Artykuł metodologiczny

Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

DOI:

10.3791/1874

⸱

31 marca 2010

 ,  ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Msh2-Msh6 odpowiada za inicjację naprawy błędów replikacyjnych w DNA. Przedstawiamy tutaj podejście oparte na kinetyce przejściowej, mające na celu zrozumienie mechanizmu działania tego kluczowego białka. Raport ilustruje eksperymenty z zastosowaniem techniki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) w celu pomiaru sprzężonej kinetyki wiązania DNA oraz aktywności ATPase, które leżą u podstaw mechanizmu działania Msh2-Msh6 w procesie naprawy DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza kinetyki przejściowej jest niezbędna do zrozumienia działania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ podejście to dostarcza informacji mechanistycznych, w tym stężeń centrów aktywnych oraz wewnętrznych stałych szybkości, które regulują funkcję makrocząsteczek. W przypadku enzymów pomiary stanu przejściowego lub stanu przedstacjonarnego pozwalają zidentyfikować i scharakteryzować poszczególne etapy ścieżki reakcji, podczas gdy pomiary stanu stacjonarnego dostarczają jedynie informacji o ogólnej wydajności katalitycznej i swoistości. Pojedyncze zdarzenia, takie jak oddziaływania białko-białko lub białko-ligand oraz limitujące szybkość zmiany konformacyjne, często zachodzą w skali milisekundowej i mogą być mierzone bezpośrednio metodami stopped-flow oraz przepływu z gaszeniem chemicznym. Przy dostępności sygnału optycznego, takiego jak fluorescencja, technika stopped-flow stanowi potężne i dostępne narzędzie do monitorowania przebiegu reakcji – od wiązania substratu, przez uwalnianie produktu, aż po obrót katalityczny1,2.

W niniejszej pracy przedstawiamy zastosowanie kinetyki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) do zbadania mechanizmu działania kompleksu Msh2-Msh6, eukariotycznego białka naprawy DNA, które rozpoznaje niedopasowania par zasad oraz pętle insercyjno-delecyjne w DNA i sygnalizuje rozpoczęcie naprawy niedopasowań (MMR)3-5. Dzięki temu Msh2-Msh6 zwiększa dokładność replikacji DNA o trzy rzędy wielkości (częstotliwość błędów spada z ~10-6 do 10-9 zasad), co pomaga w zachowaniu integralności genomu. Nie jest zaskakujące, że zaburzenia funkcji ludzkiego kompleksu Msh2-Msh6 są powiązane z dziedzicznym rakiem jelita grubego bezpolipowatym oraz innymi sporadycznymi nowotworami6-8. Aby zrozumieć mechanizm działania tego kluczowego białka metabolicznego DNA, badamy dynamikę oddziaływań Msh2-Msh6 z niedopasowanym DNA, a także aktywność ATPase, która napędza jego działanie w procesie MMR. Wiązanie DNA mierzy się poprzez szybkie mieszanie Msh2-Msh6 z DNA zawierającym fluorofor 2-aminopuryne (2-Ap) sąsiadujący z niedopasowaniem G:T i monitorowanie w czasie rzeczywistym wynikowego wzrostu fluorescencji 2-aminopuryne. Dysocjację DNA mierzy się poprzez mieszanie wcześniej utworzonego kompleksu Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T(2-Ap) z nieznakowanym DNA pułapkującym i monitorowanie spadku fluorescencji w czasie9. Kinetykę ATPase w stanie przedstacjonarnym mierzy się na podstawie zmiany fluorescencji białka wiążącego fosforan (MDCC-PBP), znakowanego 7-dietyloamino-3-((((2-maleimidylo)etylo)amino)karbonylo)kumaryną, po związaniu fosforanu (Pi) uwalnianego przez Msh2-Msh6 w wyniku hydrolizy ATP9,10.

Dane wykazują szybkie wiązanie Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T i tworzenie długożyjącego kompleksu Msh2-Msh6 G:T, co z kolei prowadzi do zahamowania hydrolizy ATP i stabilizacji białka w formie związanej z ATP. Kinetyka reakcji stanowi wyraźne potwierdzenie hipotezy, że związane z ATP Msh2-Msh6 sygnalizuje naprawę DNA po związaniu niedopasowanej pary zasad w podwójnej helisie.

F. Noah Biro i Jie Zhai wnieśli równy wkład w opracowanie tej pracy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Pomiar kinetyki wiązania DNA przez kompleks Msh2-Msh6

1. Przygotowanie próbek do eksperymentu kinetyki wiązania DNA kompleksu Msh2-Msh6

Przygotowanie odczynników do eksperymentu kinetycznego wiązania DNA opartego na fluorescencji z wykorzystaniem techniki stopped-flow jest podobne do przygotowania do eksperymentu równowagowego na fluorometrze. W rzeczywistości w pierwszej kolejności należy przeprowadzić analizę wiązania równowagowego, aby oszacować stałą dysocjacji (KD) dla danej interakcji w celu optymalizacji warunków reakcji dla analizy kinetycznej. Eksperymenty typu stopped-flow wymagają większych ilości materiałów biologicznych w porównaniu z eksperymentami równowagowymi lub stanem stacjonarnym; w związku z tym podejście to jest najbardziej wykonalne, gdy dostępne są białka w ilościach rzędu kilku miligramów 11,12, a podobne ilości ligandów można przygotować lub zakupić.

  1. Nadekspresujemy białko Msh2-Msh6 z S. cerevisiae w E. coli i oczyścimy ilości białka rzędu miligramów za pomocą chromatografii wymiany jonowej (Rys. 1) 11.
  2. Odczynniki DNA z fluoroforem 2-aminopuryną lub bez niej mogą zostać zsyntetyzowane chemicznie. Zakupujemy jednoniciowe DNA o długości 37 nukleotydów zmodyfikowane 2-aminopuryną i hybrydyzujemy dwie komplementarne nici, aby przygotować dwuniciowe DNA z 2-aminopuryną sąsiadującą z niedopasowaniem G:T (Rys. 2). DNA może zostać oczyszczone przez producenta lub w laboratorium za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym; ta druga metoda zazwyczaj daje wyższe wydajności.
  3. W celu oznaczenia kinetyki wiązania DNA przygotuj osobne próbki DNA G:T(2-Ap) oraz białka Msh2-Msh6 w buforze do wiązania DNA (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl). Stężenia Msh2-Msh6 i DNA wynoszą odpowiednio 0.8 μM i 0.12 μM, co daje stężenia końcowe 0.4 μM i 0.06 μM w pojedynczym eksperymencie mieszania przy stosunku mieszania 1:1. Dla kinetyki dysocjacji DNA przygotuj jedną próbkę zawierającą 0.8 μM Msh2-Msh6 i 0.12 μM DNA G:T(2-Ap) oraz drugą próbkę z 8 μM nieznakowanego DNA G:T jako pułapki dla wolnego Msh2-Msh6. Przygotuj próbki i przechowuj je na lodzie. W tych reakcjach stężenie białka jest znacznie powyżej wartości KD wynoszącej 10 nM dla oddziaływania Msh2-Msh6-DNA, a stężenie DNA jest wystarczające do uzyskania silnego sygnału fluorescencyjnego (wyznaczone empirycznie). Objętość 400 μl na próbkę jest wystarczająca do uzyskania około 10 krzywych kinetycznych (Tabela 1).
  4. Do przygotowania białek, DNA i buforów należy używać odczynników wysokiej czystości, wolnych od zanieczyszczeń fluorescencyjnych. Wszystkie bufory należy przefiltrować przez membranę 0.2 μm, aby uniknąć zapchania układu stopped-flow cząsteczkami.
  5. Jeśli fluorofor pochłania światło widzialne, przygotowanie próbek i eksperyment muszą być przeprowadzane w warunkach niskiego oświetlenia.

2. Przygotowanie aparatury do badania kinetyki wiązania DNA przez Msh2-Msh6

Zasada działania urządzenia do pomiarów typu stopped-flow jest dość prosta. Wykorzystuje ono silnik napędowy do szybkiego tłoczenia dwóch roztworów z strzykawek napędowych do urządzenia mieszającego, a zmieszany roztwór przepływa następnie do komory obserwacyjnej w celu gromadzenia danych (Rys. 3). Używamy urządzenia KinTek stopped-flow, które wymaga niewielkiej objętości próbki, umożliwia pojedyncze lub sekwencyjne mieszanie substratów, detekcję różnych sygnałów optycznych i jest bardzo łatwe w obsłudze. Urządzenia stopped-flow są dostępne również u kilku innych producentów.

  1. Aby przygotować aparat do technik stopped-flow do eksperymentów, upewnij się, że komputer i sterownik są wyłączone. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną ustawioną na temperaturę otoczenia (25 °C) w celu chłodzenia lampy. Zapal lampę. Ustaw monochromator na pożądaną długość fali wzbudzenia (315 nm w przypadku 2-aminopuryny). Przekręć koło szczelin na pożądaną szerokość szczeliny (empirycznie zrównoważ wysoką ekscytację fluoroforu z niskim fotobieleniem). Włącz sterownik i komputer. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną, aby napełnić płaszcz wodny, który utrzymuje substraty w pożądanej temperaturze podczas eksperymentu (30°C w przypadku S. cerevisiae Msh2-Msh6).
  2. Następnie uruchom program stopped-flow. Włącz wybrany detektor, którym w tym przypadku jest fotopowielacz (PMT) z filtrem interferencyjnym odpowiednim dla fluoroforu (filtr z odcięciem 350 nm w przypadku 2-aminopuryny). Przyłóż napięcie do PMT. Zmierz prąd ciemny, aby skorygować ewentualny elektryczny szum tła.
  3. Strzykawki napędowe urządzenia stopped-flow oraz komora obserwacyjna muszą zostać przemyte przed załadowaniem próbek. Ustaw zawór ładowania próbek (Sample Loading Valve) w pozycji LOAD. Napełnij strzykawkę 1ml dejonizowaną, filtrowaną wodą, podłącz ją do portu ładowania znajdującego się pod strzykawką napędową i kilkakrotnie ręcznie przetłocz wodę między obiema strzykawkami. Powtórz ten proces dwukrotnie dla każdej strzykawki napędowej używanej w eksperymencie. Następnie napełnij strzykawki napędowe wodą, aby przemyć komorę obserwacyjną. Przełącz zawór ładowania próbek w pozycję FIRE. Użyj polecenia Adjust Syringe Drive, które steruje silnikiem napędowym, i opuść płytę napędową, aby przepchnąć wodę przez komorę obserwacyjną do linii wylotowej. Uważaj, aby nie dopychać tłoka do samego końca strzykawki napędowej. Podnieś płytę napędową. Przełącz zawór w pozycję LOAD. Przemyj strzykawki ręcznie buforem reakcyjnym i pozostaw je puste. Instrument jest teraz gotowy do użycia.

3. Eksperyment wiązania DNA Msh2-Msh6 oraz analiza danych

  1. Przenieś każdą próbkę z probówki do nowej strzykawki 1 ml. Podłącz strzykawkę z próbką do portu załadowczego i wtłocz roztwór do strzykawki napędowej. Należy zadbać o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza, ręcznie przemieszczając roztwór między dwiema strzykawkami kilka razy z przerwami. Obniż płytę napędową, aż dotknie ona górnej części strzykawek napędowych. Pozostaw odczynniki na kilka minut, aby wyrównały temperaturę do temperatury otoczenia.
  2. Aby przeprowadzić pomiar danych, otwórz okno Set Time/Channels, wybierz kanał zbierania danych (PMT), tryb analizy danych (Fluorescence) oraz liczbę śladów (Shots) do zarejestrowania. Wprowadź czas zbierania danych, podczas którego zostanie zgromadzonych 1000 punktów danych. Nieznaną reakcję należy monitorować przez kilka sekund, aby wykryć ewentualne powolne fazy. Empirycznie oszacuj czas wymagany do osiągnięcia stanu równowagi lub stanu stacjonarnego i ustaw czas zbierania danych na ≥ 6 okresów półtrwania. W przypadku Msh2-Msh6 optymalny przedział czasowy wynosi 2 sekundy dla kinetyki wiązania niedopasowania G:T oraz 60 sekund dla kinetyki dysocjacji G:T. Następnie ustaw zawór w pozycji FIRE i kliknij przycisk Collect Data. Czynność ta inicjuje mieszanie Msh2-Msh6 i DNA, wprowadzenie mieszaniny reakcyjnej do celi obserwacyjnej, wzbudzenie fluoroforu 2-Aminopuryny oraz rejestrację sygnału fluorescencji w czasie. Zbierz co najmniej 5 śladów kinetycznych, aby uzyskać dane wysokiej jakości, a następnie zapisz plik.
  3. Po zakończeniu eksperymentu wyłącz lampę. Przepłucz strzykawki i celę obserwacyjną wodą, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie wyłącz pozostałe urządzenia, z wyjątkiem cyrkulacyjnej łaźni wodnej. Woda powinna krążyć przez dodatkowe 15 minut w celu schłodzenia lampy.
  4. Operacje matematyczne i dopasowanie danych można przeprowadzić w samym oprogramowaniu KinTek, aby uzyskać wstępny wgląd w kinetykę reakcji w trakcie eksperymentu. Dalszą analizę można przeprowadzić poprzez uśrednienie wielu śladów kinetycznych, a następnie zapisanie i eksport uśrednionego pliku do innego oprogramowania do analizy danych lub tworzenia wykresów.

4. Reprezentatywne wyniki kinetyki wiązania DNA przez Msh2-Msh6

Dane kinetyczne dla oddziaływań Msh2-Msh6 z DNA z niedopasowaniem G:T można dopasować do pojedynczej funkcji wykładniczej, co pozwala wyznaczyć szybką stałą szybkości wiązania kON bliską 3 x 107 M-1second-1 (Rys. 4A) oraz wolną stałą dysocjacji kOFF wynoszącą 0,012 second-1 (Rys. 4B), co wskazuje, że Msh2-Msh6 szybko wiąże niedopasowanie G:T i tworzy bardzo stabilny kompleks o czasie połowicznego rozpadu bliskim 60 sekundom 13.

B. Pomiar kinetyki ATPase Msh2-Msh6

1. Przygotowanie próbek do eksperymentu kinetyki ATPase Msh2-Msh6

  1. Przygotować odczynniki Msh2-Msh6 oraz DNA zgodnie z wcześniejszym opisem, wykorzystując nieznakowane DNA. Dodatkowo oczyścić białko wiążące fosforan (PBP) z E. coli i znakować je fluoroforem MDCC (Ryc. 5) 14,15. MDCC-PBP szybko wiąże wolny fosforan (kON wynosi 1 x 108 M-1s-1) i z wysokim powinowactwem (KD = 100 nM), co skutkuje gwałtownym wzrostem fluorescencji MDCC (Ryc. 6). MDCC-PBP stanowi zatem niezawodny reporter kinetyki hydrolizy ATP i uwalniania fosforanu w stanie przedstacjonarnym 14,15. Należy pamiętać, że w tym teście kluczowe jest zminimalizowanie poziomu fosforanu w tle; dlatego na WSZYSTKICH etapach przygotowania odczynników należy ściśle unikać stosowania szkła.
  2. Przygotować próbkę zawierającą 4 μM białka Msh2-Msh6 z dodatkiem lub bez dodatku 6 μM DNA G:T, co w eksperymencie z mieszaniem w stosunku 1:1 daje stężenia końcowe 2 μM i 3 μM. Należy zauważyć, że eksperymenty w stanie przedstacjonarnym wymagają wysokich stężeń enzymu, ponieważ interesujący sygnał pochodzi z pojedynczego obrotu katalitycznego lub pierwszych kilku obrotów. Przygotować kolejną próbkę zawierającą 1 mM świeżo rozpuszczonego ATP oraz 20 μM reportera MDCC-PBP. Do próbek dodać 0,10 jednostek/ml purynonukleozydofosforylazy oraz 200 μM 7-metyloguanozyny, co służy usunięciu wszelkich zanieczyszczeń fosforanowych. Inkubować próbki na lodzie przez co najmniej 20 minut (Tabela 2).

2. Przygotowanie aparatury do pomiaru kinetyki ATPase kompleksu Msh2-Msh6

  1. Przygotować aparat do techniki stopped-flow do przeprowadzenia doświadczeń zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodatkowo, w celu usunięcia zanieczyszczeń fosforanowych ze strzykawki napędowej, przepłukać ją roztworem zawierającym 0,5 Units/ml purynonukleozydofosforylazy oraz 200 μM 7-metyloguanozyny przez 20 minut. Ustawić długość fali wzbudzenia na 425 nm i zastosować filtr odcinający 450 nm w PMT do detekcji fluorescencji MDCC-PBP.

3. Eksperyment ATPase Msh2-Msh6 i analiza danych

  1. Napełnij strzykawki napędowe próbkami zgodnie z wcześniejszym opisem. Kliknij Collect Data, aby zmieszać Msh2-Msh6 z ATP i MDCC-PBP oraz monitorować uwalnianie fosforanu przez Msh2-Msh6 i powiązany z tym wzrost fluorescencji MDCC-PBP w czasie. Zbierz co najmniej 5 krzywych kinetycznych, aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych, a następnie zapisz plik. Oblicz średnią z wielu krzywych kinetycznych i wyeksportuj plik danych do analizy.
  2. Przygotuj krzywą kalibracyjną w celu określenia liniowej zależności między stężeniem fosforanu a fluorescencją MDCC-PBP. W tym celu wymieszaj MDCC-PBP z różnymi stężeniami fosforanu w tych samych warunkach doświadczalnych w urządzeniu stopped-flow, a następnie zmierz maksymalną fluorescencję MDCC-PBP dla każdego stężenia fosforanu.
  3. Wykreśl maksymalną fluorescencję MDCC-PBP kontra każde stężenie fosforanu dla krzywej kalibracyjnej (Rys. 7), a następnie wykorzystaj nachylenie tej krzywej do wyznaczenia stężenia fosforanu w reakcjach Msh2-Msh6. Przedstaw stężenie fosforanu na wykresie kontra czasu i dopasować dane do funkcji wykładniczej oraz liniowej. Funkcja ta opisuje gwałtowny wzrost hydrolizy ATP i uwalniania fosforanu w fazie przedstanowej, po której następuje liniowa faza stacjonarna reakcji.

4. Reprezentatywne wyniki kinetyki ATPase dla Msh2-Msh6

Dane kinetyczne wskazują, że Msh2-Msh6 hydrolizuje ATP i szybko uwalnia fosforan z szybkością 1,4 second-1 podczas pierwszego cyklu katalitycznego. Po tej fazie następuje powolny etap reakcji, który ogranicza kolejne cykle do stanu stacjonarnego o 7-krotnie mniejszej wartości kcat wynoszącej 0,2 second-1 (Ryc. 8A). Jednakże, gdy Msh2-Msh6 jest związany z niedopasowanym DNA, gwałtowna hydroliza ATP i uwalnianie fosforanu są tłumione, a Msh2-Msh6 pozostaje w stanie związanym z ATP przez dłuższy czas.

figure-protocol-1
Rycina 1. Oczyszczanie kompleksu Msh2-Msh6 z S. cerevisiae z komórek E. coli. Geny Msh2 i Msh6 sklonowano do wektora pET11a i nadeksprymowano w komórkach E. coli BL21 (DE3). Kompleks białkowy oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żywicach SP-sepharose, heparynowej oraz Q-sepharose. Przedstawiona analiza SDS-PAGE zawiera frakcje białek z kolumny Q-sepharose.

figure-protocol-2
Rycina 2. Komplementarne jednoniciowe cząsteczki DNA są hybrydyzowane w celu utworzenia dupleksu zawierającego niedopasowanie G:T z sąsiednią adenozyną (do eksperymentów z ATPase) lub fluorescencyjnym analogiem zasady adenozyny, 2-aminopuryną (do eksperymentów z wiązaniem DNA).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przepływ substratów w urządzeniu KinTek stopped-flow podczas pojedynczego eksperymentu z mieszaniem.

figure-protocol-4
Rycina 4a. Kinetyka oddziaływania kompleksu Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T. Mieszanie dwuniciowego DNA (0.12 μM) zawierającego G:T sąsiadujące z 2-aminopuryną z Msh2-Msh6 (0.8 μM) prowadzi do wzrostu fluorescencji w czasie i pozwala na wyznaczenie bimolekularnej stałej szybkości kON = 2.4 107 M-1s-1 dla tego oddziaływania.

figure-protocol-5
Rycina 4b. Kinetyka oddziaływania Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T. Pomieszanie wcześniej utworzonego kompleksu Msh2-Msh6 z G:T(2-Ap) z nadmiarem nieznakowanego DNA G:T (8 μM), który wyłapuje wolny Msh2-Msh6, prowadzi do spadku fluorescencji w czasie i daje niską stałą szybkości dysocjacji, kOFF = 0,012 s-1, co wskazuje na stabilny kompleks o długim okresie półtrwania wynoszącym ok. 60 sekund. Stężenia końcowe: 0,4 μM Msh2-Msh6, 0,06 μM znakowanego DNA, 4 μM pułapki z nieznakowanego DNA G:T.

figure-protocol-6
Rysunek 5. Przygotowanie MDCC-PBP. Analiza SDS-PAGE białka wiążącego fosforan (PBP) z E. coli, oczyszczonego i znakowanego fluoroforem MDCC.

figure-protocol-7
Rysunek 6. Odpowiedź MDCC-PBP na fosforan. Miareczkowanie MDCC-PBP fosforanem (Pi) prowadzi do wzrostu fluorescencji MDCC.

figure-protocol-8
Rysunek 7a. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fosforanu (Pi). MDCC-PBP (20 μM) miesza się z różnymi ilościami Pi (0 - 8 μM), a fluorescencję mierzy się w czasie aż do osiągnięcia stanu równowagi. Stężenia końcowe: 10 μM MDCC-PBP, 0 - 4 μM Pi.

figure-protocol-9
Rycina 7b. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fosforanu (Pi). Wykreślono maksymalną fluorescencję MDCC-PBP kontra [Pi] w celu otrzymania krzywej wzorcowej. Nachylenie prostej (0,383 μM-1 (w tym przypadku) jest wykorzystywany do przeliczenia fluorescencji MDCC-PBP na stężenie Pi.

figure-protocol-10
Rycina 8a. Kinetyka aktywności ATPase kompleksu Msh2-Msh6. Msh2-Msh6 (4 μM) w obecności ATP (1 mM) i MDCC-PBP (20 μM), przy braku DNA z niedopasowaniem G:T, wykazuje gwałtowny wzrost (burst) hydrolizy ATP i uwalniania Pi. Analiza danych pozwala wyznaczyć szybkość (k hydrolysis = 1.4 s-1) oraz amplitudę (2 μM; 1 miejsce na Msh2-Msh6) fazy gwałtownej, po której następuje liniowa faza stanu stacjonarnego o szybkości 0.4 μM s-1 (kcat = 0.2 s-1).

figure-protocol-11
Rysunek 8b. Kinetyka aktywności ATPase kompleksu Msh2-Msh6. Dodanie DNA z niedopasowaniem G:T do reakcji (6 μM) hamuje gwałtowną hydrolizę ATP (burst), stabilizując kompleks w stanie związanym z ATP. Stężenia końcowe: 2 μM Msh2-Msh6, 500 μM ATP, 3 μM DNA, 10 μM MDCC-PBP. Kinetykę fazy gwałtownej dopasowano do następującego równania: [Pi] = A0e-kt + Vt, gdzie [Pi] to stężenie fosforanu, A0 to amplituda fazy gwałtownej, k to obserwowana stała szybkości fazy gwałtownej, a V to prędkość fazy liniowej (kcat = V/[Msh2-Msh6]).

PróbkaBiałkoKwas deoksyrybonukleinowy (DNA)
OdczynnikRoztwór zapasowyPracaTom, μLRoztwór zapasowyPracaTom, μL
       
Msh2-Msh65 μM0.8 μM64---
2ApG:T---10 μM0.12 μM4.8
bufor10x1x4010x1x40
ddH2O2O--296--355
       
Suma  400  400

Tabela 1 Reakcja wiązania DNA

PróbkaBiałkoBiałko-DNAATP
OdczynnikStężenie zapasuStężenie roboczeObj, μLStężenie zapasuStężenie roboczeObj, μLStężenie zapasuStężenie roboczeObj, μL
          
Msh2-Msh620 μM4 μM8020 μM4 μM80---
G:T---100624---
ATP------50 mM1 mM8
7-MEG250x1x1,6250x1x1,6250x1x1,6
PNPase100x1x4100x1x4100x1x4
PBP-MDCC150 μM20 μM53,3150 μM20 μM53,3---
Bufor10x1x4010x1x4010x1x40
ddH2O--221--197--346
          
Suma  400  400  400

Tabela 2 Reakcja ATPase

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj przykład białka wiążącego niedopasowania DNA ilustruje potencjał i użyteczność metod kinetyki stanu nieustalonego w badaniu mechanizmów działania cząsteczek biologicznych. Pomiary metodą stopped-flow w skali czasu pojedynczego obrotu dostarczyły jednoznacznych dowodów na szybkie i specyficzne wiązanie białka Msh2-Msh6 do niedopasowanej pary zasad oraz tworzenie długotrwałego kompleksu białko X DNA w reakcji 9. Co więcej, analiza aktywności ATPase metodą stopped-flow (oraz quench-flow) dostarczyła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była wspierana przez grant NSF CAREER Award (M.M.H), stypendium Barry M. Goldwater (F.N.B) oraz grant ASBMB Undergraduate Research Award (C.W.D). Klon do nadekspresji PBP został uprzejmie udostępniony przez dr. Martina Webba (MRC, UK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37 GSekwencja DNA: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’
37 T (2-Ap)Sekwencja DNA: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’
37 TSekwencja DNA: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
  2. Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. , Oxford University Press. (2003).
  3. Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
  4. Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
  5. Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
  6. Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
  7. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
  8. Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
  9. Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
  10. Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
  11. Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).
  12. Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
  13. Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
  14. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  15. Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).
  16. Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).
  17. Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
  18. Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wi zanie Msh2 Msh6aktywno ATPasemonitorowanie fluorescencyjnestan przedstacjonarnybia ko wi ce fosforannaprawa niedopasowa DNAanaliza kinetycznakinetyka przej ciowa

Powiązane artykuły