Msh2-Msh6 odpowiada za inicjację naprawy błędów replikacyjnych w DNA. Przedstawiamy tutaj podejście oparte na kinetyce przejściowej, mające na celu zrozumienie mechanizmu działania tego kluczowego białka. Raport ilustruje eksperymenty z zastosowaniem techniki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) w celu pomiaru sprzężonej kinetyki wiązania DNA oraz aktywności ATPase, które leżą u podstaw mechanizmu działania Msh2-Msh6 w procesie naprawy DNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza kinetyki przejściowej jest niezbędna do zrozumienia działania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ podejście to dostarcza informacji mechanistycznych, w tym stężeń centrów aktywnych oraz wewnętrznych stałych szybkości, które regulują funkcję makrocząsteczek. W przypadku enzymów pomiary stanu przejściowego lub stanu przedstacjonarnego pozwalają zidentyfikować i scharakteryzować poszczególne etapy ścieżki reakcji, podczas gdy pomiary stanu stacjonarnego dostarczają jedynie informacji o ogólnej wydajności katalitycznej i swoistości. Pojedyncze zdarzenia, takie jak oddziaływania białko-białko lub białko-ligand oraz limitujące szybkość zmiany konformacyjne, często zachodzą w skali milisekundowej i mogą być mierzone bezpośrednio metodami stopped-flow oraz przepływu z gaszeniem chemicznym. Przy dostępności sygnału optycznego, takiego jak fluorescencja, technika stopped-flow stanowi potężne i dostępne narzędzie do monitorowania przebiegu reakcji – od wiązania substratu, przez uwalnianie produktu, aż po obrót katalityczny1,2.
W niniejszej pracy przedstawiamy zastosowanie kinetyki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) do zbadania mechanizmu działania kompleksu Msh2-Msh6, eukariotycznego białka naprawy DNA, które rozpoznaje niedopasowania par zasad oraz pętle insercyjno-delecyjne w DNA i sygnalizuje rozpoczęcie naprawy niedopasowań (MMR)3-5. Dzięki temu Msh2-Msh6 zwiększa dokładność replikacji DNA o trzy rzędy wielkości (częstotliwość błędów spada z ~10-6 do 10-9 zasad), co pomaga w zachowaniu integralności genomu. Nie jest zaskakujące, że zaburzenia funkcji ludzkiego kompleksu Msh2-Msh6 są powiązane z dziedzicznym rakiem jelita grubego bezpolipowatym oraz innymi sporadycznymi nowotworami6-8. Aby zrozumieć mechanizm działania tego kluczowego białka metabolicznego DNA, badamy dynamikę oddziaływań Msh2-Msh6 z niedopasowanym DNA, a także aktywność ATPase, która napędza jego działanie w procesie MMR. Wiązanie DNA mierzy się poprzez szybkie mieszanie Msh2-Msh6 z DNA zawierającym fluorofor 2-aminopuryne (2-Ap) sąsiadujący z niedopasowaniem G:T i monitorowanie w czasie rzeczywistym wynikowego wzrostu fluorescencji 2-aminopuryne. Dysocjację DNA mierzy się poprzez mieszanie wcześniej utworzonego kompleksu Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T(2-Ap) z nieznakowanym DNA pułapkującym i monitorowanie spadku fluorescencji w czasie9. Kinetykę ATPase w stanie przedstacjonarnym mierzy się na podstawie zmiany fluorescencji białka wiążącego fosforan (MDCC-PBP), znakowanego 7-dietyloamino-3-((((2-maleimidylo)etylo)amino)karbonylo)kumaryną, po związaniu fosforanu (Pi) uwalnianego przez Msh2-Msh6 w wyniku hydrolizy ATP9,10.
Dane wykazują szybkie wiązanie Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T i tworzenie długożyjącego kompleksu Msh2-Msh6 G:T, co z kolei prowadzi do zahamowania hydrolizy ATP i stabilizacji białka w formie związanej z ATP. Kinetyka reakcji stanowi wyraźne potwierdzenie hipotezy, że związane z ATP Msh2-Msh6 sygnalizuje naprawę DNA po związaniu niedopasowanej pary zasad w podwójnej helisie.
F. Noah Biro i Jie Zhai wnieśli równy wkład w opracowanie tej pracy.
Protokół
A. Pomiar kinetyki wiązania DNA przez kompleks Msh2-Msh6
1. Przygotowanie próbek do eksperymentu kinetyki wiązania DNA białka Msh2-Msh6
Przygotowanie odczynników do eksperymentu kinetyki wiązania DNA opartego na fluorescencji z wykorzystaniem urządzenia stopped-flow jest podobne do przygotowania do eksperymentu równowagowego na fluorometrze. W rzeczywistości w pierwszej kolejności należy przeprowadzić analizę wiązania równowagowego, aby oszacować stałą dysocjacji (KD) dla danej oddziaływania w celu optymalizacji warunków reakcji dla analizy kinetycznej. Eksperymenty typu stopped-flow wymagają większych ilości materiałów biologicznych w porównaniu z eksperymentami równowagowymi lub stanu stacjonarnego; dlatego podejście to jest najbardziej wykonalne, gdy dostępne są białka w ilościach rzędu kilku miligramów 11,12 i podobne ilości ligandów mogą zostać przygotowane lub zakupione.
- Nadekspresujemy kompleks Msh2-Msh6 z S. cerevisiae w E. coli i oczyścimy miligramowe ilości białka za pomocą chromatografii wymiany jonowej (Rys. 1) 11.
- Odczynniki DNA z fluoroforem 2-aminopuryną lub bez niego mogą zostać zsyntetyzowane chemicznie. Zakupujemy jednoniciowe DNA o długości 37 nukleotydów zmodyfikowane 2-aminopuryną i hybrydyzujemy dwie nici komplementarne, aby przygotować dwuniciowe DNA z 2-aminopuryną sąsiadującą z niedopasowaniem G:T (Rys. 2). DNA może zostać oczyszczone przez producenta lub w laboratorium za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym; ta druga metoda zazwyczaj pozwala uzyskać wyższą wydajność.
- W celu badania kinetyki wiązania DNA należy przygotować oddzielne próbki DNA G:T(2-Ap) oraz białka Msh2-Msh6 w buforze do wiązania DNA (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl). Stężenia Msh2-Msh6 i DNA wynoszą odpowiednio 0.8 μM i 0.12 μM, co daje stężenia końcowe 0.4 μM i 0.06 μM w pojedynczym eksperymencie z mieszaniem w stosunku 1:1. Dla kinetyki dysocjacji DNA przygotowujemy jedną próbkę zawierającą 0.8 μM Msh2-Msh6 oraz 0.12 μM DNA G:T(2-Ap), a drugą próbkę z 8 μM nieoznaczonego DNA G:T jako pułapkę dla wolnego Msh2-Msh6. Próbki należy przygotować i przechowywać w lodzie. W tych reakcjach stężenie białka znacznie przekracza wartość KD wynoszącą 10 nM dla oddziaływania Msh2-Msh6-DNA, a stężenie DNA jest wystarczające do uzyskania silnego sygnału fluorescencji (określone empirycznie). Objętość 400 μl na próbkę jest wystarczająca do uzyskania około 10 przebiegów kinetycznych (Tabela 1).
- W przygotowaniu białka, DNA i buforów należy stosować odczynniki chemiczne wysokiej czystości, wolne od zanieczyszczeń fluorescencyjnych. Wszystkie bufory należy filtrować przez membranę 0.2 μm, aby zapobiec zapchaniu układu stopped-flow cząstkami stałymi.
- Jeśli fluorofor absorbuje światło widzialne, przygotowanie i eksperyment muszą być przeprowadzane w warunkach niskiego oświetlenia.
2. Przygotowanie instrumentu do pomiaru kinetyki wiązania DNA przez Msh2-Msh6
Urządzenie do pomiarów stop-flow jest w swojej zasadzie dość proste. Wykorzystuje ono silnik napędowy do szybkiego tłoczenia dwóch roztworów z strzykawek napędowych do urządzenia mieszającego, po czym zmieszany roztwór przepływa do celi obserwacyjnej w celu zbierania danych (Ryc. 3). Używamy urządzenia KinTek stopped-flow, które wymaga niewielkiej objętości próbki, umożliwia pojedyncze lub sekwencyjne mieszanie reagentów, detekcję różnych sygnałów optycznych i jest bardzo łatwe w obsłudze. Urządzenia stop-flow są dostępne również u kilku innych producentów.
- Aby przygotować urządzenie stopped-flow do eksperymentów, upewnij się, że komputer i sterownik są wyłączone. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną ustawioną na temperaturę otoczenia (25 deg;C), aby chłodzić lampę. Zapal lampę. Ustaw monochromator na żądaną długość fali wzbudzenia (315 nm w przypadku 2-aminopuryny). Obróć koło szczelin do żądanej szerokości szczeliny (empirycznie zrównoważ wysoką eksytację fluoroforu z niskim fotoblaknięciem). Włącz sterownik i komputer. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną, aby napełnić płaszcz wodny, który utrzymuje substraty w żądanej temperaturze podczas eksperymentu (30°C w przypadku S. cerevisiae Msh2-Msh6).
- Następnie uruchom program stopped-flow. Włącz wybrany detektor, którym w tym przypadku jest lampa fotopowielająca (PMT) z filtrem interferencyjnym odpowiednim dla fluoroforu (filtr z odcięciem 350 nm w przypadku 2-aminopuryny). Przyłóż napięcie do PMT. Zmierz prąd ciemny, aby skorygować ewentualny elektryczny szum tła.
- Strzykawki napędowe układu stopped-flow oraz komora obserwacyjna muszą zostać przemyte przed załadowaniem próbek. Ustaw zawór ładowania próbek (Sample Loading Valve) w pozycji LOAD. Napełnij strzykawkę 1 ml dejonizowaną, filtrowaną wodą, podłącz ją do portu ładowania znajdującego się pod strzykawką napędową i ręcznie przepchnij wodę między dwiema strzykawkami kilka razy. Powtórz ten proces dwukrotnie dla każdej strzykawki napędowej używanej w eksperymencie. Następnie napełnij strzykawki napędowe wodą, aby przemyć komorę obserwacyjną. Przełącz zawór ładowania próbek w pozycję FIRE. Użyj polecenia Adjust Syringe Drive, które steruje silnikiem napędowym, i opuść płytę napędową, aby przepchnąć wodę przez komorę obserwacyjną do linii wyjściowej. Uważaj, aby nie docisnąć tłoka do samego końca strzykawki napędowej. Podnieś płytę napędową. Przełącz zawór w pozycję LOAD. Ręcznie przemyj strzykawki buforem reakcyjnym i pozostaw je puste. Urządzenie jest teraz gotowe do użycia.
3. Eksperyment wiązania DNA przez kompleks Msh2-Msh6 i analiza danych
- Przenieś każdą próbkę z probówki do nowej strzykawki o pojemności 1 ml. Podłącz strzykawkę z próbką do portu załadowczego i wtłocz roztwór do strzykawki napędowej. Należy zadbać o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza, ręcznie tłocząc roztwór między dwiema strzykawkami kilka razy z przerwami. Obniż płytę napędową, aż dotknie ona góry strzykawek napędowych. Pozostaw odczynniki do wyrównania temperatury z temperaturą otoczenia przez kilka minut.
- W celu przeprowadzenia pomiarów otwórz okno Set Time/Channels, wybierz kanał zbierania danych (PMT), tryb analizy danych (Fluorescence) oraz liczbę rejestrowanych przebiegów (Shots). Wprowadź czas zbierania danych, w trakcie którego zostanie zarejestrowanych 1000 punktów pomiarowych. W przypadku reakcji o nieznanej kinetyce monitorowanie powinno trwać kilka sekund, aby wykryć ewentualne wolne fazy. Empirycznie oszacuj czas wymagany do osiągnięcia stanu równowagi lub stanu stacjonarnego i ustaw czas zbierania danych na ≥ 6 okresów półtrwania. Dla Msh2-Msh6 optymalny przedział czasowy to 2 sekundy dla kinetyki wiązania niedopasowania G:T oraz 60 sekund dla kinetyki dysocjacji G:T. Następnie ustaw zawór w pozycji FIRE i kliknij przycisk Collect Data. Czynność ta inicjuje mieszanie Msh2-Msh6 z DNA, wprowadzenie mieszaniny reakcyjnej do celi pomiarowej, wzbudzenie fluoroforu 2-Aminopurine oraz rejestrację sygnału fluorescencji w czasie. Zarejestruj co najmniej 5 przebiegów kinetycznych, aby uzyskać dane wysokiej jakości, a następnie zapisz plik.
- Po zakończeniu eksperymentu wyłącz lampę. Przepłucz strzykawki i celę pomiarową wodą zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie wyłącz pozostałe urządzenia, z wyjątkiem cyrkulacyjnej łaźni wodnej. Woda powinna krążyć przez dodatkowe 15 minut w celu schłodzenia lampy.
- Operacje matematyczne i dopasowanie danych można przeprowadzić w samym oprogramowaniu KinTek, aby wstępnie ocenić kinetykę reakcji w trakcie eksperymentu. Dalszą analizę można przeprowadzić poprzez uśrednienie wielu przebiegów kinetycznych, a następnie zapisanie i eksport uśrednionego pliku do innego oprogramowania do analizy danych lub tworzenia wykresów.
4. Reprezentatywne wyniki kinetyki wiązania DNA przez kompleks Msh2-Msh6
Dane kinetyczne dla oddziaływań Msh2-Msh6 z DNA z niedopasowaniem G:T można dopasować do pojedynczej funkcji wykładniczej, co pozwala wyznaczyć szybką stałą szybkości wiązania kON bliską 3 x 107 M-1second-1 (Ryc. 4A) oraz wolną stałą dysocjacji kOFF wynoszącą 0,012 second-1 (Ryc. 4B), co wskazuje, że Msh2-Msh6 szybko wiąże niedopasowanie G:T i tworzy bardzo stabilny kompleks o czasie połowicznego rozpadu bliskim 60 sekundom 13.
B. Pomiar kinetyki aktywności ATPase Msh2-Msh6
1. Przygotowanie próbek do eksperymentu z kinetyką ATPase Msh2-Msh6
- Przygotować odczynniki Msh2-Msh6 oraz DNA zgodnie z wcześniejszym opisem, stosując nieznakowane DNA. Dodatkowo oczyścić białko wiążące fosforan (PBP) z E. coli i znakować je fluoroforem MDCC (Ryc. 5) 14,15. MDCC-PBP szybko wiąże wolny fosforan (kON wynosi 1 x 108 M-1second-1) i z wysokim powinowactwem (KD = 100 nM), co skutkuje gwałtownym wzrostem fluorescencji MDCC (Ryc. 6). MDCC-PBP jest zatem niezawodnym reporterem kinetyki hydrolizy ATP oraz uwalniania fosforanu w stanie przedustalonym 14,15. Należy pamiętać, że w tym teście kluczowe jest zminimalizowanie poziomu fosforanu w tle; dlatego na wszystkich etapach przygotowywania odczynników należy kategorycznie unikać kontaktu z wyrobami szklanymi.
- Przygotować próbkę zawierającą 4 μM białka Msh2-Msh6 z dodatkiem 6 μM DNA G:T lub bez niego, co pozwala uzyskać stężenia końcowe 2 μM i 3 μM w pojedynczym eksperymencie mieszania przy stosunku mieszania 1:1. Należy zauważyć, że eksperymenty w stanie przedustalonym wymagają wysokich stężeń enzymu, ponieważ sygnał zainteresowania pochodzi z pojedynczego obrotu katalitycznego lub pierwszych kilku obrotów. Przygotować inną próbkę zawierającą 1 mM świeżo rozpuszczonego ATP oraz 20 μM reportera MDCC-PBP. Do próbek dodać 0,10 Units/ml purynowej nukleozydowej fosforylazy oraz 200 μM 7-metyloguanozyny, co służy usunięciu wszelkich zanieczyszczeń fosforanem. Inkubować próbki na lodzie przez co najmniej 20 minut (Tabela 2).
2. Przygotowanie urządzenia do pomiaru kinetyki ATPase dla Msh2-Msh6
- Przygotuj aparat do techniki stopped-flow do eksperymentów zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodatkowo usuń zanieczyszczenia fosforanowe ze strzykawek napędowych, stosując 0,5 Units/ml purynowej nukleozydowej fosforylazy oraz 200 μM 7-metyloguanozyny przez 20 minut. Ustaw długość fali wzbudzenia na 425 nm i zastosuj filtr odcinający 450 nm w PMT do detekcji fluorescencji MDCC-PBP.
3. Eksperyment i analiza danych dotyczących aktywności ATPase Msh2-Msh6
- Napełnij strzykawki napędowe próbkami zgodnie z wcześniejszym opisem. Kliknij Collect Data, aby zmieszać Msh2-Msh6 z ATP oraz MDCC-PBP i monitorować uwalnianie fosforanu przez Msh2-Msh6 oraz powiązany z tym wzrost fluorescencji MDCC-PBP w czasie. Zbierz co najmniej 5 krzywych kinetycznych, aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych, a następnie zapisz plik. Wyciągnij średnią z wielu krzywych kinetycznych i wyeksportuj plik z danymi do analizy.
- Przygotuj krzywą kalibracyjną w celu określenia liniowej zależności między stężeniem fosforanów a fluorescencją MDCC-PBP. W tym celu zmieszaj MDCC-PBP z różnymi stężeniami fosforanów w tych samych warunkach eksperymentalnych w urządzeniu stopped-flow, a następnie zmierz maksymalną fluorescencję MDCC-PBP dla każdego stężenia fosforanów.
- Wykreśl maksymalną fluorescencję MDCC-PBP kontra każde stężenie fosforanu dla krzywej kalibracyjnej (Ryc. 7) i wykorzystaj nachylenie, aby wyznaczyć stężenie fosforanu w reakcjach Msh2-Msh6. Przedstaw stężenie fosforanu na wykresie kontra czasu i dopasowano dane do funkcji wykładniczej oraz liniowej. Funkcja ta opisuje gwałtowny wzrost w fazie przedstanowej hydrolizy ATP i uwalniania fosforanu, po którym następuje liniowa faza stanu stacjonarnego reakcji.
4. Reprezentatywne wyniki kinetyki ATPase kompleksu Msh2-Msh6
Dane kinetyczne wykazują, że kompleks Msh2-Msh6 hydrolizuje ATP i szybko uwalnia fosforan z szybkością 1,4 s-1 w pierwszym cyklu katalitycznym. Po tej fazie następuje powolny etap reakcji, który ogranicza kolejne cykle do stanu stacjonarnego o 7-krotnie wolniejszej wartości kcat wynoszącej 0,2 s-1 (Rys. 8A). Jednakże, gdy Msh2-Msh6 jest związany z niedopasowanym DNA, gwałtowny wzrost hydrolizy ATP i uwalniania fosforanu zostaje zahamowany, a Msh2-Msh6 pozostaje w stanie związanym z ATP przez dłuższy czas.
Rysunek 1. Oczyszczanie kompleksu Msh2-Msh6 z S. cerevisiae z komórek E. coli. Geny Msh2 i Msh6 sklonowano do wektora pET11a i nadeksprymowano w komórkach E. coli BL21 (DE3). Kompleks białkowy oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żywicach SP-sepharose, heparynowej i Q-sepharose. Przedstawiona analiza SDS-PAGE zawiera frakcje białek z kolumny Q-sepharose.
Rysunek 2. Komplementarne jednoniciowe DNA są wyżarzane w celu utworzenia dupleksu zawierającego niedopasowanie G:T z sąsiednią adenozyną (dla eksperymentów z ATPase) lub fluorescencyjnym analogiem zasadowym adenozyny w postaci 2-aminopuryny (dla eksperymentów wiązania DNA).
Rycina 3. Przepływ substratów w urządzeniu KinTek stopped-flow podczas pojedynczego eksperymentu mieszania.
Rysunek 4a. Kinetyka oddziaływania kompleksu Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T. Mieszanie dwuniciowego DNA (0,12 μM) zawierającego G:T sąsiednie z 2-aminopuryną z Msh2-Msh6 (0,8 μM) prowadzi do wzrostu fluorescencji w czasie i pozwala wyznaczyć bimolekularną stałą szybkości kON = 2,4 107 M-1s-1 dla tego oddziaływania.
Rycina 4b. Kinetyka oddziaływania Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T. Mieszanie wcześniej utworzonego kompleksu Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) z nadmiarem nieznakowanego DNA G:T (8 μM), który wychwytuje wolny Msh2-Msh6, prowadzi do spadku fluorescencji w czasie i pozwala wyznaczyć niską stałą szybkości dysocjacji, kOFF = 0.012 s-1, co wskazuje na stabilny kompleks o długim czasie połowicznego rozpadu wynoszącym ok. 60 sekund. Stężenia końcowe: 0.4 μM Msh2-Msh6, 0.06 μM znakowanego DNA, 4 μM nieznakowanego DNA G:T jako pułapka.
Rysunek 5. Przygotowanie MDCC-PBP. Analiza SDS-PAGE białka wiążącego fosforan (PBP) z E. coli, oczyszczonego i znakowanego fluoroforem MDCC.
Rysunek 6. Odpowiedź MDCC-PBP na fosforan. Miareczkowanie MDCC-PBP fosforanem (Pi) prowadzi do wzrostu fluorescencji MDCC.
Rysunek 7a. Przygotowanie krzywej standardowej dla fosforanu (Pi). MDCC-PBP (20 μM) miesza się z różnymi ilościami Pi (0 - 8 μM) i mierzy fluorescencję w czasie aż do osiągnięcia stanu równowagi. Stężenia końcowe: 10 μM MDCC-PBP, 0 - 4 μM Pi.
Rycina 7b. Przygotowanie krzywej standardowej fosforanów (Pi). Naniesiono maksymalną fluorescencję MDCC-PBP kontra [Pi] w celu uzyskania krzywej wzorcowej. Nachylenie linii (0.383 μM-1 (w tym przypadku) służy do przeliczenia fluorescencji MDCC-PBP na stężenie Pi.
Rycina 8a. Kinetyka ATPase Msh2-Msh6. Msh2-Msh6 (4 μM), wobec braku DNA G:T, po szybkim zmieszaniu z ATP (1 mM) i MDCC-PBP (20 μM) wykazuje gwałtowny wzrost (burst) hydrolizy ATP i uwalniania Pi. Analiza danych pozwala wyznaczyć szybkość (k hydrolysis = 1.4 s-1) oraz amplitudę (2 μM; 1 miejsce na Msh2-Msh6) fazy gwałtownej, po której następuje liniowa faza stanu stacjonarnego o szybkości 0,4 μM s-1 (kcat = 0.2 s-1).
Rysunek 8b. Kinetyka ATPase Msh2-Msh6. Dodanie DNA G:T do reakcji (6 μM) hamuje gwałtowny wzrost hydrolizy ATP, stabilizując kompleks w stanie związanym z ATP. Stężenia końcowe: 2 μM Msh2-Msh6, 500 μM ATP, 3 μM DNA, 10 μM MDCC-PBP. Kinetyka gwałtownego wzrostu została dopasowana do następującego równania: [Pi] = A0e-kt + Vt, gdzie [Pi] to stężenie fosforanu, A0 to amplituda gwałtownego wzrostu, k to obserwowana stała szybkości gwałtownego wzrostu, a V to prędkość fazy liniowej (kcat = V/[Msh2-Msh6]).
| Próbka | Białko | Kwas deoksyrybonukleinowy | ||||
| Odczynnik | Roztwór zapasowy | Praca | Tom, μL | Zapas | Praca | Tom, μL |
| Msh2-Msh6 | 5 μM | 0.8 μM | 64 | - | - | - |
| 2ApG:T | - | - | - | 10 μM | 0.12 μM | 4.8 |
| bufor | 10x | 1x | 40 | 10x | 1x | 40 |
| ddH2O2O | - | - | 296 | - | - | 355 |
| Suma | 400 | 400 | ||||
Tabela 1 Reakcja wiązania DNA
| Próbka | Białko | Białko-DNA | ATP | ||||||
| Odczynnik | Roztwór zapasowy | Praca | Tom, μL | Roztwór zapasowy | Praca | Tom, μL | Roztwór zapasowy | Praca | Tom, μL |
| Msh2-Msh6 | 20 μM | 4 μM | 80 | 20 μM | 4 μM | 80 | - | - | - |
| G:T | - | - | - | 100 | 6 | 24 | - | - | - |
| ATP | - | - | - | - | - | - | 50 mM | 1 mM | 8 |
| 7-MEG | 250x | 1x | 1.6 | 250x | 1x | 1.6 | 250x | 1x | 1.6 |
| PNPaza | 100x | 1x | 4 | 100x | 1x | 4 | 100x | 1x | 4 |
| PBP-MDCC | 150 μM | 20 μM | 53.3 | 150 μM | 20 μM | 53.3 | - | - | - |
| Bufor | 10x | 1x | 40 | 10x | 1x | 40 | 10x | 1x | 40 |
| ddH2O2O | - | - | 221 | - | - | 197 | - | - | 346 |
| Suma | 400 | 400 | 400 | ||||||
Tabela 2 Reakcja ATPase
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj przykład białka wiążącego niedopasowania DNA ilustruje potencjał i użyteczność metod kinetyki stanu nieustalonego w badaniu mechanizmów działania cząsteczek biologicznych. Pomiary metodą stopped-flow w skali czasu pojedynczego obrotu dostarczyły jednoznacznych dowodów na szybkie i specyficzne wiązanie białka Msh2-Msh6 do niedopasowanej pary zasad oraz tworzenie długotrwałego kompleksu białko X DNA w reakcji 9. Co więcej, analiza aktywności ATPase metodą stopped-flow (oraz quench-flow) dostarczyła...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez grant NSF CAREER Award (M.M.H), stypendium Barry M. Goldwater (F.N.B) oraz grant ASBMB Undergraduate Research Award (C.W.D). Klon do nadekspresji PBP został uprzejmie udostępniony przez dr. Martina Webba (MRC, UK).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 37 G | Sekwencja DNA: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’ | ||
| 37 T (2-Ap) | Sekwencja DNA: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’ | ||
| 37 T | Sekwencja DNA: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’ |
Bibliografia
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. Kinetic analysis of macromolecules. , Oxford University Press. (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
