Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W trakcie embriogenezy komórki przechodzą rozległe zmiany w zakresie ich lokalizacji i właściwości. Zmiany te są regulowane przez oddziaływania między komórkami a ich środowiskiem. Embriony chimeryczne, składające się z komórek o różnym podłożu genetycznym, stanowią doskonałe narzędzia do badania oddziaływań międzykomórkowych pośredniczących w działaniu genów będących przedmiotem zainteresowania. Przezroczystość embrionów danio pręgowanego (*zebrafish*) we wczesnych etapach rozwoju umożliwia bezpośrednią wizualizację morfogenezy tkanek i narządów na poziomie komórkowym. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół generowania chimerycznych siatkówek i mózgów w embrionach danio pręgowanego oraz prowadzenia obrazowania na żywo komórek dawcy. Protokół obejmuje przygotowanie igieł do transplantacji, transplantację blastomerów dawcy wykazujących ekspresję GFP do biorców niewykazujących ekspresji GFP oraz badanie zachowania komórek dawcy przy użyciu konfokalnej mikroskopii na żywo. Po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji protokół ten może być również wykorzystany do badania rozwoju embrionalnego innych tkanek i narządów u danio pręgowanego. Omówiono również zalety wykorzystania GFP do znakowania komórek dawcy.
Protokół
Dzień 1. Przygotowanie
1. Przygotowanie krzyżówek ryb
Wieczorem przygotuj pary ryb danioślepych do krzyżowania. Aby zapobiec przypadkowemu kopulowaniu przed wyznaczonym czasem, użyj przegród w kasetach do rozdzielenia samicy i samca. Ryby transgeniczne wykazujące ekspresję GFP służą jako źródło blastomerów dawcy. Wykorzystana w tej procedurze linia transgeniczna pt104 (Zou et al., 208) wykazuje powszechną ekspresję GFP pod kontrolą promotora EF1. Ekspresja GFP umożliwia wizualizację komórek dawcy za pomocą obrazowania na żywo. W zależności od specyficznych potrzeb można zastosować inne linie ryb transgenicznych wykazujące ekspresję odpowiednich białek fluorescencyjnych.
2. Przygotuj klinowe dołki w agarozie do unieruchomienia zarodków
Wlej roztopioną 1% agarozę, przygotowaną w wodzie jajowej E3 (Westerfield, 207), do szalki Petriego. Umieść na powierzchni roztworu agarozy plastikową formę z wypustkami w kształcie klinów i poczekaj, aż roztwór całkowicie zestaleje. Ostrożnie usuń formę i zanurz podłoże agarowe w wodzie E3.
3. Przygotuj igły do transplantacji
Użyj pionowego wyciągacza igieł (David KOPF Instruments) przy ustawieniu mocy 1,5, aby wykonać igły poprzez wyciąganie szklanych pipet kapilarnych (World Precision Instrument). Prawidłowe końcówki igieł powinny być zwężone i posiadać długie trzpienie. Szlifuj końcówki igieł pod kątem 45 stopni za pomocą mikro-szlifierki (Marishige), aż do uzyskania skośnych otworów o średnicy wewnętrznej 40-45μm (Ryc. 1A). Aby oczyścić końcówki igieł, podłącz wąż do tępego końca igły, a następnie podłącz wąż do strzykawki i zasysaj oraz wypuszczaj 10% roztwór kwasu fluorowodorowego, aż do usunięcia wszystkich widocznych zanieczyszczeń. Następnie przemyj końcówki wodą destylowaną, a potem 100% etanolem. Susz igły na powietrzu, aż cały etanol odparuje. Ważne jest upewnienie się, że końcówki są całkowicie suche: pozostały etanol zniszczy igły podczas etapu polerowania w wysokiej temperaturze. Aby zmiękczyć i wypolerować szorstkie krawędzie końcówek igieł, podgrzewaj je ciepłem generowanym przez włókno mikro-kuźni (Marishige). Podczas polerowania nie dopuszczaj do kontaktu końcówek igieł z włóknem. Ilość prądu przepływającego przez włókno oraz odległość między włóknem a końcówkami igieł można regulować, aby uzyskać pożądane warunki nagrzewania. Temperatura nie powinna być zbyt wysoka, ponieważ spowoduje to stopienie i odkształcenie końcówek igieł. Po wygładzeniu szorstkich krawędzi ostrożnie dotknij rozgrzanego włókna końcówką igły, a następnie delikatnie odsuń włókno od igły, aby uformować ostry koniec (Ryc. 1B). Ostra, gładka i czysta igła jest kluczowa dla uzyskania nienaruszonych blastomerów dawcy i uniknięcia uszkodzenia embrionów biorcy.
4. Przygotuj sondę do pozycjonowania zarodka
Wypal szklaną pipetę nad płomieniem gazowym, aby uzyskać cienką szklaną sondę z wygładzonym końcem. Sonda ta będzie służyć do ustawiania embrionów w odpowiedniej orientacji przed transplantacją.
Dzień 2. Transplantacja blastomerów
1. Zebranie i dechorionizacja embrionów
Następnego dnia należy usunąć przegrody w kasetach krzyżowych, aby umożliwić rybom rozmnażanie. Zarodki należy umieścić w szalce Petriego wypełnionej wodą E3. Następnie należy przeprowadzić dechorionację zarodków, ręcznie oddzielając choriony od zarodków za pomocą precyzyjnej pęsety. Do ostrożnego przeniesienia zdechorionowanych zarodków do otworów w agarozie należy użyć szklanej pipety z wygiętą końcówką. Należy unikać kontaktu zarodków z powietrzem, co mogłoby spowodować ich pęknięcie. Zarodki powinny rozwijać się w otworach w agarozie w temperaturze 28.5 °C do 3 godziny po zapłodnieniu (hpf).
2. Przygotuj aparat do transplantacji
Podczas rozwoju embrionów przygotuj aparat do transplantacji, łącząc igłę transplantacyjną z systemem mikropompowym wypełnionym olejem mineralnym. Upewnij się, że system nie przecieka i że w jego wnętrzu nie znajdują się pęcherzyki powietrza. Wypełnij całą igłę transplantacyjną olejem mineralnym, z wyjątkiem przestrzeni o objętości 0,5 - 1 μl przy otworze końcowym.
3. Transplantacja blastomerów
Aby przeprowadzić transplantację blastomerów, należy użyć szklanej sondy pozycjonującej, aby ustawić embriony w wieku 3-4 hpf stroną z blastomerami do góry. Następnie delikatnie wprowadź igłę transplantacyjną do embrionu dawcy i powoli zaciągnij do niej od 5 do 20 blastomerów. Wprowadź wypełnioną blastomerami igłę do embrionu biorcy i powoli je uwolnij. Miejsce, w którym uwolnione zostaną blastomery, wpłynie na lokalizację ich potomstwa w późniejszych etapach rozwoju. Aby analizować rozwój siatkówki i mózgu, uwolnij komórki w biegunie zwierzęcym. Podczas transplantacji upewnij się, że końcówka igły nie ma kontaktu z powietrzem. Aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne, embriony biorców należy pozostawić w dołkach agarowych w temperaturze 28,5 °C do następnego dnia. Następnie przenieś mozaikowe embriony na płytki 24-dołkowe uprzednio pokryte 0,5 ml 1% agarozy, umieszczając jeden embrion w każdym dołku. Do każdego dołka dodaj 1 ml wody E3 do jaj. Aby zapobiec infekcjom bakteryjnym, dodaj do wody E3 10 μl 10X penicyliny i streptomycyny.
Dzień 3. Osadzanie i obrazowanie na żywo embrionów mozaikowych
1. Osadzanie embrionów
Przygotować 1,5% agarozę niskotopliwą (LMP) w wodzie jajecznej E3 i utrzymywać roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C. Przenieść embrion mozaikowy do naczynia do hodowli tkankowej FluoroDish ze szklanym dnem o grubości 0,17 mm (World Precision Instruments). Usunąć nadmiar wody E3, pozostawiając embrion przykryty jedynie minimalną ilością E3. Dodać 30-50 μl roztopionej 1,5% LMP do embrionu. Szybko ustawić oko lub mózg jak najbliżej szklanego dna, zanim roztwór agarozy stężeje. Po ostygnięciu roztworu dodać kolejną porcję roztworu agarozy, aby dodatkowo unieruchomić embriony w miejscu. Następnie zalać stężały blok agarozy 2-3 ml wody jajecznej E3.
2. Obrazowanie konfokalne
Do mikroskopii konfokalnej wykorzystuje się odwrócony obiektyw z imersją wodną (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japonia) o dużej głębokości ostrości. Na obiektyw nanosi się kroplę wody, a następnie umieszcza na nim naczynie do hodowli tkankowej FluoroDish. Aby obrazować rozwój, wykonuje się obrazowanie poklatkowe, wykonując zdjęcia embrionów co 5 minut. W zależności od charakteru przeprowadzanych doświadczeń należy dostosować odstępy czasowe między ujęciami.
Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną mozaikową rybkę danio pręgowaną w 24. godzinie rozwoju (24-hpf). Ekspresja GFP zaznacza komórki dawcy na zielono. Neuroepithelialne komórki siatkówki obejmują całą grubość ściany siatkówki.
Film przedstawia ruchy komórek dawcy w mózgu gospodarza w 24 hpf. Zwróć uwagę, że morfologia komórek zmienia się w czasie.
Rycina 1. Kształty końcówek igieł transplantacyjnych. A. Skośny otwór końcówki igły był wolny od zanieczyszczeń po przemyciu kwasem fluorowodorowym. B. Na końcówce igły uformowano ostry koniec.
Rycina 2.Wizualizacja komórek donora wykazujących ekspresję GFP w chimerycznych embrionach danio pręgowanego w 24. godzinie po zapłodnieniu (hpf). Panel lewy przedstawia sygnały GFP w mózgu i siatkówce. Panel środkowy to obraz embrionu wykonany w świetle przechodzącym. Panel prawy przedstawia obraz scalony.
Film 1. Obrazowanie na żywo komórek donora pozytywnych pod kątem GFP wykazało rozległe zmiany w morfologii neuroepitelialnych komórek mózgu podczas rozwoju. Pojedyncze klatki filmu były rejestrowane co 5 minut między 24 a 25 hpf. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym filmie prezentujemy metodę transplantacji blastomerów w celu analizy rozwoju siatkówki i mózgu u danio pręgowanego. Protokół ten można również wykorzystać do analizy rozwoju innych tkanek i narządów, przenosząc blastomery dawcy w odpowiednie miejsca w embrionach biorcy. Znakowanie cząsteczkami GFP zapewnia czystsze tło niż znakowanie dekstranem sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym (Ho and Kane 1990). Wynika to z faktu, że pozostałości barwników dekstranowych z martwych komórek dawcy utrzymują się znaczni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Badanie to było wspierane przez grant podstawowy National Institutes of Health (NIH) (5P30EY008098) oraz następujące fundusze przyznane X.W.: grant NIH R01EY016099 oraz Research to Prevent Blindness Career Development Award. Dziękujemy Kirze Lathrop za pomoc w obrazowaniu konfokalnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5 ¾" Pipeta szklana | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Kapilara z borokrzemianowego szkła | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Pionowy wyciągacz igieł/pipet | Instrumenty David Kopf | Model 720 | |
| Mikromłynek | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Ręczna pompa mikrostrzykawkowa | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Kwas fluorowodorowy | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicylina-streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agaroza | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Fisher Scientific | BP165-25 | |
woda jajeczna E3:
| |||
| |||
| <µl> |
Bibliografia
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
