Wideo: Bioinformatyczna analiza wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Bioinformatyka wideo to zautomatyzowane przetwarzanie, analiza, zrozumienie i eksploracja danych biologicznych przestrzenno-czasowych wydobytych z mikroskopijnych filmów. Celem artykułu jest przedstawienie metody pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą metody bioinformatyki wideo.

Streszczenie

Ponieważ dane wideo są złożone i składają się z wielu obrazów, wydobywanie informacji z materiałów wideo jest trudne do wykonania bez pomocy oprogramowania komputerowego. Bioinformatyka wideo to potężne ilościowe podejście do wyodrębniania danych przestrzenno-czasowych z obrazów wideo za pomocą oprogramowania komputerowego do przeprowadzania datowania, eksploracji i analizy. W tym artykule przedstawiamy metodę bioinformatyki wideo do ilościowego określania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) poprzez analizę filmów poklatkowych zebranych w inkubatorze CT BioStation firmy Nikon wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. W naszych eksperymentach kolonie hESC, które były przyłączone do Matrigel, były filmowane przez 48 godzin w BioStation CT. Aby określić tempo wzrostu tych kolonii, receptury zostały opracowane przy użyciu oprogramowania CL-Quant, które umożliwia użytkownikom wyodrębnianie różnych typów danych z obrazów wideo. Aby dokładnie ocenić wzrost kolonii, stworzono trzy receptury. Pierwszy z nich podzielił obraz na kolonię i tło, drugi poprawił obraz, aby dokładnie zdefiniować kolonie w całej sekwencji wideo, a trzeci zmierzył liczbę pikseli w kolonii w czasie. Trzy receptury przeprowadzono kolejno na danych wideo zebranych w tomografii komputerowej BioStation w celu przeanalizowania tempa wzrostu poszczególnych kolonii hESC w ciągu 48 godzin. Aby zweryfikować prawdziwość receptur CL-Quant, te same dane zostały przeanalizowane ręcznie za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop. Po porównaniu danych uzyskanych za pomocą receptur CL-Quant i Photoshopa, wyniki były praktycznie identyczne, co wskazuje, że receptury CL-Quant były zgodne z prawdą. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do dowolnych danych wideo w celu pomiaru tempa wzrostu hESC lub innych komórek rosnących w koloniach. Ponadto w przyszłości mogą zostać opracowane inne receptury bioinformatyki wideo dla innych procesów komórkowych, takich jak migracja, apoptoza i adhezja komórek.

Protokół

Część 1: Procedura eksperymentalna

Dane wideo zawierają mnóstwo informacji. Jednak informacje te są często trudne do wydobycia i wykonywane ręcznie przez ludzi i mogą wymagać wielu godzin pracy personelu. Ręczna analiza dokonywana przez ludzi jest również narażona na różnice w interpretacji i błędach. Bioinformatyka wideo polega na wykorzystaniu oprogramowania komputerowego do wydobywania określonych danych z obrazów wideo. Ta metoda analizy jest szybka i może wyeliminować błędy, które występują, gdy analiza jest wykonywana ręcznie przez ludzi. Celem artykułu jest zademonstrowanie metody ilościowego określania wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody bioinformatyki wideo.

W tym artykule, obrazy filmów poklatkowych zostały zebrane za pomocą jednostki inkubacyjnej Nikon BioStation CT, która pozwala na obrazowanie wielu pól komórek w czasie (Rys. 1). Metody opisane w tym raporcie mają zastosowanie do danych wideo zbieranych przez dowolną konfigurację wideomikroskopijną.

W naszym eksperymentalnym projekcie sialiśmy H9 hESC na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych przez 48 godzin. W tym okresie kolonie mogły w pełni przyczepić się i rozprzestrzenić na Matrigel. Następnie płytki z przyłączonymi koloniami hESC przeniesiono do BioStation CT i inkubowano przez dodatkowe 48 godzin. Podczas pobytu w BioStation, zdjęcia kolonii były zbierane w 7-minutowych odstępach, a następnie wykorzystywane do tworzenia poklatkowych sekwencji wideo. Filmy wideo dla każdej kolonii zostały następnie przeanalizowane w celu ilościowego określenia wzrostu kolonii za pomocą receptur bioinformatycznych wideo opracowanych za pomocą oprogramowania CL-Quant. Analizy wykonane przy użyciu receptur stworzonych za pomocą oprogramowania CL-Quant zostały sprawdzone pod kątem prawdziwości ręcznie za pomocą programu Adobe Photoshop.

Część 2: Przygotowanie dołączonych kolonii hESC

1. Hoduj hESC na 6-dołkowych płytkach pokrytych Matrigelem, a po osiągnięciu 70% konfluencji ponownie poplatekować jeden dołek 6-dołkowej płytki do 5 dołków 12-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem w następujący sposób.
2. Odessać pożywkę ze studzienki zawierającej hESC.
3. Dobrze spłukać 2x 1ml PBS.
4. Dodać 1 ml Accutase i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
5. Dodaj 10-12 szklanych koralików do studzienki i delikatnie potrząśnij talerzem, aż kolonie całkowicie oderwą się od dna studzienki.
6. Zneutralizować Accutase za pomocą 1 ml pożywki mTeSR lub pożywki kondycjonowanej mEF.
7. Odwirować zawiesinę komórkową w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o masie 200 g przez 3 minuty.
8. Zdekantować supernatant i osad łamaczy za pomocą 500 μl świeżej pożywki mTeSR.
9. Płytka wrzuca 100 μl zawiesiny hESC do każdej studzienki w płytce 12-dołkowej.
10. Delikatnie kołysz płytą w przód iw tył i obserwuj kultury pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że grudki komórek są równomiernie rozmieszczone na całej płytce.
11. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze.
12. Pozwól hESC przyczepić się i rosnąć przez 48 godzin (można użyć krótszego czasu).
13. Po 48 godzinach zdekantować pożywkę i umyć studzienki 500ul PBS, aby usunąć nieprzyłączone komórki.
14. Dodać 1 ml pożywki mTeSR do każdej studzienki.
15. Komentarz: Natychmiast umieść płytkę w inkubatorze/mikroskopie w celu obrazowania wideo.
16. Rozpocznij zbieranie zdjęć poklatkowych. Spróbuj wybrać pola z dyskretnymi pojedynczymi koloniami, które prawdopodobnie nie przerosną na inne kolonie.
17. Zamiast powyższego protokołu można stosować inne metody hodowli i tworzenia hESC.

Część 3: Bioinformatyka wideo

CL-Quant oprogramowanie zostało użyte do stworzenia trzech "receptur", które po uruchomieniu w sekwencji określą liczbę pikseli lub obszar w mikronach dla każdej kolonii w czasie. Trzy receptury są wbudowane w sekwencję i dla tego zastosowania obejmują segmentację, ulepszanie i pomiar.

Analiza wzrostu kolonii hESC za pomocą oprogramowania/opracowania receptury CL-Quant:

1. Najpierw tworzony jest przepis na segmentację.
2. Zeskanuj cały film, aby upewnić się, że nadaje się do użytku. Sprawdź, czy cała kolonia pozostaje w polu widzenia i czy inne kolonie nie wchodzą na pole.
3. Otwórz kreatora segmentacji i kliknij przycisk "dalej".
4. Wybierz właściwy kanał obrazu (np. faza, zielony, czerwony itp.) i kliknij przycisk "dalej".
5. Wybierz "miękkie dopasowanie" z 3 opcji i kliknij "dalej".
6. Wybierz regiony "pożądane", zakreślając regiony na obrazie, zazwyczaj od zewnętrznej krawędzi kolonii do środkowego obszaru kolonii.
   • Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale powinien być reprezentatywny dla całej kolonii.
   • Korzystając z mikroskopii z kontrastem fazowym, pamiętaj o uwzględnieniu aureoli wokół kolonii, aby oprogramowanie precyzyjnie wybrało kolonię.
   • Wybierz 1 lub 2 obszary zainteresowania, które mogą wykazywać różne wzory pikseli w kolonii, ale nie wybieraj zbyt wielu "chęci", które mogą skutkować niedokładnym nałożeniem maski.
7. Kliknij przycisk "Dalej".
8. Wybierz regiony "nie chcę", zakreślając regiony na obrazie, które nie są częścią kolonii i nie są częścią tła. Są to regiony, które mają wzorce, które chcesz pominąć, i zawierają piksele artefaktów, takich jak szczątki i martwe komórki. Kliknij "Dalej".
9. Wybierz "tło", zakreślając regiony, które chcesz wyłączyć.
   • Regiony "nie chcę" i "tło" różnią się tym, że tło powinno być jednolite i prawdopodobnie pojawi się w każdej klatce.
   • Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii.
10. Kliknij przycisk "Dalej".
11. Kolorowa maska powinna być wyświetlana nad obszarem zainteresowania (rys. 2A).
12. Jeśli maska nie pokrywa dokładnie obszaru zainteresowania, zakres progu segmentacji (znajdujący się w prawym dolnym rogu ekranu oprogramowania) może zostać zwiększony lub zmniejszony.
13. W razie potrzeby kreator segmentacji poprosi o dalsze dostrojenie obszaru maski.
14. Jeśli chcesz zmienić maskę, wybierz opcję "aktualizuj miękkie pasujące regiony". Pozwala to na zmianę obszarów "chcę", "nie chcę" lub "tło".
15. Jeśli maska jest zadowalająca, wybierz "zastosuj próg i zapisz moją maskę" i kliknij przycisk "dalej".
16. Maska będzie wtedy wyświetlana w innym kolorze.
17. Wybierz "zakończ".
18. Receptura powinna być wyświetlana w prawym górnym rogu oprogramowania i powinna nazywać się "receptura segmentacji".
19. Zmień nazwę przepisu, jeśli chcesz, klikając prawym przyciskiem myszy i "zmień nazwę".
20. Aby sprawdzić na miejscu, kliknij prawym przyciskiem myszy i umieść kursor myszy na "zastosuj przepis".
21. Pojawi się menu, które pozwala wybrać liczbę ramek, których chcesz użyć podczas wyrywkowego sprawdzania przepisu. Uruchom przepis co 10 klatek, aby wyrywkowo sprawdzić dokładność umieszczania maski.
22. Jeśli maska zbiera części małych niechcianych obszarów lub zanieczyszczeń, możesz stworzyć "przepis na ulepszenie", aby poprawić dopasowanie maski do obszaru zainteresowania.
23. Aby utworzyć przepis na ulepszenie, kliknij prawym przyciskiem myszy folder "przepis na ulepszenie", a następnie kliknij "nowy". Powinna zostać wyświetlona nowa receptura ulepszenia.
24. W oryginalnym polu widzenia (FOV) kliknij przycisk "przełącza moduł ulepszeń" znajdujący się po prawej stronie obrazu. Najedź kursorem myszy na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować właściwą.
25. Wybierz menu rozwijane "etykietowanie".
26. Wybierz "etykietowanie 4 połączone".
27. Wybierz "etykietowanie 4 połączone2".
28. Powinien zostać wyświetlony nowy pasek zadań.
29. Chwyć początkową maskę (mask0) z przepisu na segmentację i przeciągnij ją do pola "wejście".
30. Na pasku powinien teraz pojawić się komunikat "maska wprowadzania #".
31. Przeciągnij ikonę z "maską wprowadzania #" na ikonę maski 0.
32. Znajdź "minimalny rozmiar" na pasku zadań i dostosuj liczbę, aż zostanie wyświetlony tylko obszar zainteresowania. Upewnij się, że kliknąłeś "wykonaj" podczas każdej pasującej próby.
33. Gdy będziesz zadowolony z dostosowania minimalnego rozmiaru, kliknij "przepis na ulepszenie", który utworzyłeś wcześniej. (rys. 2B)
34. U dołu ekranu wybierz "zapisz w przepisie".
35. Oprogramowanie prosi teraz o "nadpisanie wybranego przepisu?", wybierz "tak"
36. Sprawdź wyrywkowo recepturę ulepszenia, stosując te same procedury, co powyżej, w przypadku segmentacji kontroli wyrywkowej.
37. Jeśli są zadowoleni z przepisów na segmentację i ulepszenia, wybierz opcję "utwórz szablon pomiaru" na pasku narzędzi po prawej stronie.
38. Zmień nazwę szablonu na, jeśli chcesz.
39. W oknie szablonu pomiaru najedź kursorem na figurę komórki clipart. Przytrzymaj Ctrl i zaznacz komórkę.
40. Odznacz "parametr domyślny" i zaznacz "parametr obszaru" w sekcji "morfologia".
41. Wyjdź z okna 'szablon'
.
42. Wybierz ikonę utworzoną w przepisie pomiaru.
43. Zmień nazwę przepisu.
44. Przejdź do zakładki "szablon" w prawym górnym rogu i wybierz ją.
45. Przeciągnij i upuść wcześniej utworzony szablon pomiaru do okna pomiaru.
46. Kliknij "Tak", aby kontynuować.
47. W oknie receptury pomiaru wybierz "Mapowania kanałów", a następnie "Cała komórka".
48. Wybierz opcję "Mapowania masek".
49. Następnie wybierz opcję "Cała komórka", aby uzyskać ulepszoną maskę.
50. Wybierz opcję "Receptura pomiaru" w zakładce Receptura w oknie głównym.
51. Wybierz ikonę "Zapisz" w oknie Receptura pomiaru.
52. Następnie zamknij okno.
53. Teraz zamknij i ponownie otwórz "FOV".
54. Kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę "Przepis", wybierz "Zablokuj listę przepisów" i uruchom przepisy sekwencyjnie na danych wideo.

Część 4: Sprawdzanie dokładności receptury za pomocą oprogramowania Photoshop

Aby zweryfikować recepturę utworzoną za pomocą (oprogramowania CL-Quant), te same dane mogą być analizowane ręcznie za pomocą Adobe Photoshop. Na potrzeby tej analizy analizowano co 10 klatkę (co 70 minut punktu czasowego) w celu zmierzenia wielkości kolonii w ciągu 48 godzin.

1. Otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop.
2. Kliknij narzędzie Magiczna różdżka na pasku narzędzi.
3. Kliknij obszar wokół kolonii, aby pokryć całe pole z wyjątkiem regionu kolonii.
4. Kliknij "Edytuj w trybie szybkiej maski" na pasku narzędzi i kliknij kolonię, aby została wybrana.
5. Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii pasuje do jej obrzeża, a nie do jej wnętrza. Jeśli linia kropkowana nie znajduje się wokół obrzeża, zmień odpowiednio wartość tolerancji na górnym pasku narzędzi.
6. Przejdź do menu rozwijanego "Okno" i kliknij "Histogram".
7. Zapisz wartość piksela, gdy cache=1. Jeśli wartość cache wynosi 2, kliknij przycisk '!', aby zmienić wartość na cache 1, a następnie zanotuj wartość piksela.
8. Powtórz powyższy proces dla każdej 10 klatki. W razie potrzeby można użyć mniejszej liczby ramek.
9. Dane zebrane za pomocą programu Photoshop i CL-Quant można następnie wykreślić razem. Jeśli receptury CL-Quant są prawdziwe, krzywe dla analizy Photoshop i CL-Quant powinny być bardzo podobne (rys. 3-5).
10. Jeśli receptury opracowane za pomocą CL-Quant są zgodne z prawdą, można je niezawodnie zastosować do innych danych wideo.
11. Wartość wykorzystania bioinformatyki wideo w tej analizie polega na tym, że po opracowaniu i zweryfikowaniu receptur segmentacji, ulepszania i pomiaru, będą one przeprowadzać analizę znacznie szybciej i dokładniej niż człowiek korzystający z programu Photoshop.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Taśma filmowa kolonii hESC pokazująca klatki w różnych momentach w ciągu 48 godzin wzrostu w tomografii komputerowej BioStation. Klatki zostały wykonane w odstępach 7-minutowych.

Rysunek 2: (A) Obraz hESC z maską umieszczoną na kolonii według przepisu na segmentację. Obszary gruzu i tła są również zamaskowane, co wskazuje, że potrzebna jest receptura ulepszania, aby poprawić dokładność oceny. (B) Obraz tej samej kolonii, jak pokazano w "A" po wykonaniu ulepszenia. Maska zaznacza teraz tylko kolonię, a szum został wyeliminowany z zaznaczenia.

Rysunek 3: Wykres przedstawiający wzrost wielkości kolonii (w pikselach) w ciągu 48 godzin, określony za pomocą oprogramowania CL-Quant i Photoshopa. Ten wykres przedstawia surowe dane i pokazuje, że kolonie zaczynają się od różnych rozmiarów. Pokazuje to również, że obie metody pomiaru są ze sobą zgodne.

Rysunek 4: Wykres przedstawiający te same dane, co na rysunku 3 po normalizacji, aby pokazać procentowy wzrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin. Pokazuje to, że tempo wzrostu jest podobne niezależnie od początkowej wielkości kolonii i że obie miary analizy dają podobne wyniki.

Rysunek 5: Wykres przedstawiający średnie dla znormalizowanych danych na rysunku 4. Wykres ten wyraźnie pokazuje dobrą zgodność między analizami wykonanymi przy użyciu bioinformatyki wideo (oprogramowanie CL-Quant) a Photoshopem i stwierdza, że przepis jest prawdziwy. Niewielkie zmniejszenie obszaru dla danych programu Photoshop w klatce 325 wynika z tego, że kilka filmów nie zostało uwzględnionych w analizie programu Photoshop.

Dyskusja

Narzędzia bioinformatyczne wideo są potężne w szybkim wydobywaniu danych z obrazów wideo. Nasz protokół ilościowego oznaczania wzrostu kolonii hESC demonstruje jedno zastosowanie bioinformatyki wideo do problemu biologicznego. Metoda ta ma charakter ilościowy i ma tę interesującą cechę, że ujawnia dane z poszczególnych kolonii hESC. Receptury bioinformatyczne wideo mogą być opracowywane w celu monitorowania innych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, migracja, apoptoza i przyłączanie komórek do substratu oraz p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
mTeSR1 Ludzkie embrionalne komórki macierzyste do utrzymania pożywki Technologie	macierzystych	05850	lub dowolna odpowiednia pożywka do hodowli hESC.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	lub innym odpowiednim podłożem.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	lub innego odpowiedniego enzymu odłączającego.
Koraliki szklane 3mm	Fisher Scientific	11-312A	opcjonalnie.
12-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	BD Biosciences	353043	lub dowolny inny format płytki.
Nikon BioStation CT/IM			lub inny inkubator/mikroskop odpowiedni do zbierania danych wideo.
Oprogramowanie CL-Quant (Nikon) i/lub Photoshop (Adobe).