Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Bioinformatyka wideo to zautomatyzowane przetwarzanie, analiza, interpretacja i eksploracja danych biologicznych czasowo-przestrzennych wyekstrahowanych z filmów mikroskopowych. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.

Streszczenie

Ponieważ dane wideo są złożone i składają się z wielu obrazów, wydobywanie z nich informacji jest trudne bez wsparcia oprogramowania komputerowego. Bioinformatyka wideo stanowi potężne podejście ilościowe do ekstrakcji danych czasowo-przestrzennych z obrazów wideo, wykorzystujące oprogramowanie komputerowe do eksploracji i analizy danych. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę bioinformatyki wideo służącą do ilościowego pomiaru wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) poprzez analizę filmów time-lapse zarejestrowanych w inkubatorze Nikon BioStation CT wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. W naszych eksperymentach kolonie hESC przyczepione do Matrigelu były filmowane przez 48 godzin w urządzeniu BioStation CT. W celu określenia tempa wzrostu tych kolonii opracowano procedury w oprogramowaniu CL-Quant, które umożliwia użytkownikom ekstrakcję różnych typów danych z obrazów wideo. Aby precyzyjnie ocenić wzrost kolonii, stworzono trzy procedury. Pierwsza segmentowała obraz na kolonię i tło, druga poprawiała obraz w celu dokładnego zdefiniowania kolonii w całej sekwencji wideo, a trzecia mierzyła liczbę pikseli w kolonii w czasie. Trzy procedury były uruchamiane sekwencyjnie na danych wideo zebranych w BioStation CT, aby przeanalizować tempo wzrostu poszczególnych kolonii hESC w ciągu 48 godzin. W celu weryfikacji rzetelności procedur CL-Quant te same dane analizowano ręcznie przy użyciu oprogramowania Adobe Photoshop. Po porównaniu danych uzyskanych za pomocą procedur CL-Quant i programu Photoshop wyniki okazały się niemal identyczne, co wskazuje na rzetelność procedur CL-Quant. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do dowolnych danych wideo w celu pomiaru tempa wzrostu hESC lub innych komórek rosnących w koloniach. Ponadto w przyszłości można opracować inne procedury bioinformatyki wideo dla pozostałych procesów komórkowych, takich jak migracja, apoptoza i adhezja komórkowa.

Protokół

Część 1: Procedura eksperymentalna

Dane wideo zawierają ogromną ilość informacji. Jednak informacje te są często trudne do wyodrębnienia, a ich manualna analiza przez ludzi może wymagać wielu godzin pracy personelu. Analiza manualna jest również podatna na błędy oraz różnice w interpretacji. Bioinformatyka wideo polega na wykorzystaniu oprogramowania komputerowego do wydobywania konkretnych danych z obrazów wideo. Ta metoda analizy jest szybka i pozwala wyeliminować błędy występujące podczas manualnej analizy przeprowadzanej przez ludzi. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody ilościowego określania wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.

W niniejszej pracy obrazy wideo time-lapse zostały zebrane przy użyciu jednostki inkubacyjnej Nikon BioStation CT, która umożliwia obrazowanie wielu pól komórek w czasie (Rys. 1). Metody opisane w tym raporcie mają zastosowanie do danych wideo zebranych za pomocą dowolnego zestawu do mikroskopii wideo.

W naszym projekcie eksperymentalnym wysialiśmy H9 hESC na 12-dołkowe płytki do hodowli tkanek na 48 godzin. W tym czasie kolonie mogły w pełni przytwierdzić się i rozprzestrzenić na Matrigelu. Następnie płytki z przytwierdzonymi koloniami hESC przeniesiono do BioStation CT i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Podczas przebywania w BioStation obrazy kolonii były zbierane w odstępach 7-minutowych, a następnie wykorzystane do stworzenia sekwencji wideo time-lapse. Filmy dla każdej kolonii zostały poddane analizie w celu ilościowego określenia wzrostu kolonii przy użyciu receptur bioinformatyki wideo opracowanych w oprogramowaniu CL-Quant. Analizy wykonane za pomocą receptur stworzonych w oprogramowaniu CL-Quant zostały zweryfikowane pod kątem poprawności ręcznie w programie Adobe Photoshop.

Część 2: Przygotowanie przylegających kolonii hESC

1. Hodować hESC na płytkach 6-dołkowych powlekanych Matrigel, a po osiągnięciu 70% konfluencji, przesianie zawartości jednego dołka płytki 6-dołkowej do 5 dołków powlekanej Matrigel płytki 12-dołkowej w następujący sposób.
2. Odssać pożywkę z dołka zawierającego hESC.
3. Przepłukać dołek 2x 1ml PBS.
4. Dodać 1ml Accutase i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
5. Wprowadzić do dołka 10-12 szklanych kulek i delikatnie potrząsać płytką, aż kolonie całkowicie oddzielą się od dna dołka.
6. Zneutralizować Accutase za pomocą 1ml pożywki mTeSR lub pożywki kondycjonowanej mEF.
7. Odwirować zawiesinę komórkową w stożkowej probówce 15ml przy 200g przez 3 minuty.
8. Odlać nadsącz i rozbić osad za pomocą 500μl świeżej pożywki mTeSR.
9. Nakroplować 100μl zawiesiny hESC do każdego dołka w płytce 12-dołkowej.
10. Delikatnie kołysać płytką w przód i w tył i obserwować hodowle pod mikroskopem świetlnym. Upewnić się, że skupiska komórek są równomiernie rozłożone na całej płytce.
11. Umieścić płytkę 12-dołkową z powrotem w inkubatorze.
12. Pozostawić hESC do przytwierdzenia i wzrostu na 48 godzin (można zastosować krótszy czas).
13. Po 48 godzinach odlać pożywkę i przemyć dołki 500ul PBS, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki.
14. Dodać 1ml pożywki mTeSR do każdego dołka.
15. Komentarz: Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze/mikroskopie w celu obrazowania wideo.
16. Rozpocząć zbieranie obrazów time-lapse. Należy starać się wybierać pola z osobnymi, pojedynczymi koloniami, które nie będą miały tendencji do zrastania się z innymi koloniami.
17. Zamiast powyższego protokołu można zastosować inne metody hodowli i przygotowania hESC.

Część 3: Bioinformatyka wideo

Oprogramowanie CL-Quant zostało wykorzystane do stworzenia trzech „przepisów”, które po uruchomieniu w sekwencji pozwolą określić liczbę pikseli lub powierzchnię w mikronach dla każdej kolonii w czasie. Trzy przepisy są zbudowane sekwencyjnie i w tym zastosowaniu obejmują segmentację, wzmocnienie obrazu oraz pomiar.

Analiza wzrostu kolonii hESC z wykorzystaniem oprogramowania CL-Quant/opracowywanie receptury:

1. W pierwszej kolejności tworzy się recepturę segmentacji (segmentation recipe).
2. Przeskanuj cały film, aby upewnić się, że materiał nadaje się do analizy. Sprawdź, czy cała kolonia pozostaje w polu widzenia i czy inne kolonie do niego nie wkraczają.
3. Otwórz kreator segmentacji i kliknij przycisk „next”.
4. Wybierz odpowiedni kanał obrazu (np. fazowy, zielony, czerwony itd.) i kliknij przycisk „next”.
5. Z 3 dostępnych opcji wybierz „soft matching” i kliknij „next”.
6. Zaznacz obszary pożądane („want”), obrysowując na obrazie regiony – zazwyczaj od zewnętrznej krawędzi kolonii do jej obszaru centralnego.
   • Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale reprezentatywny dla całej kolonii.
   • Przy użyciu mikroskopii fazowej pamiętaj o uwzględnieniu halo wokół kolonii, aby oprogramowanie mogło precyzyjnie zaznaczyć kolonię.
   • Wybierz 1 lub 2 obszary zainteresowania (ROI), które mogą wykazywać różne wzory pikseli w obrębie kolonii, ale nie wybieraj zbyt wielu obszarów „want”, co mogłoby doprowadzić do nieprawidłowego nałożenia maski.
7. Kliknij przycisk „next”.
8. Zaznacz obszary niepożądane („don't want”), obrysowując na obrazie regiony, które nie są częścią kolonii ani tła. Są to obszary o wzorach, które chcesz wyeliminować, zawierające piksele artefaktów, takich jak zanieczyszczenia i martwe komórki. Kliknij „next”.
9. Zaznacz „tło” (background), obrysowując regiony, które chcesz wyeliminować.
   • Obszary „don't want” i „background” różnią się tym, że tło powinno być jednorodne i prawdopodobnie występować w każdej klatce.
   • Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii.
10. Kliknij przycisk „next”.
11. Nad obszarem zainteresowania powinna wyświetlić się kolorowa maska (Rys. 2A).
12. Jeśli maska nie pokrywa dokładnie obszaru zainteresowania, można zwiększyć lub zmniejszyć zakres progu segmentacji (znajdujący się w prawym dolnym rogu ekranu oprogramowania).
13. Kreator segmentacji może poprosić o dalsze doprecyzowanie obszaru maski, jeśli jest to konieczne.
14. Jeśli chcesz zmienić maskę, wybierz „update soft matching regions”. Pozwala to na zmianę obszarów „want”, „don't want” lub „background”.
15. Jeśli maska jest zadowalająca, wybierz „apply threshold and save my mask” i kliknij przycisk „next”.
16. Maska zostanie wówczas wyświetlona w innym kolorze.
17. Wybierz „finish”.
18. Receptura powinna wyświetlić się w prawym górnym rogu oprogramowania pod nazwą „segmentation recipe”.
19. Jeśli chcesz, zmień nazwę receptury, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając „rename”.
20. Aby przeprowadzić kontrolną weryfikację, kliknij prawym przyciskiem myszy i najedź kursorem na „apply recipe”.
21. Pojawi się menu umożliwiające wybranie liczby klatek, których chcesz użyć do weryfikacji receptury. Uruchom recepturę co 10 klatek, aby sprawdzić dokładność rozmieszczenia maski.
22. Jeśli maska obejmuje fragmenty niewielkich niepożądanych obszarów lub zanieczyszczeń, możesz utworzyć „recepturę ulepszenia” (enhancement recipe), aby lepiej dopasować maskę do obszaru zainteresowania.
23. Aby utworzyć recepturę ulepszenia, kliknij prawym przyciskiem myszy folder „enhancement recipe”, a następnie kliknij „new”. Powinna wyświetlić się nowa receptura ulepszenia.
24. W oryginalnym polu widzenia (FOV) kliknij przycisk „toggles enhancement module” znajdujący się po prawej stronie obrazu. Najedź kursorem na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować właściwy przycisk.
25. Otwórz menu rozwijane „labeling”.
26. Wybierz „labeling 4 connected”.
27. Wybierz „labeling 4 connected2”.
28. Powinien wyświetlić się nowy pasek zadań.
29. Pobierz początkową maskę (mask0) z receptury segmentacji i przeciągnij ją do pola „input”.
30. Na pasku powinien teraz pojawić się napis „input mask #”.
31. Przeciągnij ikonę z napisem „input mask #” na ikonę maski 0.
32. Znajdź opcję „min size” na pasku zadań i reguluj wartość, aż wyświetli się tylko obszar zainteresowania. Pamiętaj, aby klikać „execute” po każdej próbie dopasowania.
33. Gdy uznasz regulację minimalnego rozmiaru za zadowalającą, kliknij w utworzoną wcześniej „recepturę ulepszenia” (Rys. 2B).
34. Na dole ekranu wybierz „save to recipe”.
35. Oprogramowanie zapyta „overwrite selected recipe?”, wybierz „yes”.
36. Przeprowadź kontrolną weryfikację receptury ulepszenia, stosując te same procedury, co w przypadku weryfikacji segmentacji.
37. Jeśli jesteś zadowolony z receptur segmentacji i ulepszenia, wybierz „create measurement template” na prawym pasku narzędzi.
38. Jeśli chcesz, zmień nazwę szablonu.
39. W oknie szablonu pomiarowego najedź kursorem na grafikę komórki. Przytrzymaj klawisz Ctrl i zaznacz komórkę.
40. Odznacz „default parameter” i zaznacz „area parameter” w sekcji „morphology”.
41. Wyjdź z okna „template”.
42. Wybierz ikonę utworzoną w recepturze pomiarowej.
43. Zmień nazwę receptury.
44. Przejdź do karty „template” w prawym górnym rogu i zaznacz ją.
45. Przeciągnij wcześniej utworzony szablon pomiarowy do okna pomiarowego.
46. Kliknij „Yes”, aby kontynuować.
47. W oknie receptury pomiarowej wybierz „Channel mappings”, a następnie „Whole cell”.
48. Wybierz „Mask mappings”.
49. Następnie wybierz opcję „Whole cell” dla ulepszonej maski (enhanced mask).
50. W oknie głównym, w karcie Recipe, wybierz „Measurement recipe”.
51. W oknie receptury pomiarowej wybierz ikonę „Save”.
52. Następnie zamknij okno.
53. Teraz zamknij i ponownie otwórz „FOV”.
54. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę „Recipe”, wybierz „Lock recipe list” i uruchom receptury sekwencyjnie na danych wideo.

Część 4: Sprawdzanie dokładności receptury przy użyciu oprogramowania Photoshop

Aby zwalidować recepturę stworzoną za pomocą (CL-Quant software), te same dane można przeanalizować ręcznie w programie Adobe Photoshop. W tej analizie analizowano co dziesiątą klatkę (każdy punkt czasowy co 70 min), aby zmierzyć wielkość kolonii w ciągu 48 godzin.

1. Otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop.
2. W pasku narzędzi kliknij narzędzie Magic Wand (Różdżka).
3. Kliknij obszar wokół kolonii, tak aby zaznaczone zostało całe pole z wyjątkiem regionu kolonii.
4. W pasku narzędzi wybierz opcję „Edit in Quick Mask Mode” (Edytuj w trybie szybkiej maski) i kliknij kolonię, aby została zaznaczona.
5. Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii ściśle przylega do jej obwodu, a nie znajduje się wewnątrz niej. Jeśli przerywana linia nie przebiega wzdłuż obwodu, odpowiednio zmień wartość tolerancji w górnym pasku narzędzi.
6. Z rozwijanego menu „Window” (Okno) wybierz opcję „Histogram”.
7. Zapisz wartość piksela dla cache=1. Jeśli cache wynosi 2, kliknij znak „!”, aby zmienić go na cache 1, a następnie zanotuj wartość piksela.
8. Powtórz powyższy proces dla co dziesiątej klatki. W razie potrzeby można wykorzystać mniejszą liczbę klatek.
9. Dane zebrane za pomocą programu Photoshop oraz oprogramowania CL-Quant można następnie nanieść na wspólny wykres. Jeśli receptury CL-Quant są prawidłowe, krzywe dla analizy w Photoshopie i CL-Quant powinny być bardzo zbliżone (Rys. 3-5).
10. Jeśli receptury opracowane w programie CL-Quant są prawidłowe, można je niezawodnie zastosować do innych danych wideo.
11. Wartością dodaną zastosowania bioinformatyki wideo w tej analizie jest fakt, że po opracowaniu i walidacji receptur segmentacji, wzmocnienia i pomiaru, analiza zostanie przeprowadzona znacznie szybciej i dokładniej niż przez człowieka korzystającego z programu Photoshop.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Pas klatek z kolonii hESC przedstawiający obrazy z różnych momentów w ciągu 48 godzin wzrostu w systemie BioStation CT. Klatki były rejestrowane w odstępach 7 minut.

Rysunek 2: (A) Obraz hESC z maską nałożoną na kolonię przez algorytm segmentacji. Obszary z zanieczyszczeniami i tło są również zamaskowane, co wskazuje na konieczność zastosowania algorytmu ulepszania obrazu w celu zwiększenia dokładności oceny. (B) Obraz tej samej kolonii co w punkcie „A” po przeprowadzeniu ulepszania. Maska zaznacza teraz wyłącznie kolonię, a szum został usunięty z zaznaczenia.

Rycina 3: Wykres przedstawiający wzrost wielkości kolonii (w pikselach) w ciągu 48 godzin, określony przy użyciu oprogramowania CL-Quant oraz programu Photoshop. Wykres ten przedstawia surowe dane i pokazuje, że kolonie startują z różnych wielkości. Wykazuje on również, że obie metody pomiaru są ze sobą zgodne.

Rysunek 4: Wykres przedstawiający te same dane co na Rysunku 3 po normalizacji, ukazujący procentowy wzrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin. Wykazuje to, że tempo wzrostu jest podobne niezależnie od początkowej wielkości kolonii i że obie metody analizy dają zbliżone wyniki.

Rysunek 5: Wykres przedstawiający średnie dla znormalizowanych danych z Rysunku 4. Wykres ten wyraźnie pokazuje dobrą zgodność między analizami wykonanymi za pomocą bioinformatyki wideo (oprogramowanie CL-Quant) a programem Photoshop i potwierdza rzetelność metody. Lekki spadek powierzchni dla danych z programu Photoshop w klatce 325 wynika z pominięcia kilku filmów w analizie przeprowadzonej w Photoshopie.

Dyskusja

Narzędzia bioinformatyki wideo są niezwykle skuteczne w szybkim wydobywaniu danych z obrazów wideo. Nasz protokół ilościowego oznaczania wzrostu kolonii hESC demonstruje jedno z zastosowań bioinformatyki wideo w problematyce biologicznej. Metoda ta jest ilościowa i posiada interesującą cechę polegającą na ujawnianiu danych z poszczególnych kolonii hESC. Procedury bioinformatyki wideo mogą zostać opracowane w celu monitorowania innych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, migracja, apoptoza, przyleganie komórek d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka podtrzymująca ludzkie embrionalne komórki macierzyste mTeSR1	Stem Cell Technologies	05850	lub dowolna inna odpowiednia pożywka do hodowli hESC.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	lub inny odpowiedni substrat.
Podstawowa pożywka DMEM/F12	Invitrogen	11330-032
Fosforanowy bufor solny bez Ca2+ i Mg2+
Pożywka do odrywania komórek z enzymem Accutase	eBioscience	00-4555-56	lub inny odpowiedni enzym do odrywania.
Szklane kuleczki 3mm	Fisher Scientific	11-312A	opcjonalnie.
12-dołkowe płytki do hodowli tkanek	BD Biosciences	353043	lub dowolny inny format płytki.
Nikon BioStation CT/IM			lub inny inkubator/mikroskop odpowiedni do gromadzenia danych wideo.
Oprogramowanie CL-Quant (Nikon) i/lub Photoshop (Adobe).