optyczna mikroskopia rozproszenia oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora

1. Przygotowanie komórek

1. Komórki, które zostały posiane dzień wcześniej, muszą być oznaczone zielonym Mitotrackerem w celu obrazowania fluorescencyjnego mitochondriów.
2. Usuń 100 μM roztwór podstawowy Mitotracker green w DMSO przygotowanym wcześniej z zamrażarki 4°C i ogrzej ręką do temperatury pokojowej. Wyjąć również pożywkę do hodowli komórek śródbłonka aorty bydlęcej (BAEC), również wcześniej przygotowaną, i ogrzać do temperatury 37°C w łaźni wodnej na stole.
3. Po ogrzaniu Mitotrackera i pożywki hodowlanej umieść je w kapturze, upewniając się, że wysterylizowałeś ręce w rękawiczkach i wszystkie zewnętrzne powierzchnie pojemników 70% roztworem etanolu. Nie włączaj światła okapu, ponieważ etykieta fluorescencyjna jest wrażliwa na światło i szybko wybieli się w świetle otoczenia.
4. Uzyskanie odpowiedniego stężenia do znakowania mitochondriów jest bardzo ważne. Zbyt mała ilość nie oznaczy skutecznie mitochondriów, podczas gdy zbyt duża ilość Mitotrackera może mieć działanie toksyczne. Dobrze sprawdza się stężenie 100 nM Mitotrackera inkubowanego przez 45 minut z komórkami. Przygotuj to stężenie, dodając 100 μl materiału Mitotracker do 10 ml pożywki hodowlanej w probówce o pojemności 15 ml. To wystarczy na co najmniej jeden eksperyment.
5. Zastąp istniejącą pożywkę pożywką oznaczoną, odsysając starą pożywkę za pomocą pipety Pasteura podłączonej do przewodu próżniowego. Następnie natychmiast dodaj 2 ml oznakowanej pożywki do każdej zajętej pożywki w 6-dołkowej płytce.
6. Ponieważ etykieta fluorescencyjna jest wrażliwa na światło, należy szybko wymienić komórki w inkubatorze, nie wystawiając ich na bezpośrednie działanie światła w pomieszczeniu. Dobrze sprawdza się w tym przypadku przykrycie płytki 6-dołkowej rękami. Komórki pozostaną w inkubatorze przez 45 minut.

2. Przygotowanie konfiguracji optycznej

1. Podczas gdy komórki czekają w inkubatorze, musimy włączyć układ optyczny. W pomieszczeniu optycznym najpierw włącz lampę łukową rtęciową, a następnie komputer, mikroskop, kamery i laser. Następnie podłącz cyfrowe urządzenie z mikrolustrem (DMD) i obracający się dyfuzor.
2. Sprawdź, czy start optyczny jest wyrównany, patrząc przez okular mikroskopu, aby upewnić się, że pole view jest jasno oświetlone światłem lasera.
3. Wyczyść obiektyw, składając jeden kawałek papieru do soczewek w ciasny kwadrat i mocno chwyć hemostatem. Zanurz papier do soczewek w roztworze do czyszczenia szkła bez amoniaku, aby wchłonąć niewielką ilość papieru. Uderz hemostat kilka razy wolną ręką, aby usunąć nadmiar. Przetrzyj obiektyw, mocno przesuwając jednym czystym, ciągłym przesunięciem po obiektywie od jednego końca do drugiego, przechodząc przez soczewkę pośrodku. Nie przesuwaj ponownie ani nie szoruj. Wyrzuć zużyty papier.
4. Aby załadować próbkę, umieść siatkę na obiektywie zanurzonym w oleju 63x, upuszczając 1-2 małe krople olejku immersyjnego na obiektyw, gdy obiektyw jest całkowicie opuszczony. Następnie umieść siatkę na scenie. Następnie podnieś obiektyw tak, aby olej "złapał" próbkę. Ustaw ostrość próbki w okularze.
5. Aby wyrównać skraplacz, wyreguluj wysokość skraplacza tak, aby był wyrównany w centralnym oświetleniu Kohlera, skupiając sześciokątną krawędź ogranicznika pola skraplacza. Wyśrodkuj ogranicznik pola skraplacza nad polem view, jeśli to konieczne, obracając pokrętła centrujące skraplacza. Ogranicznik przysłony skraplacza powinien być zamknięty.
6. Uruchom program IPlab i wprowadź ustawienia, aby obsługiwać kamerę RoperScientific Cascade 512. Upewnij się, że aparat jest ustawiony w trybie przesyłania klatek. Uruchom podgląd na żywo, uruchamiając polecenie "Uzyskaj fokus". Ustaw prefiks indeksu i lokalizację pliku, w którym obrazy zostaną zapisane.
7. Uruchom program RSImage i wprowadź ustawienia, aby obsługiwać program CoolSnap. Tryb taktowania powinien być ustawiony na normalny.
8. Uruchom oprogramowanie DMD i umieść ciemne pole tęczówki w menu skryptu, a następnie polecenie "Załaduj i zresetuj" i uruchom skrypt.
9. Wyślij światło do kamery DMD i Cascade 512, ustawiając optovar mikroskopu i viewport na LSM. Spowoduje to wysłanie obrazu przez DMD i wyrównaną optykę, rzutując obraz DF na CCD. Obraz ciemnego pola (DF) powinien pojawić się na podglądzie na żywo, który jest już w toku w IPlab. W razie potrzeby wyreguluj precyzyjną ostrość mikroskopu, aby ustawić ostrość obrazu na podglądzie na żywo.
10. Zrób migawkę pola widzenia za pomocą polecenia "zdobądź pojedynczy". Ustaw czas naświetlania na tyle wysoki, aby zapewnić co najmniej 10000 zliczeń sygnału na obrazie. Po pobraniu użyj polecenia "zapisz jako zindeksowany", aby zapisać obraz na dysku. Ten obraz siatki mierzy rozmiar pola widzenia (FOV).
11. Teraz przesuń próbkę siatki tak, aby siatka znajdowała się poza polem widzenia, tak aby widoczne było tylko tło. Uzyskaj obraz tła pola przy wystarczająco długim czasie ekspozycji, aby upewnić się, że uzyskano co najmniej 5000 zliczeń sygnału. Ten obraz pomoże w odejmowaniu tła od niefiltrowanych obrazów.

3. Wczytywanie banku filtrów i używanie konfiguracji do pobierania obrazów z filtrowanym tłem

1. Teraz musimy pozyskać obrazy tła przefiltrowane przez Gabora. Załaduj skrypt banku filtrów Gabor do oprogramowania sterującego DMD. Uruchom cały skrypt, aby zbuforować filtry w pamięci wbudowanej DMD; Może to potrwać kilka minut.
2. Po zbuforowaniu całego skryptu możemy teraz pobrać przefiltrowane obrazy tła. Użyj znaczników start i stop w oprogramowaniu DMD, aby poinstruować DMD, aby załadował tylko jeden zestaw filtrów odpowiadających jednemu filtrowi podobnemu do Gabora na raz i uruchom skrypt. Podgląd obrazu na żywo powinien zmienić się z ciemnego pola na przefiltrowany obraz dla tego filtra.
3. Otwórz skrypt akwizycji w IPlab z dysku. Dostosuj czas ekspozycji, aby upewnić się, że odbieranych jest co najmniej 2000 zliczeń sygnału. Gdy skrypt DMD jest uruchomiony, anuluj podgląd na żywo w IPlab i uruchom skrypt akwizycji. Spowoduje to automatyczne pobranie, zindeksowanie i zapisanie przefiltrowanego obrazu na dysku.
4. Po pobraniu pierwszego obrazu zatrzymaj skrypt uruchomiony w oprogramowaniu DMD i usuń użyte polecenia ze skryptu. Wymień znaczniki startu i końca na początku i na końcu następnego zestawu filtrów. Powtórz akwizycję w IPlab.
5. Powtarzaj krok 3.4, aż cały bank filtrów zostanie wykorzystany, a wszystkie przefiltrowane obrazy zostaną pobrane i zapisane.

4. Poszycie komórek

1. Do tej pory komórki będą wkrótce gotowe do pokrycia płytką do eksperymentu. Podłącz lutownicę na blacie laboratoryjnym. Usuń medium L15 i podgrzej do 37°C. Przygotuj stanowisko pracy z ręcznikiem papierowym i chusteczką Kimwipe. Zrób kilka, rozrywając i obracając chusteczki Kimwipe. pomogą w przenoszeniu płynu do i z płytki ogniwa.
2. Następnie musimy pokryć próbkę. Używamy obrabianych maszynowo metalowych uchwytów na próbki do powlekania naszych komórek, tworząc "kanapkę nakrywkową" z metalową płytką pomiędzy. Nałóż cienką kulkę smaru próżniowego ze strzykawki na górny obwód otworu w metalowej płytce, rozciągając się mniej więcej w połowie do końców rowków po każdej stronie. Delikatnie dociśnij czyste szkiełko nakrywkowe nr 1 do smaru. Odwróć płytkę i nałóż smar wokół otworu. Wyłącz światła w pokoju.
3. Teraz pobieramy komórki z inkubatora, obchodząc się z zawartością inkubatora za pomocą nitrylowych rękawiczek diagnostycznych wysterylizowanych 70% etanolem. Wyjąć płytkę komórkową z inkubatora, wstrzymując oddech, gdy drzwi inkubatora są otwarte. Uważaj, aby zminimalizować ekspozycję na światło w pomieszczeniu.
4. Usuń szkiełko nakrywkowe, które zostanie użyte w eksperymencie z płytki sześciodołkowej, zwracając uwagę, że strona, która była zadrukowana w studzince, jest stroną z przyczepionymi komórkami. Ostrożnie wysusz szkiełko nakrywkowe po obu stronach, aż będzie prawie całkowicie suche, jednocześnie śledząc, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się komórki. Następnie wciśnij szkiełko nakrywkowe, stroną z komórką do dołu, w natłuszczoną metalową płytkę nad otworem widokowym, upewniając się, że w warstwie smaru nie pozostały żadne szczeliny powietrzne. Smar musi tworzyć wodoszczelne uszczelnienie, aby umożliwić nam załadowanie ogniw medium L15. Gdy będziesz tego pewien, odwróć talerz z powrotem.
5. Odpipetować pożywkę L15 do platerowanych komórek, przetłaczając płyn przez rowek między górnym szkiełkiem nakrywkowym a metalową płytką. Pipetowanie 200 μl na raz działa dobrze. Pipeta o pierwszej objętości powinna wypełnić przestrzeń umieszczoną między szkiełkami nakrywkowymi płynem sięgającym prawie do rowka po drugiej stronie.
6. Odpipetować kolejne 200 μl pożywki do posianych komórek, ale tym razem przytrzymać w przeciwległym rowku, tak aby pożywka przepłynęła z jednej strony na drugą. Spowoduje to umycie komórek i usunięcie wszelkich śladów starego podłoża. Na tym etapie należy uważać, aby w cieczy nie tworzyły się pęcherzyki. Powtórz ten proces 2-3 razy, używając nowego do każdego płukania.
7. Pamiętasz lutownicę, którą podłączyliśmy? Teraz jest czas, aby się do tego przyzwyczaić. Ponownie odwróć płytkę do góry nogami, podpierając ją od krawędzi, tak aby płyn został uwięziony w zbiorniku ogniwa i nie mógł spłynąć. Zanurz lutownicę w zlewce Valap. Spowoduje to szybkie stopienie części walca, który następnie przylgnie do końcówki lutownicy. Ostrożnie nałóż stopiony valap wokół krawędzi dolnego szkiełka nakrywkowego (które jest teraz skierowane do góry), używając końcówki lutownicy jako aplikatora. Kontynuuj zanurzanie i nakładanie, aż przejdziesz przez cały obwód szkiełka nakrywkowego, uszczelniając szkiełko nakrywkowe do metalowej płytki.
8. Na dolnym szkiełku nakrywkowym rosną komórki, a po odsłoniętej stronie mogą znajdować się pozostałości wysuszonego podłoża. Usuń wszelkie pozostałości z powierzchni szkiełka nakrywkowego, zwijając Kimwipe i czyszcząc szkiełko nakrywkowe jednym ruchem, podobnie jak w przypadku czyszczenia obiektywu. Gwarantuje to, że szkiełko nakrywkowe jest najczystsze w środku, w którym będzie oglądane.
9. Odłącz lutownicę i włóż 6-dołkową płytkę z powrotem do inkubatora, przestrzegając tych samych procedur hermetyczności i sterylności. Zanieś platerowane ogniwa do laboratorium optycznego i zamontuj na obiektywie zgodnie z opisem w krokach 2.4 i 2.5.

5. Przeprowadzanie eksperymentu

1. Znajdź ładne pole zdrowo wyglądających komórek.
2. Uzyskaj obraz pola widzenia w ciemnym polu. Ustaw mikroskop pod kątem różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i uzyskaj obraz DIC. Upewnij się, że czasy ekspozycji są wystarczająco długie, aby zapewnić odpowiedni sygnał.
3. Teraz musimy pozyskać obrazy fluorescencyjne na drugim aparacie. Aby uzyskać obrazy DIC na CoolSnap, używamy niebieskiej diody LED przymocowanej do kondensatora, wymieniając ją i usuwając w razie potrzeby. Podczas gdy mikroskop jest nadal ustawiony w trybie DIC, wyślij światło do CoolSnap, ustawiając optovar mikroskopu na 1.0x i viewport na 100% lornetki. Przekieruj obraz z okularu do aparatu. Umieść diodę LED nad kondensatorem, aby oświetlić pole i wyświetlić podgląd pola widzenia w RSimage i w razie potrzeby wyreguluj precyzyjną ostrość. Pobierz obraz DIC i zapisz go na dysku. Zwróć uwagę, jak różni się pole widzenia od tego uzyskanego z kamery Cascade. Obrazy te będą musiały zostać zarejestrowane w fazie analizy po eksperymencie.
4. Uzyskaj obraz fluorescencji, dostosowując kostkę filtra do kostki filtra fluoresceiny. Uzyskaj obraz, na krótko włączając wzbudzenie fluorescencji za pomocą mikroskopu, a następnie wyłącz je, gdy tylko akwizycja zostanie zakończona. Ponieważ skupiliśmy próbkę w DIC, obraz fluorescencyjny również jest zogniskowany. Oszczędza to czas naświetlania we fluorescencji, spowalniając w ten sposób fotowybielanie. Zapisz obraz fluorescencji na dysku.
5. Teraz musimy zdobyć przefiltrowane obrazy. Zresetuj mikroskop do ciemnego pola i ponownie wyślij światło przez port LSM, jak w 2.9.
6. Uruchom cały skrypt banku filtrów Gabora, tak jak w 3.3-3.5. Zakończyliśmy już proces pozyskiwania danych dla jednego punktu czasowego.

6. Zmiana pożywki w celu wystawienia komórek na działanie staurosporyny (STS) i utrzymanie pożywki przez cały czas trwania eksperymentu

1. Gdy komórki są nadal na scenie i nie zakłócają pola widzenia, zamień zwykłą pożywkę L-15 na taką samą, zawierającą 1 μM roztwór STS wykonany z 4 mM roztworu podstawowego STS w DMSO. Użyj metody odprowadzania wilgoci opisanej w krokach 4.6, aby przełączyć nośnik.
2. Teraz powtarzamy kroki 5.2-5.6 dla kolejnych punktów czasowych. Powtarzamy ten proces, aż eksperyment zostanie zakończony.
3. W trakcie eksperymentu trzeba będzie dodać więcej pożywki, aby próbka nie wyschła. Osiąga się to poprzez pipetowanie pożywki do rowka płytki celi bez zdejmowania ze sceny i bez naruszania pola widzenia.

7. Reprezentatywne wyniki

Na zakończenie eksperymentu, zebrane dane będą zawierały dużą liczbę przefiltrowanych obrazów, które muszą zostać przetworzone w celu wyodrębnienia subkomórkowych danych strukturalnych. Pokazano dwa przykłady dla zespołu filtrów optycznych składającego się z 9 filtrów podobnych do Gabora z okresem filtracji S = 0,95 μm, odchyleniem standardowym obwiedni Gaussa s = S / 2 = 0,45 μm i orientacjami Φ = 0 ° do Φ = 160 ° w krokach co 20 °. (Patrz również [1] po więcej szczegółów).

Przykład 1: Okrzemki morskie

Najpierw zastosowaliśmy nasz wrażliwy na orientację bank filtrów do próbki morskich okrzemek (Carolina Biological Supply Company) z cechami zorientowanymi, które były wyraźnie widoczne w obrazowaniu ciemnego pola (DF) (Rys. 1). Optycznie przefiltrowane obrazy są wyświetlane obok niefiltrowanego obrazu próbki w celu porównania.

Rysunek 1: Ciemne pole (DF) i optycznie przefiltrowany obraz okrzemek morskich. Przeanalizujemy okrzemkę w prawym dolnym rogu obrazu (biała strzałka w skrajnym lewym panelu).

Zestaw dziewięciu obrazów okrzemki przefiltrowanych przez Gabora został przetworzony piksel po pikselu pod kątem orientacji i zaokrąglenia obiektu. Przetwarzanie polegało na (1) zsumowaniu zmierzonych odpowiedzi wszystkich dziewięciu obrazów przefiltrowanych przez Gabora w każdym pikselu w celu określenia ogólnej wielkości odpowiedzi sygnału, kodując w ten sposób istotność odpowiedzi, oraz (2) znalezieniu orientacji filtra Gabora, Φ, przy której odpowiedź jest maksymalizowana, i uwzględnieniu stosunku tej maksymalnej odpowiedzi do średniej odpowiedzi dla wszystkich kątów, kodując w ten sposób stopień, w jakim obiekty w każdym pikselu mają preferowaną orientację. Stopień orientacji jest ściśle związany ze współczynnikiem geometrycznym cząstki. Na rys. 2B ogólna reakcja piksela na bank filtrów (parametr 1) oraz stopień orientacji lub proporcje (parametr 2) są zakodowane odpowiednio w nasyceniu i odcieniu kolorów. Współczynnik proporcji bliski 1 (niebieski) występuje w obszarach, w których nie ma preferowanego kąta reakcji, podczas gdy większe wartości (czerwony) wskazują obszary, w których występuje wyższy preferowany kąt reakcji. Orientacja cząstek podbudowy jest zakodowana na wykresie kołczanu (rys. 2C), gdzie każda linia ściśle pokrywa się z leżącą poniżej lokalną orientacją obiektu widoczną w niefiltrowanym ciemnym polu (rys. 2A).

Rysunek 2: A: Ciemne pole obrazu okrzemki. B: Obraz orientacji obiektu. Skala kolorów wskazuje stopień orientacji (współczynnik proporcji), podczas gdy jasność koduje znaczenie całkowitej odpowiedzi filtra Gabora. C: Orientacja obiektów o intensywności odpowiedzi ≥10% maksimum. Segment linii wskazuje długą oś odpowiedniej konstrukcji.

Przykład 2: Komórki apoptotyczne

Tutaj pokazujemy przefiltrowane obrazy komórek śródbłonka bydlęcego leczonych staurosporyną (STS), które zostały przetworzone w taki sam sposób jak okrzemka. Ryc. 3 przedstawia niefiltrowany obraz komórek w ciemnym polu (DF) wraz z dziewięcioma przefiltrowanymi obrazami w czasie T=-180 minut przed leczeniem STS.

Rysunek 3: Ciemne pole (DF) i optycznie przefiltrowane obrazy pola zawierającego kilka żywych komórek śródbłonka.

Przefiltrowane obrazy były następnie rejestrowane co 20 minut przez okres trzech godzin po leczeniu STS. Rys. 4a przedstawia mapę proporcji komórek w funkcji czasu. W tym przypadku odcień koloru reprezentuje stopień orientacji (oznaczony orientacyjnością), jak w przypadku odcienia koloru na rys. 2b powyżej. Jednak jasność współczynnika proporcji nie była ważona przez średnią reakcję filtra. Rejestrując nasze mapy proporcji z obrazami fluorescencyjnymi znakowanych mitochondriów w tych komórkach (ryc. 4b), ustaliliśmy, że zmierzony spadek proporcji był ograniczony do regionów komórkowych zawierających mitochondria i towarzyszył fragmentacji mitochondriów, którą można było zaobserwować bezpośrednio na obrazach fluorescencyjnych tych samych komórek. Rys. 5 przedstawia wykresy czasowe przedstawiające zmianę proporcji w funkcji czasu w komórkach ulegających apoptozie. W każdej komórce następuje spadek proporcji przy T = 60-100 min w regionach, które rejestrują się w mitochondriach fluorescencyjnych, ale nie w regionach, które rejestrują się w obszarach fluorescencji o słabym tle.

Rysunek 4: Proporcje (a) i fluorescencja (b) obrazy komórek śródbłonka leczonych induktorem apoptozy, staurosporyną.

Rysunek 5: Wykresy czasowe porównujące spadek proporcji cząstek (orientacji) w komórkach śródbłonka leczonych staurosporyną. Poszczególne ślady reprezentują wykresy czasowe w pojedynczych komórkach. Spadek orientacji jest ograniczony do regionów komórek, które rejestrują się w mitochondriach fluorescencyjnych (lewy panel) i jest nieobecny w pozostałych obszarach fluorescencji tła (prawy panel).

Teraz, gdy ustaliliśmy, że spadek proporcji odpowiada fragmentacji mitochondriów, możemy wywołać apoptozę w tych komórkach, zmierzyć fragmentację za pomocą naszej metody rozpraszania optycznego bez konieczności oznaczania komórek i badać wpływ różnych warunków genetycznych i eksperymentalnych na tę dynamikę.

Niektóre aspekty metod zostały zawarte w ujawnieniu wynalazku, Rutgers University Docket # 09-049.