Disekcja eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis i przygotowanie testu adhezji komórkowej

Podsumowanie

Niniejszy film prezentuje technikę przygotowania eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis, w tym zastosowanie noża z brwi – specjalistycznego narzędzia do sekcji wykonanego z włosa brwiowego. Przedstawiono również protokół przygotowania testu adhezji, który służy do wykrywania kluczowych cząsteczek adhezyjnych obecnych na powierzchni komórek organizatora lub bieguna zwierzęcego, niezbędnych dla prawidłowego rozwoju.

Protokół

Przygotowanie komór adhezyjnych (dzień przed iniekcją/dysekcją)

Komory do testu adhezji

Jeśli dysponują Państwo konwencjonalnym mikroskopem złożonym (optyka znajduje się nad stolikiem), konieczne jest wykonanie niskiej komory adhezyjnej zgodnie z poniższymi instrukcjami. W przypadku korzystania z mikroskopu odwróconego można użyć szkiełek dekrywacyjnych „NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass”, pomijając kroki nr 1 - 2.

1. Przymocuj jeden z „silikonowych izolatorów dociskowych” do szkiełka nakrywkowe o wymiarach 40 x 24 mm. Mocno dociśnij izolator do szkiełka na czystym blacie laboratoryjnym i sprawdź z drugiej strony, czy izolator przylega całkowicie, bez pęcherzyków powietrza.
   
   
2. Opcjonalnie: Umieść komory adhezyjne w szklanej szalce Petriego z papierem filtrowanym Whatman i wysterylizuj w autoklawie w cyklu suchym. Ochłodź je do RT.

Powlekanie komory

1. Za pomocą końcówek żółtych z powłoką Sigma nanieść kroplę 200µl roztworu roboczego kadheryny (10mg/ml) lub fibronektyny (20mg/ml) na środek autoklawowanej komory adhezyjnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
   
   
2. Odessać roztwór kadheryny lub fibronektyny i przenieść go do probówki 1,5ml. Roztwór ten można wykorzystywać ponownie przez następne dwa tygodnie.
   
   
3. Nanieść 500µl 4% BSA w 1x MBS-H w celu zablokowania komory. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   
   
4. Odessać roztwór BSA. Przemyć komorę dwukrotnie 500µl 1x MBS-H. Po drugim płukaniu odessać większość MBS-H (nie całkowicie) i przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4ºC. Taka komora adhezyjna zachowuje właściwości przez kolejne 2-3 dni.

Disekcja i dysocjacja eksplantów zniesienia zwierzęcego

1. Inkubować wstrzyknięte embriony w 0,1x MBS-H, rozcieńczonym z autoklawowanego 1x MBS-H, ponieważ medium nieautoklawowane czasami zawiera niewielkie zanieczyszczenia drobnoustrojowe, które mogą zakłócić proces dysocjacji komórek czapki zwierzęcej.
   
   
2. Przygotować agarowe płytki 1x Barth's oraz płytki agarowe CMF-MBS w naczyniach o średnicy 60 mm, w liczbie co najmniej odpowiadającej liczbie próbek. Na płytki 1x Barth's wlać autoklawowany 1x MBS-H. Na płytki CMF-MBS wlać 10 ml CMF-MBS.
   
   
3. Gdy embriony osiągną stadium 8,5, rozpocząć wycinanie czapek zwierzęcych na płytce 1x Barth's. Do jednego doświadczenia zazwyczaj wystarcza od 10 do 15 eksplantów na próbkę.
   
   
4. Przenieść eksplanty czapki zwierzęcej na płytkę CMF-MBS. Inkubować eksplanty przez 45–60 minut, aż do ich całkowitej dysocjacji. Delikatne potrząsanie co 15 minut wspomaga proces dysocjacji.

Test adhezji komórkowej

1. Wysiewanie komórek: Do komory adhezyjnej przygotowanej zgodnie z instrukcjami w poprzednich sekcjach,  Adhesion Assay Chambers i Coating the Chamber, nalać 500ml 1x MBS-H. Przenieść dysocjowane komórki czapki zwierzęcej z płytki CMF-MBS do komory adhezyjnej za pomocą pipety P200 z żółtymi końcówkami z powłoką sigma, których końce zostały odcięte.
   
   
2. Opcjonalnie: Jeśli to możliwe, ostrożnie odessać medium do poziomu około 2/3 lub połowy objętości, nie dopuszczając do kontaktu komórek z powietrzem. Dodać podobną ilość świeżego MBS-H, aby upewnić się, że medium zawiera wystarczającą ilość Ca²⁺ i Mg²⁺.
   
   
3. Inkubować w RT przez 45 - 90 minut. Okresowo sprawdzać, czy komórki przytwierdzają się do dolnej powierzchni.
   
   
4. W tym momencie można wykonać zdjęcie komórek pod mikroskopem.
   
   
5. Umieścić komorę adhezyjną na szkiełku z siatką. Dopasować jeden z narożników komory adhezyjnej do narożnika siatki na szkiełku. Policzyć i zapisać liczbę przytwierdzonych komórek w kilku różnych polach siatki.
   
   
6. Nalać 1L MBS-H do dużego plastikowego pojemnika (np. Tupperware itp.). Ostrożnie opuścić komorę adhezyjną na dno pojemnika. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut przy niskiej prędkości (50 - 60rpm).
   
   
7. Umieścić komorę adhezyjną z powrotem na szkiełku z siatką, dopasowując ten sam narożnik komory do tego samego narożnika siatki, tak jak wykonano to  w kroku nr 5 tej sekcji, Cell Adhesion Assay. Policzyć liczbę komórek, które pozostały przytwierdzone w tych samych polach siatki, co przed płukaniem. Obliczyć procent komórek, które pozostały przytwierdzone po płukaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x MBS-H	Bufor			Zmodyfikowany test Bartha’podłoże: przepis na 1 L: 5,14 g NaCl, 5 mg KCl, 0,2 g NaHCO33 0,2 g MgSO₄4•7H2O 60 mg CaCl22•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O238 g HEPES, w formie kwasu wolnego. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH. Sterylizować w autoklawie.
CMF-MBS	Bufor			To jest wapń2+/Mg2+wersja bez- MBS-H. Przepis na 500 ml: 2,57 g NaCl, 37,5 mg KCl, 0,1 g NaHCO3/sub> 1,19 g HEPES w formie wolnego kwasu. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH. Autoklawować.
1% agarozy/1x Barth’płytki s				tyle, ile jest próbek
płytki z 1% agarozą/CMF-MBS				tyle samo, ile jest próbek
Chimera E-kadheryny/Fc	Odczynnik	Sigma-Aldrich	E-2278	Rozpuścić 0,1 mg stałej E-kadheryny w 100 µl 1x buforu MBS-H zawierającego 40% glicerolu, aby przygotować 100-krotny roztwór macierzysty (1,0 mg/ml). Przechowywać w –20 °C. Przed użyciem przygotuj roztwór roboczy o stężeniu 10 µg/ml poprzez wykonanie 1/100 rozcieńczenia w 1x MBS-H. Na każdą próbkę wymagane jest 200 µl tego roztworu roboczego.
Fibrynogen, roztwór 0,1%	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F-1141	Tego gotowego roztworu można używać jako zapasu 50x. Przygotować rozcieńczenie 1/50 w 1x MBS-H, aby otrzymać 20 ml. μg/ml roztworu roboczego bezpośrednio przed użyciem. Należy przygotować 200 μL na próbkę tego roztworu roboczego. NIE zalecam stosowania fibonektyny w postaci stałej, ponieważ trudno ją rozpuścić w stężeniu 0,1% w celu przygotowania roztworu zapasowego. Mimo że gotowy roztwór 0,1% jest droższy, pozwala on na uzyskanie bardziej spójnych wyników.
4% BSA /MBS-H	Bufor			BSA: frakcja V klasy biologii molekularnej
żółte końcówki Sigmacote	Narzędzie
szkiełka nakrywkowe nr 1				40 mm x 24 mm lub 60 mm x 24 mm
Silikonowy izolator uszczelniany przez docisk	Narzędzie	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	głębokość 2,5 mm x średnica 20 mm
Szkiełko okrywek z komorą NUNC Lab-Tek	Narzędzie	Fisher Scientific	12-565-471	2 dołki/szkiełka
Szkiełko przedmiotowe z siatką	Narzędzie			siatka zliczeniowa lub okular z siatką do liczenia komórek