Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Podsumowanie

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Streszczenie

Badanie roli cząsteczek dziedziczonych w drodze matczynej w wczesnym rozwoju kręgowców jest często utrudnione przez czas i koszty niezbędne do wygenerowania zwierząt z mutacjami efektu matczynego. Ponadto wiele technik nadekspresji lub inhibicji funkcji genów u organizmów takich jak Xenopus i zebrafish nie pozwala na wystarczające celowanie w kluczowe matczyne szlaki sygnalizacyjne, takie jak sygnalizacja Wnt. W przypadku Xenopus manipulacja funkcją genów w hodowanych oocytach, a następnie ich zapłodnienie, może w pewnym stopniu rozwiązać te problemy. Oocyty są manualnie defolikulowane z tkanki jajnika dawcy, wstrzykiwane lub traktowane w hodowli zgodnie z potrzebami, a następnie stymulowane progesteronem w celu indukcji dojrzewania. Następnie oocyty są wprowadzane do jamy ciała owulującej samicy żaby gospodarza, skąd przemieszczają się przez jajowód gospodarza, nabywając modyfikacji i otoczek galaretowatych niezbędnych do zapłodnienia. Powstałe embriony mogą być następnie hodowane do pożądanego stadium i analizowane pod kątem efektów wszelkich zaburzeń eksperymentalnych. Ta metoda transferu do gospodarza okazała się bardzo skuteczna w odkrywaniu podstawowych mechanizmów wczesnego rozwoju i umożliwia szeroki zakres możliwości eksperymentalnych, które nie są dostępne w żadnym innym modelowym organizmie kręgowca.

Protokół

1. Chirurgiczne usunięcie tkanki jajnika

1. Przygotować świeżą partię pożywki do hodowli oocytów (OCM; Materiały), w ilości od 400-800 mL, w zależności od skali eksperymentu. Dostosować pH do wartości 7.6-7.8, aż czerwień fenolowa zmieni kolor na ciemnoczerwony (wymagane jest około sześciu małych kropli 5N NaOH). Odlać niewielką ilość do oddzielnej probówki w celu sprawdzenia pH, ponieważ elektroda do pomiaru pH może zanieczyścić pożywkę. OCM należy przechowywać w temperaturze 18°C i zużyć w ciągu tygodnia.
2. Wybrać 3-5 samic i umieścić każdą z nich w ~ 2L buforowego roztworu anestetyka (Materiały). Należy unikać używania żab karmionych w dniu lub w dniu poprzedzającym zabieg chirurgiczny. Podczas gdy żaba ulega działaniu anestetyka, zdezynfekować obszar operacyjny 70% EtOH i przygotować instrumenty chirurgiczne.
3. Zesterylizować instrumenty chirurgiczne poprzez 20-sekundowe zanurzenie w gorącym sterylizatorze koralikowym w temperaturze 250°C. Pod ręką powinny znajdować się następujące narzędzia: rękojeść skalpela (#3) i ostrze (#10 lub 11), kilka par pincet Dumont, nożyczki irydowe Bonn (zakrzywione lub proste), mikroigłotrzymacz Halsey lub Olsen-Hegara oraz nici chirurgiczne. Zesterylizowane instrumenty należy umieścić na sterylnej szalce Petriego lub na wewnętrznej stronie opakowania nici, aby zachować ich sterylność. Przed rozpoczęciem chwycić igłę w igłotrzymaczu w pożądanej orientacji. Preferowane są igłotrzymacze Olsen-Hegara, ponieważ ich rękojeść zawiera ostrza nożyczek, które można wykorzystać do przycinania nici bez konieczności zmiany instrumentu.
4. Po 10 minutach sprawdzić, czy osiągnięto chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Znieczulone żaby przestaną się poruszać i nie będą reagować na uciśnięcie palca u nogi ani na obrócenie. Znieczulenie powinno trwać 15 minut, co jest czasem w zupełności wystarczającym do przeprowadzenia zabiegów. Założyć odpowiednią odzież chirurgiczną. W zależności od preferencji osobistych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami, może to obejmować czyste rękawiczki (nietylne), fartuchy laboratoryjne i maseczki chirurgiczne.
5. Uwaga dotycząca techniki aseptycznej: wydzieliny skóry żab zawierają peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które zazwyczaj zmniejszają częstość występowania zakażeń podczas operacji, niemniej jednak należy w miarę możliwości przestrzegać techniki aseptycznej. Można stosować obłożenia chirurgiczne, choć mogą one nie być wymagane przez instytucjonalne komisje IACUC i mogą nie przynosić dużych korzyści. Zazwyczaj stosuje się tzw. „technikę końcówek” (tip technique), w której dłonie nie dotykają sterylnych końcówek instrumentów, materiału szewnego ani miejsca nacięcia. Instrumenty można ponownie wysterylizować (w sterylizatorze koralikowym) po nacięciu skóry; na blacie należy zachować sterylny obszar do odkładania narzędzi (np. szalkę Petriego lub opakowanie nici). Wymagania instytucjonalne mogą się znacznie różnić, dlatego należy stosować się do wytycznych swojej jednostki i przejść odpowiednie przeszkolenie przed przeprowadzeniem zabiegów.
6. Wyjąć żabę z anestetyka i ułożyć ją na plecach na wilgotnej chusteczce chirurgicznej. Uwaga: skórę można oczyścić, płucząc ją w rozcieńczonym jodku powidonu (1:20) lub chlorheksydynie (0.75%). Należy jednak unikać komercyjnych szorówek chirurgicznych, mydeł i 70% alkoholu izopropylowego, ponieważ mogą one uszkodzić delikatną skórę płazów.
7. Za pomocą skalpela lub małych nożyczek irydowych wykonać niewielkie (1- 1.5 cm) nacięcie skóry w dolnej części brzucha, bocznie od linii środkowej. Kolejne nacięcia u tej samej żaby powinny być wykonywane naprzemiennie po obu stronach, w znacznej odległości od siebie. Nacięcia można wykonywać równolegle lub prostopadle do linii środkowej.
8. Nacięcia skóry i mięśni brzusznych należy wykonać w dwóch etapach. Po przecięciu skóry unieść warstwę mięśniową i otaczającą ją białą powięź pęsetą, a następnie wykonać nacięcie w uniesionym mięśniu. Używając nożyczek, przeciąć tkankę pionowo w dół; należy starać się wykonać jedno szybkie cięcie, aby odsłonić jamę ciała, pozostawiając czyste brzegi rany. Jeśli przecięta zostanie tylko powięź, wciągnie się ona, co utrudni późniejsze szycie. Uniesienie mięśnia pomoże uniknąć przypadkowego uszkodzenia narządów wewnętrznych. Należy również starać się nie przeciąć widocznych serc limfatycznych ani naczyń krwionośnych w warstwach mięśniowych. Za pomocą nożyczek wydłużyć nacięcie tak, aby jajnik można było łatwo wyciągnąć.
9. Po wykonaniu nacięcia jajnik powinien być wyraźnie widoczny. Aby pobrać jajnik, chwycić go pęsetą i wysunąć tkankę jajnika na zewnątrz. Należy usunąć pożądaną ilość tkanki, odcinając ją na poziomie ściany ciała. Nie wolno wpychać tkanki z powrotem do jamy coelomicznej, ponieważ może to być źródłem infekcji lub innych powikłań.
10. Natychmiast obejrzeć mały fragment jajnika pod mikroskopem stereoskopowym i odfolikulować kilka oocytów, aby sprawdzić ich jakość. Powinny być one twarde, o jednolitym rozmiarze i zabarwieniu. Jeśli są one akceptowalne, pobrać pożądaną ilość tkanki jajnika i zaszyć nacięcie. Dla większości eksperymentów zazwyczaj wystarcza ilość pozwalająca wypełnić szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Jeśli jakość oocytów budzi wątpliwości, zaszyć żabę i powtórzyć procedurę u innej samicy.
11. Zamknąć nacięcie, szyjąc najpierw warstwę mięśniową i powięź. Wbić igłę kilka milimetrów bocznie od nacięcia, upewniając się, że przechodzi ona również przez warstwę powięzi. Szwy wykonane tylko w mięśniu mogą rozerwać tkankę i rozwiązać się. Użyć pęsety, aby pomóc w wprowadzeniu igły od dołu po przeciwnej stronie nacięcia. Puścić i ponownie chwycić igłę z zewnątrz ciała, a następnie przeciągnąć nić, aż pozostanie około kilku cali końca nici, uważając, aby nie przeciągnąć jej całkowicie.
12. Zamknąć ranę, stosując proste szwy przerywane. Do wiązania węzłów chirurgicznych (węzłów płaskich) stosujemy podstawową metodę wiązania instrumentem. Owinąć długi koniec nici wokół igłotrzymacza, chwycić koniec nici i przeciągnąć go przez pętlę w swoją stronę, a następnie zaciągnąć. Powtórzyć pętlę i przeciągnąć nić, tym razem odsuwając igłotrzymacz od siebie. Dla większego bezpieczeństwa można wykonać trzeci splot (w tym samym kierunku co pierwszy). Przyciąć nić, pozostawiając krótki koniec, i wykonać kolejny szew w mięśniu w odległości kilku milimetrów. Dla małych nacięć wystarczają dwa szwy, dla większych trzy. Powtórzyć procedurę dla warstwy skóry. Prezentacje wideo z podstawowej techniki szycia są dostępne na YouTube – należy szukać pod hasłem „instrument tie”; dostępnych jest wiele filmów, choć podstawowa technika jest zawsze taka sama.
13. Opłukać samicę wodą dejonizowaną i umieścić ją w pojemniku z chłodną (18°C) wodą w celu rekonwalescencji. W laboratorium żaby są trzymane w wodzie z kranu uzdatnionej Amquelem w celu usunięcia chloramin. Co kilka minut delikatnie unosić żabę z wody i obserwować, czy nie wykonuje ruchów chłapnięcia wodą lub wybrzuszeń oczu, co świadczy o wybudzaniu się z narkozy.
14. Uwaga: zabieg chirurgiczny z przeżyciem nie jest ściśle konieczny do pobrania tkanki jajnika, choć samice będą nadal produkować dobre oocyty po kilku operacjach. Wykonywanie zabiegów z przeżyciem pozwoli również ograniczyć liczbę wykorzystywanych zwierząt. Należy bezwzględnie przestrzegać wytycznych jednostki opieki nad zwierzętami w zakresie metod chirurgii z przeżyciem kręgowców, opieki i monitorowania pooperacyjnego oraz dopuszczalnej liczby zabiegów u jednego osobnika.

2. Hodowla i defolikulacja oocytów

1. Bezpośrednio po zakończeniu operacji podziel jajnik na małe fragmenty (~2 cm²) i przechowuj w świeżym OCM, używając 5-6 fragmentów na szalkę 90 mm. Poszczególne płaty jajnika należy rozciąć, rozpłaszczyć i pociąć na kwadratowe kawałki. Następnie należy je wypłukać w czystym OCM i umieścić na szalkach do hodowli. Rozpłaszczenie i podział jajnika przedłuży jego żywotność w hodowli i ułatwi defolikulację.
2. Przenieś płat na małą szalkę z OCM i manualnie defolikuluj 300-500 oocytów. Przenoszenie oocytów wykonuj za pomocą sterylnej, wypalanej pipety. Stwierdziliśmy, że stosowanie pipet z watowym korkiem jest niezbędne do zminimalizowania zanieczyszczenia kultur. Przechowuj oocyty w temperaturze 18°C w 8 mL OCM (w szalkach średnich (Falcon 1007)) w grupach po 100-150. Dzięki wprawie powinieneś być w stanie defolikulować odpowiednią liczbę oocytów w ciągu 1-2 godzin. Oocyty traktowane kolagenazą nie nadają się do transferu do biorcy, ponieważ nie ulegają zapłodnieniu.
3. Metoda defolikulacji. Defolikulację przeprowadzamy za pomocą pęset zegarmistrzowskich (Dumont #4s lub #5s, Fine Science Tools), stosując podstawowe metody opisane przez Smith et al. (1991). Używając jednej pęsety (w dominującej dłoni), chwyć warstwę tkanki łącznej otoczki w pobliżu miejsca przyczepienia pęcherzyka do jajnika (szypułki) w pełni wykształconego oocytu VI stadium. Drugą pęsetą chwyć jajnik obok pierwszej pęsety. Delikatnie rozerwij warstwę pęcherzyka, ciągnąc w poprzek oocytu. Ostrożnie wydziel oocyt z tkanki. Prawidłowo defolikulowane oocyty są bardziej wiotkie niż oocyty po prostu oderwane bez usunięcia warstwy pęcherzyka i są pozbawione widocznych naczyń krwionośnych.
4. Uwaga: Niezbędne jest wywieranie bardzo lekkiego nacisku końcówkami pęsety, ledwie wystarczającego do ich zetknięcia. Zbyt mocny chwyt jest częstym błędem początkujących i skutkuje wyrwaniem oocytu wraz z nienaruszonym pęcherzykiem. Przeznacz dobrą parę pęset wyłącznie do defolikulacji. Końcówki powinny stykać się precyzyjnie i być nieco tępiejsze niż pęsety używane do przygotowywania eksplantów z embrionów Xenopus (Ryc. 1).
5. Rutynowo testujemy dojrzałość około 20 oocytów za pomocą progesteronu i przerywamy eksperyment, jeśli wskaźnik dojrzewania jest niski (<50% po 6-7 godzinach w temperaturze pokojowej).
6. Na tym etapie oocyty mogą być manipulowane i hodowane według potrzeb, np. poprzez mikroiniekcję oligo, morfolino lub mRNA. Procedury iniekcji różnią się w zależności od laboratorium, dlatego nie będziemy ich tutaj opisywać. Oocyty można utrzymywać w OCM do tygodnia, jednak zazwyczaj ich kondycja pogarsza się, dlatego najlepiej wykorzystać je do transferu w ciągu 96 godzin od izolacji.
7. Należy pamiętać, że ze względu na ograniczenia dotyczące barwników witalnych, do jednej samicy można przenieść tylko od pięciu do sześciu grup (łącznie z kontrolą), dlatego należy odpowiednio zaplanować eksperymenty.

3. Dojrzewanie oocytów i stymulacja samic przyszłych biorców

1. W przypadku przeprowadzania ratowania po wyczerpaniu oligosów, wstrzyknij mRNA (zazwyczaj 50-300 pg RNA) około 24-48 godzin po podaniu oligosów. Do tego czasu oligosy powinny ulec degradacji i nie wpływać na wstrzyknięte RNA.
2. Wieczorem przed przeprowadzeniem transferu dodaj 16 μL roztworu roboczego progesteronu (1mM w EtOH) do oocytów w 8 mL OCM w naczyniach z medium (końcowe stężenie progesteronu wynosi ~2 μM). Inkubuj przez 10-12 godzin w temperaturze 18°C, aby umożliwić dojrzewanie oocytów.
3. Wstrzyknij 3-5 samicom po 1000 jednostek hCG na żabę, aby indukować składanie jaj. Nasze eksperymenty zdają się przebiegać pomyślniej, gdy dojrzewanie oocytów i wstrzyknięcie hCG odbywają się w podobnym czasie, około 12 godzin przed implantacją do biorcy (np. od 22:00 do 10:00). Pozostaw samice w temperaturze pokojowej lub 18°C na noc.

4. Przygotowanie i barwienie oocytów barwnikami witalnymi

1. W dniu transferu zarezerwuj ok. 45-60' na przygotowanie i przeprowadzenie procedury. Na tym etapie dojrzałe oocyty można zamrozić do późniejszej analizy skuteczności wyciszenia mRNA lub ekspresji białka. Należy również sprawdzić, czy oocyty nie zostały zainfekowane oraz czy stopień dojrzewania był zadowalający (>50%). Zainfekowane oocyty nie zostaną zapłodnione. Rozmroź barwniki witalne (Materiały) i wiruj z maksymalną prędkością przez 5 min.
2. Oznacz kolorystycznie poszczególne grupy eksperymentalne, dodając 80 μL odpowiedniego barwnika witalnego do szalek z oocytami, a następnie inkubuj z kołysaniem przez 15'. W tym czasie wybierz samicę biorcy i rozpocznij anestezyję. Wybierz żabę, która składa jaja w sposób naturalny i powolny lub taką, która produkuje obficie jaja przy lekkim ucisku. Jaja od biorcy powinny być wysokiej jakości. Unikaj samic składających jaja w formie sznurów lub jaj zmiażdżonych.
3. Przenieś zabarwione jaja do dużej szalki ze świeżym OCM, krótko zamieszaj w celu przemycia i odstaw przed transferem.
4. Przygotuj sterylną pipetę Pasteura z otworem o średnicy wystarczającej do pomieszczenia oocytu (~ 1.5 mm), która posłuży do transplantacji oocytów. Narysuj linię na pipecie za pomocą rysika diamentowego i przełam ją czysto. Wygładź krawędzie palnikiem, uważając, aby nie stopić otworu.

5. Przeprowadzenie transplantacji oocytów

1. Transplantacja oocytów wykorzystuje te same procedury chirurgiczne, które opisano w części I, jednak zamiast usuwania jajnika, manipulowane oocyty są wprowadzane do jamy ciała za pomocą pipety. Idealnie procedura przeniesienia powinna zostać wykonana tak szybko, jak to możliwe, a rozmiar nacięcia powinien być jak najmniejszy.
2. Zanieść samicę biorcę i przygotować narzędzia chirurgiczne zgodnie z opisem w części I. Wykonać nacięcie opisane w części I. Nacięcie może być mniejsze, ale musi być wystarczająco duże, aby zmieścił się w nim otwór pipety transferowej (Rycina 2A).
3. Aby przeprowadzić transplantację oocytów, chwycić i unieść jedną warstwę mięśnia i powięzi pęsetą i wprowadzić eksperymentalne oocyty za pomocą wcześniej przygotowanej pipety Pasteura. Zamieszać naczynie z oocytami, aby zebrać je w centrum, i odessać jak najwięcej z nich. Pozwolić oocytom osiąść na końcu pipety, aby zapobiec wprowadzeniu nadmiaru cieczy, następnie włożyć końcówkę pipety do nacięcia i powoli pozwolić oocytom spłynąć do jamy ciała (Rycina 2B). Powtarzać czynność aż do przeniesienia wszystkich oocytów. Nie puszczać warstwy mięśniowej aż do rozpoczęcia szycia, w przeciwnym razie oocyty mogą wypłynąć przez nacięcie.
4. Po przeniesieniu oocytów chwycić pęsetą obie strony nacięcia i zbliżyć je do siebie, pozwalając oocytom osiąść w jamie ciała. Rozpocząć szycie zgodnie z opisem, dbając o utrzymanie napięcia mięśnia i powięzi do góry aż do zawiązania pierwszego węzła (Rycina 2C). Zapobiegnie to wypchnięciu oocytów na zewnątrz i pozwoli krawędziom nacięcia na równomierne zagojenie. Dodać kolejny szew w warstwie mięśniowo-powięziowej, a następnie zaszyć skórę.
5. Opłukać samicę wodą dejonizowaną i umieścić ją w pojemniku rekonwalescencyjnym wypełnionym schłodzoną (18°C) wodą traktowaną Amquelem. Monitorować wybudzanie z anestezji jak opisano powyżej. Samica powinna zacząć normalnie składać jaja po operacji.
6. Pobrać jądra od samca żaby stosując standardowe procedury. Przechowywać jądra w OCM lub L15 do momentu użycia. W eksperymentach dotyczących zapłodnienia po transferze preferujemy świeże jądra.

6. Pozyskiwanie oocytów i zapłodnienie in vitro

1. Rzęski otrzewne przesuną przeniesione jaja (oraz normalne jaja celomiczne gospodarza) do ujść jajowodów w przedniej części jamy ciała. Kolorowe jaja można odzyskać zaczynając od 2-3 godzin po transferze poprzez standardowe wyciskanie. Jaja można pozyskiwać mniej więcej co pół godziny, aż samica przestanie składać jaja.
2. Zapłodnić w zawiesinie plemników (w ~ 4 mL 1x MMR) przez 4 minuty. Obficie zalać i wypłukać 0.1x MMR. Jaja powinny aktywować się normalnie i zacząć się dzielić ~ 1,5-2 h po zapłodnieniu. Przeniesione jaja często dzielą się nieco później niż jaja gospodarza.
3. Usunąć otoczki galaretowate za pomocą cysteiny w sposób standardowy i posegregować embriony do osobnych naczyń. Można to zrobić na dowolnym etapie, w zależności od potrzeb eksperymentu. Zazwyczaj najłatwiej jest zidentyfikować poszczególne kolory w okolicach stadium 4 komórek, a najtrudniej w późnych stadiach blastuli. Hodować jaja przy niskiej gęstości (< 50 na szalkę Petriego) w czystym 0.1x MMR. Od tego momentu embriony można traktować i manipulować nimi w sposób standardowy.
4. Przenieść żaby z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt i monitorować pod kątem powikłań przez następne kilka dni.
5. Alternatywna metoda zapłodnienia; składanie jaj w buforze o wysokim zasoleniu
   1. Po wybudzeniu żaby z narkozy, umieścić ją w ~ 1 L MMR o wysokim zasoleniu (1.2x). Pozostawić samicę, aby składała jaja do buforu przez około 4-6 godzin. Wycisnąć pozostałe jaja, odlać 1.2x MMR i posegregować kolorowe jaja do czystego naczynia; usunąć cały możliwy płyn.
   2. Obficie przemyć 0.3x MMR i zapłodnić w minimalnej objętości 0.3x MMR/zawiesiny plemników, aż jaja się aktywują (10 minut). Zalać 0.1x MMR i hodować jak opisano powyżej. Ta opcja jest przydatna, gdy potrzebna jest duża liczba jaj w tym samym stadium lub gdy manualne wyciskanie jaj uszkadza oocyty dawcy.

Dyskusja

Pomyślny transfer skutkuje zapłodnieniem i prawidłowym podziałem > 50% oocytów (Rycina 3). Zazwyczaj od 30-60% przeniesionych oocytów przeżywa etapy neuruli. Zwykle transferujemy od 75-150 oocytów na grupę eksperymentalną, co pozwala uzyskać wystarczającą liczbę embrionów do kilku rodzajów analiz (in situ, RT-PCR) oraz wizualizacji fenotypu. Implantacja znacznie większej liczby oocytów nie wydaje się znacząco zwiększać uzysków. Ponadto należy przenieść co najmniej 30 oocytów na grupę, aby zagwarantować, że przynajmnie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory i receptury:
OCM (pożywka do hodowli oocytów; zmodyfikowana według Wylie) i wsp.., 1996)
70% pożywki Leibovitza’pożywka L-15 (zawierająca l-glutaminę)	Invitrogen	11415-064
0,4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA; frakcja V)	Sigma-Aldrich	A-9418-50g
1x penicylina-streptomycyna	Sigma-Aldrich	P-0781
Dostosować pH do wartości 7,6–7,8 za pomocą 5N NaOH
Przygotowywać świeże co tydzień, przechowywać w temperaturze 18°C°C.
10X MMR (Marc’modyfikowany roztwór Ringera’roztwór s; Zuck i wsp.., 1998)
1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl22
10 mM MgCl22
150 mM HEPES
dostosować pH do wartości 7,6–7,8
Przechowywać w temperaturze 4°C°C
Roztwór anestetyczny
1 g/L ester etylowy kwasu 3-aminobenzoowego (MS222)	Sigma-Aldrich	A-5040
0,7 g/L wodorowęglanu sodu
Rozpuścić w wodzie uzdatnionej preparatem Amquel
Przygotowywać świeże co tydzień
Roztwory zapasowe progesteronu
10 mM progesteronu (Sigma P-0130) w 100% etanolu
Rozcieńczyć do stężenia 1 mM w 100% EtOH, aby uzyskać 500-krotny roztwór zapasowy/roboczy
Przechowywać w temperaturze -20°C°C
Barwniki witalne (zmodyfikowane według Heasmana) i wsp.., 1991)
Niebieski: 0,1% Nile Blue A	Aldrich	121479-5G
Czerwony: 0,25% neutralnej czerwieni	Sigma-Aldrich	N-6634
Brązowy: 1% brązu Bismarcka	Sigma-Aldrich	B-2759
Zielony (80 μjasnoniebieski + 80 μjasnobrązowy),
Jasnofioletowy (80 μl blue + 80 μl czerwony).
Szósty kolor, pomarańczowy (80 μl red+ 80 μ(jasnobrązowego), może być również stosowany, lecz często trudno go odróżnić od brązowego.
Roztwory stokowe Blue, Red i Brown przygotowuje się w wodzie dejonizowanej w probówkach o pojemności 50 ml, inkubuje przez 20 minut w warunkach kołysania, a następnie wiruje w wirówce klinicznej. Nadpłyny rozlewa się do probówek do mikrowirówki i przechowuje w temperaturze -20°C.°C.