oczyszczania DNA drożdży z hodowli Pichia w pożywce BMGY są zawarte w zestawie MasterPure Yeast DNA Purification Kit firmy EPICENTRE.
Uwaga: analiza ta jest dodatkowa i jest przeprowadzana w celu ustalenia, czy gen docelowy został wbudowany w genom Pichia. Wykorzystuje się do niej osad komórkowy z próbki o objętości 1,5 mL pobranej z hodowli w BMGY (patrz krok II, część 1.3).

Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji MasterPure Yeast DNA Purification firmy Epicentre i przeprowadź reakcję PCR z wykorzystaniem DNA drożdży oraz specyficznych starterów dla wstawki. Przeanalizuj 3 μl produktu PCR na żelu agarozowym zawierającym 1 μl bromku etydyny. W jednej z dołków umieść marker wielkości 1 Kb⁺, aby zinterpretować rozmiar wstawki, a następnie zwizualizuj DNA za pomocą systemu dokumentacji żeli.

Białko rekombinowane można analizować za pomocą analizy western blot. Oczyszczanie białka można przeprowadzić metodą oczyszczania z użyciem znacznika His na żywicy obciążonej metalami (nieopisanej w niniejszym protokole).

Dodatek, lista przepisów

Krok I:

1. Pożywka YPD:
   Aby przygotować 600 mL pożywki YPD (pożywka z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą), rozpuścić 5 g ekstraktu drożdżowego i 12 g peptonu w 540 mL wody. Autoklawować przez 20 minut w cyklu dla cieczy.
   W międzyczasie przygotować 70 mL 20% dekstrozy i wysterylizować ją przez filtrację przed użyciem.
   Pozostawić autoklawowany roztwór do schłodzenia do ~60°C i dodać 60 mL wysterylizowanej przez filtrację 20% dekstrozy.
2. Szalki YPDS (+ Zeocin):
   Aby przygotować 500 mL agaru YPDS + Zeocin (pożywka z ekstraktem drożdżowym, peptonem, dekstrozą i sorbitolem), rozpuścić 5 g ekstraktu drożdżowego, 91,1 g sorbitolu i 10 g peptonu w 450 mL wody. Dodać 10 g agaru oraz magnes do mieszania i autoklawować przez 20 minut w cyklu dla cieczy.
   W międzyczasie przygotować 60 mL 20% dekstrozy i wysterylizować ją przez filtrację przed użyciem.
   Pozostawić autoklawowany roztwór do schłodzenia do ~60°C, a następnie dodać 50 mL wysterylizowanej przez filtrację 20% dekstrozy.
   Przed dodaniem antybiotyku przygotować kilka szalek z samą pożywką YPDS (bez Zeocinu). Następnie dodać 500 μl Zeocinu z roztworu stokowego o stężeniu 100 mg/ml, aby uzyskać stężenie końcowe 100 μg/ml Zeocinu w agarze. Podczas dodawania antybiotyku mieszać na mieszadle magnetycznym i kontynuować mieszanie przez około 2 minuty w celu równomiernego rozprowadzenia.
   Wylać pożywkę do szalek Petriego i przykryć czarną folią. Pozostawić szalki do wyschnięcia na blacie przez noc. Przechowywać szalki YPD zawierające Zeocin w temperaturze 4°C. Okres przydatności wynosi od jednego do dwóch tygodni.
   Uwaga: przykrycie folią jest konieczne, ponieważ Zeocin jest światłoczuły.

Krok II:

1. BMGY (buforowanej pożywki z kompleksem glicerolu) i BMMY (buforowanej pożywki z kompleksem metanolu):
   Do każdej z pożywek rozpuścić 8 g ekstraktu drożdżowego i 16 g peptonu w 560 mL wody. Autoklawować przez 20 minut w cyklu dla cieczy.
   W międzyczasie przygotować następujące roztwory:
   • 1 M bufor fosforanowy potasu, pH 6.0:
   Połączyć 24 mL 1M K₂HPO₄ i 156 mL 1M K₂HPO₄ i potwierdzić, że pH = 6.0 (w przypadku konieczności korekty pH należy użyć kwasu fosforowego lub KOH). Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej. Okres przydatności tego roztworu przekracza jeden rok.
   • 10X YNB (13,4% Yeast Nitrogen Base z siarczanem amonu, bez aminokwasów):
   Rozpuścić 26,8 g bazy azotowej dla drożdży (YNB) z siarczanem amonu i bez aminokwasów w 200 mL wody, a następnie sterylizować przez filtrację. Podgrzać roztwór, aby całkowicie rozpuścić YNB w wodzie. Przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około jednego roku. Uwaga: alternatywnie można użyć 3,4 g YNB bez siarczanu amonu i bez aminokwasów i dodać 10 g siarczanu amonu.
   • 500X B (0,02% biotyny):
   Rozpuścić 10 mg biotyny w 50 mL wody i sterylizować przez filtrację. Przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około jednego roku.
   • 10X M (5% metanolu):
   Wymieszać 5 mL metanolu z 95 mL wody. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około dwóch miesięcy.
   • 10X GY (10% glicerolu):
   Wymieszać 10 mL glicerolu z 90 mL wody. Sterylizować przez filtrację. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Okres przydatności tego roztworu przekracza jeden rok.
   Pozostawić autoklawowany roztwór do ochłodzenia do temperatury pokojowej, następnie dodać następujące składniki i dokładnie wymieszać:
   • 80 mL 1 M buforu fosforanowego potasu, pH 6.0;
   • 80 mL 10X YNB
   • 0,16 mL 500X B
   • 80 mL 10X GY
   W celu przygotowania BMMY należy dodać 80 mL 10X M zamiast glicerolu.
   Pożywki przechowywać w 4°C. Okres przydatności tego roztworu wynosi około dwóch miesięcy.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Ten obraz western blot przedstawia cztery wyrażone białka (oznaczone jako 1605, 0537, 1228 i 1682) po 24 godzinach ekspresji. Przeciwciałem zastosowanym do immunoblotingu było przeciwciało c-myc-HRP. Druga ścieżka (oznaczona jako N) stanowi kontrolę negatywną i została załadowana nadanem z komórek, które nie wykazują ekspresji białka rekombinowanego, ponieważ zostały one przekształcone za pomocą wektora rodzicielskiego (pustego).

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano ekspresję białek z wykorzystaniem metylotroficznych drożdży Pichia pastoris jako systemu gospodarza. W zależności od zastosowanego wektora klonującego białko może być wydzielane do pożywki. Sekrecja białka rekombinowanego ułatwia jego późniejsze oczyszczanie. Przedstawione jednak warunki mogą wymagać optymalizacji w przypadku ekspresji różnych białek, a zmiany w warunkach i czasie ekspresji mogą prowadzić do zwiększenia poziomu białka. Wektor użyty w tym protokole posiada epitop