Instylacje wewnątrzkrtaniowe pozwalają na dostarczanie substancji bezpośrednio do płuc. Procedura ta umożliwia wprowadzenie instylatu do dystalnych obszarów płuc, dlatego jest często stosowana w badaniach nad pęcherzykami pęcherzykowymi. Przedstawiamy szczegółowy protokół dla zwierząt przeżywalnych dotyczący wykonywania instylacji wewnątrzkrtaniowych u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednia instylacja substancji rozpuszczonych do tchawicy myszy w celu podania do płuc
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Instylacje wewnątrztachealne pozwalają na dostarczanie substancji bezpośrednio do płuc. Procedura ta ma na celu dostarczenie preparatu do obszarów dystalnych płuc, dlatego często jest stosowana w badaniach nad pęcherzykami płucnymi. Przedstawiamy szczegółowy protokół przeżycia dla przeprowadzania instylacji wewnątrztachealnych u myszy. Dzięki temu podejściu możliwe jest ukierunkowane dostarczenie badanych substancji rozpuszczonych lub ciał stałych (takich jak leki do inhalacji, surfaktanty, wirusy i krótkie oligonukleotydy) do dystalnych części płuc. Instylacje wewnątrztachealne mogą być preferowaną metodą w porównaniu z protokołami inhalacyjnymi, które mogą oddziaływać głównie na górne drogi oddechowe i potencjalnie narażać badacza na kontakt z niebezpiecznymi substancjami. Ponadto, stosując protokół instylacji wewnątrztachealnej, zwierzęta mogą w pełni dojść do siebie po tej nieinwazyjnej procedurze. Pozwala to na wykonywanie kolejnych pomiarów fizjologicznych u zwierząt testowych lub ponowne przeprowadzenie instylacji u tego samego osobnika. Ilość wprowadzonego do płuc preparatu musi zostać dokładnie określona i zrównoważona osmotycznie, aby zapewnić regenerację zwierzęcia. Zazwyczaj do płuc myszy można wprowadzić objętość od 30-75 μL preparatu.
Protokół
1. Znieczulenie
- Znieczulenie myszy izofluranem może ułatwić manipulację i unieruchomienie zwierząt przed podaniem znieczulenia drogą dostępu do jamy otrzewnej. Stosowanie środka znieczulającego drogą wziewną może być lub nie być odpowiednie dla konkretnego badania: najpierw określ wpływ stosowania izofluranu lub innego środka znieczulającego na planowane badanie płuc.
- Znieczul zwierzęta izofluranem. Film przedstawia użycie komory z waporyzatorem do izofluranu ustawionego na 2% izofluranu zmieszanego z tlenem. Jeśli nie dysponujesz komorą do izofluranu, możesz alternatywnie zastosować standardowe techniki ekspozycji metodą otwartych kropel. Zamknij szczury w kloszu (lub innym odpowiednim nieporowatym pojemniku) z przymocowaną do dna metalową siatką. Na gazik umieszczony pod siatką nanieś mieszaninę 30% v/v izofluranu w glikolu propylenowym. Zastosowanie siatki gwarantuje, że zwierzę nie wejdzie w kontakt z nasączonym izofluranem gazikiem, co mogłoby spowodować podrażnienie skóry i potencjalne przedawkowanie. Po krótkiej ekspozycji na izofluran zwierzę powinno być znieczulone; nie powinno wykazywać odruchu prostowania przy przechyleniu naczynia ani nie powinno reagować na uciśnięcie palca u nogi.
- Dalszą sedację myszy przeprowadź za pomocą wstrzyknięcia do jamy otrzewnej mieszaniny ksylazyny i ketaminy. (Podczas wykonywania iniekcji dootrzewnowych dobrą praktyką jest lekkie odessanie tłoka, aby upewnić się, że nie przebito fragmentów jelit lub innych organów krytycznych). Wymieszaj 150 μL ksylazyny (10 mg/mL) z 10 μL ketaminy (10 mg/mL) w 850 μL 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Dla myszy dawka wyniesie około 80 μL na 10 g masy ciała. Końcowe stężenia wyniosą 10 mg/Kg ksylazyny i 100 mg/Kg ketaminy. Zwierzęta powinny być utrzymywane w suchym i izolowanym otoczeniu, aby zapobiec nadmiernej utracie ciepła z organizmu. Na oczy można nałożyć maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówek.
2. Przygotowanie pola operacyjnego
- Golenie obszaru, w którym zostanie wykonane cięcie chirurgiczne, zapobiega kontaminacji z obszarów nieprzygotowanych. Do krótkiego ścięcia futra zwierzęcia można użyć maszynki elektrycznej. Obszar wygolony powinien być większy niż miejsce nacięcia.
- Następnie należy zastosować krem do depilacji, np. Nair, aby usunąć pozostałe włosy. Nałóż grubą warstwę kremu do depilacji na obszar operacyjny i pozostaw na 3 minuty. Usuń futro i krem za pomocą wilgotnego ręcznika. Nie pozostawiaj kremu do depilacji na skórze dłużej niż przez 10 minut.
- Użyj 70% alkoholu lub alternatywnego roztworu do szorowania, aby aseptycznie przygotować obszar chirurgiczny.
3. Procedura chirurgiczna
- Umieść znieczulone zwierzę na nachylonej desce chirurgicznej lub pod kątem na stojaku ograniczającym ruchy.
- Wykonaj niewielkie nacięcie w przedniej części szyi (w obszarze gardła).
- Odsuń mięsień obrzewny szyi oraz przednie mięśnie tchawicy, aby uwidocznić i uzyskać dostęp do pierścieni tchawicy.
- Zazwyczaj objętość wstrzykiwania do tchawicy wynosi 3 μl na gram masy ciała (końcowa objętość około 30-75 μL). Podaj odpowiednią ilość roztworu, używając strzykawki podskórnej o pojemności 1 mL z igłą 30 G o długości 5/16 cala. Trzymaj strzykawkę ściętym końcem igły do góry i równolegle do tchawicy, a następnie wstrzyknij całą objętość roztworu do tchawicy.
- Po podaniu substancji do płuc zwierzę może zareagować gwałtownym wdechem. Wprowadzenie powietrza przez strzykawkę i obserwacja, czy płuca się rozszerzają, pozwoli również potwierdzić prawidłowe wykonanie intubacji.
- Wyjmij strzykawkę z tchawicy.
4. Szwy.
- Złapać trzpień igły (najgrubszą część igły, do której przymocowany jest materiał szewny) za pomocą igłotrzymacza.
- Przebić skórę końcówką igły pod kątem 90°, w odległości około 1-3 mm od brzegu rany, w zależności od grubości skóry. Chwycić wychodzącą igłę po jednym przejściu przez tkankę. Proste szwy, wiązane pojedynczo, skutecznie zamkną ranę.
5. Wybudzanie zwierząt
- Zwierzęta powinny całkowicie dojść do siebie po znieczuleniu i zabiegu chirurgicznym w czasie od 3 do 24 godzin.
6. Reprezentatywne wyniki
Wlew śródoddychowy związku fluorescencyjnego, Cy5.5 sprzężonego z dekstranem, wykazuje pomyślne wprowadzenie związku fluorescencyjnego do płuc myszy B6 (Rysunek 1). Barwnik fluorescencyjny jest skierowany głównie do płuc i jest rozmieszczony równomiernie. Sygnał fluorescencyjny w przewodzie pokarmowym bezpośrednio po zabiegu wskazuje, że podczas procedury doszło do przypadkowego intubowania przełyku (Rysunek 2). Badacze mogą również zweryfikować celowe dostarczenie związków do płuc oraz sprawdzić rozmieszczenie wlewu po zabiegu poprzez napompowanie płuc i przygotowanie przekrojów tkanki płucnej (2; 3) lub utrwalonych próbek histologicznych.
Rysunek 1. Sygnał fluorescencyjny Cy5.5 zarejestrowany wspólnie z obrazem rentgenowskim w prawidłowo poddanym instylacji płucu myszy. 1,4 mg dekstranu Cy5.5 (o stężeniu 10 μg/μL) podano do tchawicy płuc myszy szczepu B6. Sygnał Cy5.5 wykryto przy użyciu filtra wzbudzenia 675 nm i filtra emisyjnego 695 nm.
Rycina 2. Korejestracja sygnału fluorescencyjnego z nałożonym obrazem rentgenowskim u myszy z błędnie wykonaną instillacją. Nieprawidłowa intubacja przełyku podczas protokołu instillacji tchawiczej prowadzi do dostarczenia Cy5.5 do jelit.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Instylacje wewnątrztrachealne były wykorzystywane w wielu różnych badaniach do oceny toksyczności związków testowych (6), indukowania płucom pęcherzykowego uszkodzenia płuc (4; 7), zastępowania surfaktantów (8), a także zmiany ekspresji genów poprzez dostarczanie krótkich oligonukleotydów bezpośrednio do płuc (5). Obecnie badamy zastosowanie instylacji: 1) fluorescencyjnego materiału wrażliwego na utlenianie do płuc w celu pomiaru stresu oksydacyjnego in vivo w warunkach prawidłowych i patofizjologicznych, a także 2) ins...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez NIH K99 HL09222601 oraz S&R Foundation Ryaji Uneo Award przyznany dla MNH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Izofluran | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Ksylazyna | Lloyd, Inc. | Wniosek o rejestrację nowego leku weterynaryjnego nr 139-236 | |
| Ketamina | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Dostępny w aptekach | ||
| Strzykawka 1mL do podawania podskórnego | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| Sznur nylonowy 4-0 | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
Bibliografia
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
