Mikroskopia rozproszeniowa optyczna oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora

Podsumowanie

Prezentujemy metodę mikroskopii w ciemnym polu opartą na filtrowaniu typu Gabora do pomiaru dynamiki subkomórkowej w pojedynczych żywych komórkach. Technika ta jest czuła na zmiany w strukturze organelli, takie jak fragmentacja mitochondriów.

Streszczenie

Prezentujemy instrument mikroskopowy, który pozwala na pomiar tekstury subkomórkowej wynikającej z morfologii i organizacji organelli w niebarwionych żywych komórkach. Proponowane urządzenie zwiększa czułość bezznakowej mikroskopii optycznej na nanoskalowe zmiany wielkości i kształtu organelli i może być wykorzystane do przyspieszenia badań nad związkiem między strukturą a funkcją w odniesieniu do dynamiki organelli leżącej u podstaw fundamentalnych procesów biologicznych, takich jak programowana śmierć komórki czy różnicowanie komórkowe. Mikroskop ten można łatwo zaimplementować na istniejących platformach mikroskopowych, dzięki czemu może on zostać udostępniony poszczególnym laboratoriom, w których naukowcy będą mogli wdrażać i stosować proponowane metody przy nieograniczonym dostępie.

Proponowana technika umożliwia charakteryzację struktur wewnątrzkomórkowych poprzez obserwację komórki za pomocą dwuwymiarowych optycznych filtrów Gabora. Filtry te mogą być dostrojone tak, aby z czułością nanometryczną (rzędu 10 nm) wykrywać specyficzne cechy morfologiczne związane z rozmiarem i orientacją niesferycznych organelli wewnątrzkomórkowych. Choć metoda ta opiera się na kontraście generowanym przez rozpraszanie sprężyste, nie wymaga ona szczegółowego modelu odwrotnego rozpraszania ani teorii Mie do wyznaczenia pomiarów morfometrycznych. Technika ta znajduje więc zastosowanie w przypadku organelli niesferycznych, dla których trudno jest podać precyzyjny teoretyczny opis rozpraszania, i dostarcza charakterystycznych parametrów morfometrycznych, które można uzyskać w niebarwionych żywych komórkach w celu oceny ich funkcji. Przewagą tej metody nad cyfrowym przetwarzaniem obrazu jest to, że operuje ona bezpośrednio na transformacie pola obiektu, a nie na dyskretyzowanej intensywności obiektu. Nie wymaga ona wysokiej częstotliwości próbkowania obrazu, co pozwala na szybki screening aktywności morfologicznej w setkach komórek jednocześnie, znacznie ułatwiając badanie struktury organelli poza zakresem pojedynczej segmentacji i rekonstrukcji organelli za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej obrazów cyfrowych o dużym powiększeniu i ograniczonym polu widzenia.

W niniejszej prezentacji przedstawiamy dane pochodzące z morskiej okrzemki, aby zilustrować zastosowaną metodologię. Prezentujemy również wstępne dane zebrane z żywych komórek, aby ukazać sposób zastosowania tej metody w odpowiednim kontekście biologicznym.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Komórki wysiane dzień wcześniej należy oznakować barwnikiem Mitotracker green w celu obrazowania fluorescencyjnego mitochondriów.
2. Wyjąć z zamrażarki (4°C) wcześniej przygotowany roztwór stokowy Mitotracker green o stężeniu 100 μM w DMSO i ogrzać go w dłoni do temperatury pokojowej. Należy również wyjąć wcześniej przygotowaną pożywkę do hodowli komórek endotelialnych aorty bydlęcej (BAEC) i ogrzać ją do 37°C w kąpieli wodnej.
3. Po ogrzaniu Mitotrackera i pożywki należy umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza, pamiętając o wysterylizowaniu rękawiczek oraz wszystkich zewnętrznych powierzchni pojemników 70% roztworem etanolu. Nie należy włączać oświetlenia w komorze, ponieważ znacznik fluorescencyjny jest światłoczuły i ulegnie szybkiemu fotoblaknięciu w świetle pokojowym.
4. Kluczowe jest przygotowanie odpowiedniego stężenia do znakowania mitochondriów. Zbyt mała ilość nie oznakuje mitochondriów skutecznie, natomiast nadmiar Mitotrackera może wywołać efekty toksyczne. Dobrym rozwiązaniem jest zastosowanie stężenia 100 nM Mitotrackera i inkubacja z komórkami przez 45 minut. Stężenie to przygotowuje się poprzez dodanie 100 μL roztworu stokowego Mitotrackera do 10 mL pożywki w probówce 15 mL. Taka ilość będzie wystarczająca na co najmniej jeden eksperyment.
5. Istniejącą pożywkę należy zastąpić pożywką z znacznikiem, odsysając starą pożywkę za pomocą pipety Pasteura podłączonej do linii próżniowej. Następnie należy niezwłocznie dodać 2 mL pożywki z znacznikiem do każdego zajętego dołka w płytce 6-dołkowej.
6. Ze względu na światłoczułość znacznika fluorescencyjnego, komórki należy szybko przenieść do inkubatora, unikając bezpośredniej ekspozycji na światło pokojowe. W tym celu skuteczne jest zasłonięcie płytki 6-dołkowej dłońmi. Komórki powinny pozostawać w inkubatorze przez 45 minut.

2. Przygotowanie układu optycznego

1. Podczas gdy komórki oczekują w inkubatorze, należy uruchomić układ optyczny. W pomieszczeniu optycznym najpierw włącz lampę łukową rtęciową, a następnie komputer, mikroskop, kamery i laser. Następnie podłącz cyfrowe urządzenie mikrolusterkowe (DMD) oraz wirujący dyfuzor.
2. Sprawdź, czy wiązka optyczna jest wyrównana, patrząc przez okular mikroskopu, aby upewnić się, że pole widzenia jest jasno oświetlone światłem lasera.
3. Wyczyść obiektyw, składając kawałek papieru do soczewek w ciasny kwadrat i mocno chwytając go kleszczykami hemostatycznymi. Zanurz papier do soczewek w bezamoniakalnym roztworze do czyszczenia szkła, aby wchłonęła się niewielka ilość płynu. Kilkukrotnie uderz kleszczykami o wolną dłoń, aby usunąć nadmiar cieczy. Przetrzyj obiektyw, wykonując jeden zdecydowany, ciągły ruch od jednego końca do drugiego, przechodząc przez soczewkę w środku. Nie powtarzaj ruchu ani nie szoruj. Zużyty papier wyrzuć.
4. Aby załadować próbkę, umieść siatkę pomiarową nad obiektywem imersyjnym 63x, nakładając 1-2 małe krople oleju imersyjnego na obiektyw, gdy jest on całkowicie opuszczony. Następnie umieść siatkę pomiarową na stoliku. Unieś obiektyw tak, aby olej „złapał” próbkę. Ustaw ostrość próbki w okularze.
5. Aby wyrównać kondensor, dostosuj jego wysokość tak, aby uzyskać centralne oświetlenie Köhlera, ustawiając ostrość na sześciokątną krawędź przysłony pola kondensora. Jeśli to konieczne, wycentruj przysłonę pola kondensora względem pola widzenia, obracając pokrętłami centrującymi kondensora. Przysłona apertury kondensora powinna być zamknięta.
6. Uruchom program IPlab i wprowadź ustawienia dla kamery RoperScientific Cascade 512. Potwierdź, że kamera jest ustawiona w trybie transferu klatek (frame transfer mode). Uruchom podgląd na żywo, wykonując polecenie „Acquire focus”. Ustaw prefiks indeksu oraz lokalizację plików, w której zapisywane będą obrazy.
7. Uruchom program RSImage i wprowadź ustawienia dla programu CoolSnap. Tryb taktowania (clocking mode) powinien być ustawiony na normalny.
8. Uruchom oprogramowanie DMD i wybierz irys pola ciemnego (dark field iris) z menu skryptów, a następnie wykonaj polecenie „Load and Reset” i uruchom skrypt.
9. Przekieruj światło do DMD i kamery Cascade 512, ustawiając optovar mikroskopu i okular obserwacyjny na LSM. Spowoduje to przesłanie obrazu przez DMD i wyrównaną optykę, rzutując obraz DF na detektor CCD. Obraz w ciemnym polu (DF) powinien pojawić się w podglądzie na żywo w programie IPlab. Jeśli to konieczne, dostosuj ostrość mikroskopu, aby wyostrzyć obraz w podglądzie na żywo.
10. Wykonaj migawkę pola widzenia za pomocą polecenia „acquire single”. Ustaw czas ekspozycji na tyle wysoki, aby zapewnić co najmniej 10000 zliczeń sygnału w obrazie. Po akwizycji użyj polecenia „save as indexed”, aby zapisać obraz na dysku. Ten obraz siatki pomiarowej służy do pomiaru rozmiaru pola widzenia (FOV).
11. Teraz przesuń próbkę z siatką tak, aby siatka znajdowała się poza polem widzenia (FOV), tak aby widoczne było tylko tło. Wykonaj obraz tła pola przy wystarczająco długim czasie ekspozycji, aby zapewnić pozyskanie co najmniej 5000 zliczeń sygnału. Obraz ten pomoże w odjęciu tła z obrazów niefiltrowanych.

3. Załadunek banku filtrów i wykorzystanie układu do pozyskiwania obrazów tła z filtrowaniem

1. Następnie należy pozyskać obrazy tła przefiltrowane filtrem Gabora. Wczytaj skrypt banku filtrów Gabora do oprogramowania sterującego DMD. Uruchom cały skrypt, aby zbuforować filtry w pamięci pokładowej DMD; może to zająć kilka minut.
2. Po zbuforowaniu całego skryptu można przystąpić do pozyskiwania przefiltrowanych obrazów tła. Użyj znaczników startu i stopu w oprogramowaniu DMD, aby polecić urządzeniu ładowanie tylko jednego zestawu filtrów odpowiadającego jednemu filtrowi typu Gabora w danym czasie, a następnie uruchom skrypt. Podgląd obrazu na żywo powinien zmienić się z ciemnego pola na obraz przefiltrowany przez dany filtr.
3. Otwórz z dysku skrypt akwizycji w programie IPlab. Dostosuj czas ekspozycji tak, aby pozyskiwany sygnał wynosił co najmniej 2000 counts. Podczas działania skryptu DMD anuluj podgląd na żywo w IPlab i uruchom skrypt akwizycji. Spowoduje to automatyczne pozyskanie, indeksację i zapisanie przefiltrowanego obrazu na dysku.
4. Po pozyskaniu pierwszego obrazu zatrzymaj skrypt działający w oprogramowaniu DMD i usuń użyte polecenia ze skryptu. Przesuń znaczniki startu i stopu na początek i koniec następnego zestawu filtrów. Powtórz akwizycję w IPlab.
5. Powtarzaj krok 3.4 do momentu wykorzystania całego banku filtrów oraz pozyskania i zapisania wszystkich przefiltrowanych obrazów.

4. Wysiewanie komórek

1. W tym momencie komórki będą wkrótce gotowe do osadzenia na płytce do eksperymentu. Podłącz lutownicę do gniazda na blacie laboratoryjnym. Wyjmij podłoże obserwacyjne L15 i podgrzej je do 37°C. Przygotuj stanowisko pracy, kładąc ręcznik papierowy i chusteczkę Kimwipe. Wykonaj kilka knotów, rozdzierając i skręcając chusteczki Kimwipe. Knoty ułatwią przenoszenie cieczy do i z płytki z komórkami.
2. Następnie należy osadzić próbkę. Do osadzania komórek używamy obrabianych mechanicznie metalowych uchwytów na próbki, tworząc „kanapkę z lamellką” z płytką metalową pomiędzy nimi. Za pomocą strzykawki nałóż cienką warstwę smaru próżniowego wokół górnego obwodu otworu w płytce metalowej, prowadząc go mniej więcej do połowy długości rowków po każdej stronie. Delikatnie dociśnij czystą lamellkę nr 1 do smaru. Odwróć płytkę i nałóż smar wokół otworu. Zgaś światła w pomieszczeniu.
3. Teraz wyjmij komórki z inkubatora, posługując się zawartością inkubatora w nitrylowych rękawiczkach egzaminacyjnych wysterylizowanych 70% etanolem. Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora, wstrzymując oddech podczas otwarcia drzwi inkubatora. Należy uważać, aby zminimalizować ekspozycję na światło pokojowe.
4. Wyjmij z płytki 6-dołkowej lamellkę, która będzie użyta w eksperymencie, pamiętając, że stroną z przytwierdzonymi komórkami jest ta, która była skierowana ku górze w dołku. Ostrożnie osusz lamellkę z obu stron, aż będzie prawie całkowicie sucha, kontrolując, która strona lamellki zawiera komórki. Następnie dociśnij lamellkę stroną z komórkami do dołu do nasmarowanej płytki metalowej nad otworem obserwacyjnym, upewniając się, że w warstwie smaru nie pozostały pęcherzyki powietrza. Smar musi tworzyć wodoszczelną uszczelkę, aby umożliwić załadowanie komórek podłożem L15. Po upewnieniu się co do szczelności, odwróć płytkę z powrotem.
5. Pipetuj podłoże L15 do osadzonych komórek, wtłaczając ciecz przez rowek między górną lamellką a płytką metalową. Dobrze sprawdza się pipetowanie porcjami po 200 μL. Pierwsza objętość powinna wypełnić przestrzeń między lamellkami tak, aby ciecz dotarła prawie do rowka po drugiej stronie.
6. Pipetuj kolejne 200 μL podłoża do osadzonych komórek, ale tym razem przytrzymaj knot przy przeciwległym rowku, aby podłoże przepłynęło z jednej strony na drugą. Pozwala to na wypłukanie komórek i usunięcie wszelkich pozostałości starego podłoża. Należy uważać, aby podczas tego kroku w cieczy nie powstały pęcherzyki powietrza. Powtórz ten proces 2-3 razy, używając nowego knotu do każdego płukania.
7. Pamiętasz lutownicę, którą podłączyliśmy? Teraz nadszedł czas na jej użycie. Ponownie odwróć płytkę do góry dnem, podtrzymując ją za krawędzie, aby ciecz pozostała w zbiorniku z komórkami i nie wyciekła. Zanurz lutownicę w zlewce z valapem. Spowoduje to szybkie stopienie części valapu, który przylgnie do grota lutownicy. Ostrożnie nałóż stopiony valap wokół krawędzi dolnej lamellki (która jest teraz skierowana ku górze), używając grota lutownicy jako aplikatora. Powtarzaj zanurzanie i nakładanie, aż obejdziesz cały obwód lamellki, uszczelniając ją z płytką metalową.
8. Na dolnej lamellce rosną komórki i na odsłoniętej stronie mogą znajdować się pozostałości wyschniętego podłoża. Usuń wszelkie osady z powierzchni lamellki, zwijając chusteczkę Kimwipe w kulkę i czyszcząc lamellkę jednym przesuwanym ruchem, podobnie jak podczas czyszczenia obiektywu. Zapewnia to największą czystość lamellki w centrum, gdzie będzie prowadzona obserwacja.
9. Odłącz lutownicę i zwróć płytkę 6-dołkową do inkubatora, przestrzegając tych samych procedur izolacji i sterylności. Przenieś osadzone komórki do laboratorium optycznego i zamontuj na obiektywie zgodnie z opisem w krokach 2.4 i 2.5.

5. Przeprowadzenie eksperymentu

1. Znajdź odpowiednie pole widzenia z komórkami o zdrowym wyglądzie.
2. Wykonaj obraz w ciemnym polu dla danego pola widzenia. Ustaw mikroskop w trybie kontrastu interferencyjnego (DIC) i wykonaj obraz DIC. Upewnij się, że czasy ekspozycji są wystarczająco długie, aby zapewnić odpowiedni sygnał.
3. Następnie należy wykonać obrazy fluorescencyjne za pomocą drugiej kamery. Aby uzyskać obrazy DIC w kamerze CoolSnap, używamy niebieskiej diody LED przymocowanej do kondensora, montując ją i demontując w razie potrzeby. Gdy mikroskop jest nadal ustawiony w trybie DIC, skieruj światło do CoolSnap, ustawiając optovar mikroskopu na 1.0x, a viewport na 100% binocular. Przekieruj obraz z okularu do kamery. Umieść diodę LED nad kondensorem, aby oświetlić pole, i podejrzyj pole widzenia (FOV) w programie RSimage, a następnie w razie potrzeby dostrój ostrość. Wykonaj obraz DIC i zapisz go na dysku. Zwróć uwagę, że pole widzenia różni się od tego uzyskanego z kamery Cascade. Obrazy te będą musiały zostać zarejestrowane podczas fazy analizy po zakończeniu eksperymentu.
4. Uzyskaj obraz fluorescencyjny, ustawiając kostkę filtru na filtr do fluoresceiny. Wykonaj obraz, krótko włączając wzbudzenie fluorescencji w mikroskopie, a następnie wyłącz je natychmiast po zakończeniu akwizycji. Ponieważ próbka została ustawiona w ostrości w trybie DIC, obraz fluorescencyjny również jest ostry. Pozwala to skrócić czas ekspozycji w fluorescencji, co spowalnia fotoblaknięcie. Zapisz obraz fluorescencyjny na dysku.
5. Teraz należy wykonać obrazy filtrowane. Przywróć ustawienia mikroskopu do ciemnego pola i ponownie skieruj światło przez port LSM, zgodnie z punktem 2.9.
6. Uruchom cały skrypt banku filtrów Gabora, zgodnie z punktami 3.3-3.5. W ten sposób zakończono akwizycję danych dla jednego punktu czasowego.

6. Wymiana pożywki w celu poddania komórek działaniu staurosporyny (STS) oraz utrzymanie pożywki przez cały czas trwania eksperymentu

1. Podczas gdy komórki znajdują się nadal na stoliku i bez naruszania pola widzenia, należy wymienić zwykłe pożywkę L-15 na taką samą zawierającą 1 μM roztwór STS, przygotowany z roztworu stokowego STS o stężeniu 4 mM w DMSO. Do wymiany pożywek należy zastosować metodę knotowania opisaną w krokach 4.6.
2. Następnie powtarzamy kroki 5.2-5.6 dla kolejnych punktów czasowych. Proces ten powtarzamy aż do zakończenia eksperymentu.
3. W trakcie eksperymentu konieczne będzie dodawanie kolejnych porcji pożywki, aby zapobiec wysychaniu próbki. Odbywa się to poprzez pipetowanie pożywki do rowka płytki komórkowej bez zdejmowania jej ze stolika i bez naruszania pola widzenia.

7. Reprezentatywne wyniki

Po zakończeniu eksperymentu zebrane dane będą obejmować dużą liczbę przefiltrowanych obrazów, które muszą zostać przetworzone w celu wyodrębnienia danych o strukturze subkomórkowej. Przedstawiono dwa przykłady dla banku filtrów optycznych składającego się z 9 filtrów typu Gabor o okresie filtra S=0.95μm, odchyleniu standardowym obwiedni Gaussa s=S/2=0.45μm oraz orientacjach od Φ=0° do Φ=160° w odstępach 20°. (Więcej szczegółów znajduje się w [1]).

Przykład 1: Okrzemka morska

W pierwszej kolejności zastosowaliśmy nasz bank filtrów wrażliwych na orientację do próbki okrzemki morskiej (Carolina Biological Supply Company) z orientowanymi cechami, które były wyraźnie widoczne w obrazowaniu w ciemnym polu (DF) (Rys. 1). Obrazy przefiltrowane optycznie przedstawiono obok nieprzefiltrowanego obrazu próbki w celu porównania.

Rysunek 1: Obraz okrzemek morskich w ciemnym polu (DF) oraz obraz z filtrowaniem optycznym. Przeanalizujemy okrzemkę znajdującą się w prawym dolnym rogu obrazu (biała strzałka na najbardziej lewym panelu).

Zestaw dziewięciu obrazów okrzemki przefiltrowanych filtrami Gabora został przetworzony piksel po pikselu pod kątem orientacji i zaokrąglenia obiektów. Przetwarzanie składało się z (1) sumowania zmierzonych odpowiedzi wszystkich dziewięciu obrazów przefiltrowanych filtrami Gabora w każdym pikselu w celu określenia całkowitej amplitudy odpowiedzi sygnału, co pozwoliło zakodować istotność odpowiedzi, oraz (2) znalezienia orientacji filtra Gabora, Φ, przy której odpowiedź jest maksymalna i obliczenia stosunku tej maksymalnej odpowiedzi do średniej odpowiedzi dla wszystkich kątów, co pozwoliło zakodować stopień, w jakim obiekty w każdym pikselu mają preferowaną orientację. Stopień orientacji jest ściśle powiązany z geometrycznym współczynnikiem kształtu cząstki. Na rys. 2B całkowita odpowiedź piksela na bank filtrów (parametr 1) oraz stopień orientacji lub współczynnik kształtu (parametr 2) są zakodowane odpowiednio w nasyceniu i odcieniu kolorów. Współczynnik kształtu bliski 1 (kolor niebieski) występuje w obszarach, w których nie ma preferowanego kąta odpowiedzi, natomiast wyższe wartości (kolor czerwony) wskazują obszary, w których występuje wyższa odpowiedź dla kąta preferowanego. Orientacja cząstek podstruktur została zakodowana na wykresie wektorowym (rys. 2C), gdzie każda linia ściśle zgadzała się z podstawową lokalną orientacją obiektu widoczną w nieprzefiltrowanym obrazie w ciemnym polu (rys. 2A).

Rycina 2: A: Obraz okrzemka w ciemnym polu. B: Obraz orientacji obiektów. Skala kolorów wskazuje stopień orientacji (stosunek boków), natomiast jasność koduje istotność całkowitej odpowiedzi filtra Gabora. C: Orientacja obiektów z intensywnością odpowiedzi ≥10% wartości maksymalnej. Odcinek linii wskazuje oś długą odpowiadającej struktury.

Przykład 2: Komórki apoptotyczne

Tutaj przedstawiamy przefiltrowane obrazy wołowych komórek śródbłonka traktowanych staurosporyną (STS), które zostały przetworzone w ten sam sposób co okrzemki. Rys. 3 przedstawia niefiltrowany obraz komórek w ciemnym polu (DF) wraz z dziewięcioma obrazami przefiltrowanymi w czasie T=-180 min przed traktowaniem STS.

Rycina 3: Obrazy w ciemnym polu (DF) oraz obrazy filtrowane optycznie pola zawierającego kilka żywych komórek śródbłonka.

Obrazy po filtracji pozyskiwano następnie co 20 minut przez okres trzech godzin po traktowaniu STS. Rys. 4a przedstawia mapę współczynnika kształtu komórek w funkcji czasu. W tym przypadku odcień koloru reprezentuje stopień orientacji (oznaczony jako orientedness), podobnie jak w przypadku odcieni kolorów na Rys. 2b powyżej. Jednak jasność współczynnika kształtu nie była ważona średnią odpowiedzią filtra. Poprzez nałożenie naszych map współczynnika kształtu na obrazy fluorescencyjne oznakowanych mitochondriów w tych komórkach (Rys. 4b), ustalono, że zmierzony spadek współczynnika kształtu był ograniczony do obszarów komórkowych zawierających mitochondria i towarzyszył fragmentacji mitochondriów, którą można było zaobserwować bezpośrednio na obrazach fluorescencyjnych tych samych komórek. Rys. 5 przedstawia wykresy czasowe obrazujące zmianę współczynnika kształtu w funkcji czasu w komórkach przechodzących apoptozę. W każdej komórce w przedziale T=60-100 min następuje spadek współczynnika kształtu w regionach pokrywających się z fluorescencyjnymi mitochondriami, ale nie w regionach pokrywających się z obszarami słabej fluorescencji tła.

Rycina 4: Obrazy stosunku szerokości do długości (a) oraz fluorescencji (b) komórek śródbłonka traktowanych induktorem apoptozy, staurosporyną.

Rycina 5: Wykresy czasowe porównujące spadek współczynnika kształtu cząstek (stopnia orientacji) w komórkach śródbłonka traktowanych staurosporyną. Pojedyncze ślady reprezentują przebiegi czasowe w pojedynczych komórkach. Spadek stopnia orientacji jest ograniczony do obszarów komórek zarejestrowanych jako fluorescencyjne mitochondria (panel lewy) i nie występuje w pozostałych obszarach fluorescencji tła (panel prawy).

Skoro ustaliliśmy, że spadek współczynnika kształtu odpowiada fragmentacji mitochondriów, możemy teraz indukować apoptozę w tych komórkach, mierzyć fragmentację za pomocą naszej metody rozproszenia optycznego bez konieczności znakowania komórek oraz badać wpływ różnych warunków genetycznych i eksperymentalnych na tę dynamikę.

Dyskusja

Opisana powyżej metoda pozwala na uzyskanie map morfometrycznych obiektu, które mogą kodować na przykład wielkość lub orientację cząstek. Te informacje strukturalne można wykorzystać na kilka sposobów:

1. Można go wykorzystać jako wstępny screening w celu zidentyfikowania obszarów tkanek lub komórek, które ulegają zmianom podczas określonej terapii, a następnie poddać te obszary dalszej analizie za pomocą specyficznych testów molekularnych i biochemicznych.
2. Można go stosować w połączeniu z fluor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen		DMEM z niską zawartością glukozy
Pożywka Liebowitz L15	Invitrogen		Bez czerwieni fenolowej
L-glutamina	Invitrogen
Mitotracker Green	Invitrogen
Ekstrakt z mózgu bydlęcego	Clonetics
Płodowa surowica bydlęca	Gemini Bio Products
Heparyna	Sigma-Aldrich
Staurosporyna	Sigma-Aldrich
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich
Mikroskop odwrócony	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
DMD	Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD	Roper Scientific	Cascase 512B	CCD o wysokim zakresie dynamicznym (16 bit)
CCD	Roper Scientific	Coolsnap cf