Rejestracja reakcji behawioralnych na odbicie u raków

Podsumowanie

Opracowaliśmy dwie metody badania wpływu bodźców wzrokowych na zachowanie w warunkach braku bodźców dotykowych i chemicznych. Pierwsza metoda polega na filmowaniu reakcji raków na odbijające światło ścianki akwarium; druga bada wpływ bodźców wzrokowych dostarczanych przez żywego raka znajdującego się za przezroczystą przegrodą.

Streszczenie

Zachowanie społeczne zależy od bodźców sensorycznych pochodzących z układów wzrokowego, mechanicznego i węchowego. Ważną kwestią jest określenie względnej roli każdej z tych modalności sensorycznych w kierowaniu zachowaniem. Rola bodźców wzrokowych była badana poprzez izolację bodźców wizualnych od bodźców mechanicznych i chemosensorycznych. W niektórych badaniach (Bruski & Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) sygnały wzrokowe były eliminowane za pomocą opasek na oczy lub niskiego natężenia światła, co pozwoliło na wyjaśnienie wpływu pozostałych modalności sensorycznych. Alternatywnym podejściem jest badanie efektów bodźców wzrokowych w obecności braku odpowiednich wskazówek mechanicznych i chemosensorycznych. Celem tego podejścia jest zidentyfikowanie wyłącznej roli bodźców wzrokowych.

Zastosowano dwie metody dostarczania bodźców wzrokowych rakom, wykluczając jednocześnie sygnały chemiczne i mechaniczne. W pierwszej metodzie raki są nagrywane w akwarium, w którym połowa ścian jest pokryta lustrami w celu stworzenia środowiska refleksyjnego, a druga połowa pokryta jest plastikiem o powierzchni nielustrzanej (matowej). Daje to rakom możliwość wyboru między środowiskiem refleksyjnym a nielustrzanym. Środowisko refleksyjne dostarcza bodźców wzrokowych w postaci odbić obrazu raka podczas jego poruszania się w połowie zbiornika; bodźce te są nieobecne w nielustrzanej części akwarium. Alternatywna metoda polega na nagrywaniu zachowania raków w akwarium z mniejszymi komorami na obu końcach, w której w jednej małej komorze znajduje się rak dostarczający bodźce wzrokowe, a w przeciwległej małej komorze znajduje się obiekt obojętny, zapewniający bodziec wzrokowy z nieruchomego źródła niebędącego rakiem.

Nasze opublikowane wyniki wskazują, że reakcje raków na środowisko refleksyjne zależą od socjalizacji i rangi dominacji. Raki socjalizowane spędzały więcej czasu w środowisku refleksyjnym i częściej przejawiały w nim określone zachowania niż w środowisku nierefleksyjnym; u raków izolowanych nie zaobserwowano takich różnic. Raki trzymane w parach tej samej płci wykształciły rangę społeczną jako osobnik dominujący lub podporządkowany. Reakcje na odbicie różniły się pomiędzy rakami dominującymi a podporządkowanymi (May & Mercier, 2006; May & Mercier, 2007). Raki dominujące spędzały więcej czasu po stronie refleksyjnej, częściej wchodziły w refleksyjne narożniki i spędzały w nich więcej czasu w porównaniu ze stroną nierefleksyjną. Raki podporządkowane częściej poruszały się tyłem po stronie refleksyjnej niż po stronie nierefleksyjnej. Wstępne dane sugerują podobne efekty wynikające z sygnałów wizualnych dostarczanych przez raka znajdującego się w małej przyległej komorze (May et al., 2008).

Protokół

1. Socjalizacja

1. Aby wyeliminować istniejące hierarchie społeczne, każdy rak jest utrzymywany przez 7–14 dni w osobnym plastikowym pojemniku (30 cm długości x 17,5 cm szerokości x 13 cm głębokości), wypełnionym filtrowaną, napowietrzaną wodą, z małą plastikową doniczką służącą jako schronienie. W przypadku użycia przezroczystych pojemników, pomiędzy nimi umieszcza się przegrodę (np. ręcznik papierowy), aby zapewnić izolację wizualną raków.
2. Raki w grupie „Isolated” pozostają w izolacji przez dodatkowe 3–14 dni. Wodę wymienia się, a raki karmi 3 razy w tygodniu.
3. Aby ustanowić hierarchię społeczną, po wstępnej izolacji raki umieszcza się w parach tej samej płci. Raki są ważone, a ich długość ciała jest mierzona (od rostrum do telsonu); pary są dobierane tak, aby różnica w wadze i długości nie przekraczała 10%. Na karapaks każdego raka nanosi się białą farbę akrylową w celu identyfikacji osobników (zazwyczaj jednemu osobnikowi nanosi się kropkę, a drugiemu kreskę).
4. Po 30-minutowym okresie odpoczynku każda para raków może wejść w interakcję w czystym, białym plastikowym pojemniku (48 cm długości x 25 cm szerokości x 13 cm głębokości), wypełnionym do połowy filtrowaną, napowietrzaną wodą (temperatura pokojowa). Spotkanie to jest rejestrowane na kasecie VHS za pomocą kamery podłączonej do magnetowidu lub zapisywane na komputerze za pomocą kamery internetowej. Interakcja ta pozwala na wykształcenie się hierarchii dominacji.
5. Po wstępnej interakcji każda para raków jest utrzymywana razem w większym plastikowym pojemniku (58 cm długości x 30 cm szerokości x 35 cm głębokości) przez kolejne 3–14 dni. Do pojemnika tego doprowadzona jest woda krążąca z systemu filtracji. Jako schronienie zapewnia się pojedynczą rurkę PVC (długość ok. 10 cm).

2. Konstrukcja akwarium testowego i kontroli

Metoda I

1. W celu zbadania reakcji na środowisko odbijające stosuje się akwarium szklane lub z pleksiglasu (52 cm długości x 25 cm szerokości x 30 cm wysokości) (Rysunek 1).
2. Jedno lustro (25 cm długości x 20 cm wysokości) umieszcza się na jednym z końców akwarium i mocuje za pomocą kleju lub wosku montażowego. Dwa lustra (26 cm długości x 20 cm wysokości) umieszcza się po bokach, przylegając do lustra końcowego, i mocuje klejem lub woskiem.
3. Pozostałe ścianki pokrywa się matową folią okienną. Folia ta eliminuje odbicia, nie wpływając na warunki oświetlenia. Może być wymagane lekkie przeszlifowanie folii, aby upewnić się, że jest ona całkowicie matowa.

Metoda II

4. Aby zbadać reakcje na bodźce wzrokowe dostarczane przez żywego rak ("rak źródłowy"), stosuje się akwarium z pleksiglasu z dwiema komorami końcowymi (Rysunek 2). Akwarium składa się z dużej przedziału centralnego (48 cm długości x 26 cm szerokości x 26 cm wysokości) oraz dwóch mniejszych przedziałów końcowych o tej samej wielkości (12 cm długości x 26 cm szerokości i 26 cm wysokości). Przedziały końcowe są oddzielone od przedziału centralnego przezroczystym pleksiglasem, który jest uszczelniony, aby zapobiec przenikaniu wody i sygnałów chemicznych między przedziałami.
5. Zewnętrzny obwód całego akwarium jest pokryty nierefleksyjnym matowym plastikiem, z wyjątkiem dwóch przezroczystych barier na każdym końcu.
6. Jako kontrolę wykorzystuje się sześcian wykonany z gliny modelarskiej (np. Sculptee), aby zapewnić bodziec wzrokowy pochodzący z obiektu obojętnego. Sześcian (3,5 cm x 3,0 cm x 3,3 cm) ma objętość zbliżoną do objętości raka źródłowego i jest pomalowany na podobny czerwony kolor.

3. Trening wizualny

Metoda I

1. Rakówy są nagrywane w zbiorniku z lustrem / matową powierzchnią od 3 do 14 dni po walce w celu ustalenia statusu dominacji.
2. Rakówy są umieszczane pojedynczo w pojemnikach Tupperware zawierających napowietrzaną, filtrowaną wodę oraz plastikową doniczkę służącą jako schronienie. Rakówy są przenoszone do pomieszczenia testowego i mają 30 min na aklimatyzację przed badaniem.
3. Akwarium testowe, w połowie wyłożone lustrami, a w połowie nieodbijającym plastikiem, jest napełniane napowietrzaną, filtrowaną wodą do głębokości około 20 cm.
4. Kamera cyfrowa jest podłączona za pomocą kabli audio/wideo do magnetowidu VHS i umieszczona nad akwarium na wysokości pozwalającej na widoczność całego zbiornika. Filmy są rejestrowane na kasetach VHS. Alternatywnie można użyć kamery internetowej podłączonej do komputera, a filmy nagrywać za pomocą programu do tworzenia filmów i zapisywać na DVD.
5. Jeden rak z pary jest delikatnie umieszczany w centrum akwarium przy użyciu doniczki, a jego aktywność jest rejestrowana przez 20 min. Podczas nagrywania w pomieszczeniu nie przebywa żadna osoba, aby zminimalizować zakłócenia wynikające z zewnętrznych bodźców wizualnych i słuchowych. Dokładano wszelkich starań, aby zapewnić ciszę w środowisku nagrywania.
6. Po zakończeniu testu rak jest usuwany, a zbiornik opróżniany, płukany i ponownie napełniany wodą.
7. W celu zrównoważenia warunków eksperymentalnych akwarium jest obracane tak, aby lustra znajdowały się po przeciwnej stronie pomieszczenia. Pomaga to skompensować nieznane czynniki, które mogłyby sprawić, że raki będą preferować jedną stronę akwarium.
8. Drugi osobnik z pary jest następnie badany w ten sam sposób co pierwszy.

Metoda II

9. Zgodnie z opisem w Metodzie I, raki są przenoszone do pomieszczenia testowego i nagrywane za pomocą tego samego sprzętu rejestrującego.
10. Wszystkie komory (środkową komorę testową oraz dwie komory końcowe) napełnia się napowietrzoną, filtrowaną wodą do wysokości około 20 cm.
11. Raka o wielkości zbliżonej do raka badanego umieszcza się w jednej z komór końcowych, a kostkę kontrolną w drugiej.
12. Przy użyciu schronienia w formie doniczki, badanego raka ostrożnie umieszcza się w centrum akwarium i nagrywa przez 20 min.
13. Po zakończeniu testu akwarium jest opróżniane, płukane i ponownie napełniane wodą.
14. Przed zbadaniem drugiego osobnika z pary, raka źródłowego i kostkę kontrolną przenosi się do przeciwległych komór końcowych w celu zrównoważenia warunków.

4. Analiza odpowiedzi na bodźce wzrokowe

Metoda I

1. Aby badacz nie znał statusu społecznego raka, zachowanie w akwarium z lustrem / matową ścianką analizuje się przed analizą prób zachowań walki.
2. Rejestruje się ilość czasu, jaki rak spędza po każdej stronie akwarium. Przyjmuje się, że rak przechodzi z jednej strony na drugą, gdy coxae chelipedów przekroczą linię środkową zbiornika (Rysunek 3).
3. Rejestruje się również częstotliwość takich zachowań jak zapędzanie w róg, obracanie się, przekraczanie linii środkowej, zamieranie oraz chód wsteczny (opisy znajdują się w Tabeli 1).
4. Zachowania wykazane po refleksyjnej stronie zbiornika porównuje się z zachowaniami wykazanymi po stronie nierefleksyjnej, stosując test t dla prób zależnych dla każdej grupy społecznej.

Metoda II

5. Podobnie jak w Metodzie I, przed analizą prób walki analizowane są nagrania wideo zachowań raków.
6. Czas, jaki raki spędzają po każdej ze stron akwarium, jest rejestrowany zgodnie z opisem w Metodzie I.
7. Rejestrowana jest częstotliwość zapędzania w róg, ustawiania się przodem do końca akwarium, obracania się, przecinania drogi, podnoszenia przodu ciała oraz chodu wstecznego (Tabela 1).
8. Zachowania wykazane po stronie z rakiem źródłowym są porównywane z zachowaniami wykazanymi po stronie z kostką kontrolną przy użyciu testu t dla prób zależnych dla każdej grupy społecznej.

5. Analiza walk

1. Nagrania zachowań agresywnych z pierwszych 30 min kojarzenia są analizowane i oceniane. Każna 30-minutowa sesja nagraniowa obejmuje kilka starć, podczas których rakowiec nawiązuje kontakt za pomocą szczypiec i/lub anten. W trakcie tych starć chele są zazwyczaj wykorzystywane do odpychania, uderzania lub chwytania przeciwnika, a anteny bywają używane do smagania przeciwnika. Rakowiec może próbować przewrócić przeciwnika i przycisnąć go do dna. Każde starcie kończy się, gdy jeden z rakowców wycofuje się, idąc do tyłu lub gwałtownie uginając ogon w celu wykonania tzw. „pływania ucieczkowego”.
2. Odnotowuje się liczbę starć agonistycznych oraz tożsamość rakowca (ustaloną na podstawie oznaczenia farbą na klatopławie), który wycofuje się z każdego starcia. Rakowiec, który przegrywa większość starć w każdej 30-minutowej sesji, zostaje uznany za przegranego, a drugi rakowiec za zwycięzcę.

6. Reprezentatywne wyniki

Podczas 30-minutowego okresu walki wszystkie pary wykazują zachowania agonistyczne. Zachowania te obejmują dotykanie czułkami, rzucanie się, pchanie, chwytanie, uderzanie szczypcami oraz wywracanie przeciwnika, co opisano w innych opracowaniach (np. May & Mercier 2006, 2007). Ostatecznie jeden rak w każdej parze konsekwentnie się wycofuje i unika dalszego kontaktu. Rak wycofujący się jest uznawany za przegranego i klasyfikowany jako podrzędny, natomiast rak zwycięski jest klasyfikowany jako dominujący.

Rangę można również monitorować przez cały okres wspólnego przetrzymywania, obserwując zachowanie raków w zbiorniku, w którym znajduje się tylko jedna plastikowa rurka służąca jako schronienie. Rak dominujący niezmiennie zajmuje schronienie, podczas gdy rak podporządkowany tego nie robi. Rak podporządkowany często porusza się z chelami trzymanymi blisko siebie i wysuniętymi do przodu, natomiast rak dominujący zazwyczaj porusza się z chelami uniesionymi i rozstawionymi szerzej (Guiasu & Dunham, 1998). Po dodaniu nowego pokarmu do zbiornika, rak dominujący zazwyczaj pierwszy go pobiera. W naszych badaniach nad P. clarkii (np. May & Mercier 2006, 2007) zazwyczaj nie stwierdzono zmian w hierarchii po trzech dniach ciągłego wspólnego przetrzymywania.

W rzadkich przypadkach jeden z osobników pary ginie przed zakończeniem okresu parowania. Jest to bardziej prawdopodobne w przypadku długiego okresu parowania (np. 14 dni) oraz gdy rak są zbyt zbliżone pod względem rozmiaru lub masy. Zgonów można zatem uniknąć, dopuszczając około 10% różnicy w masie. Jeśli jeden z osobników pary zginie, dane z drugiego osobnika nie są wliczane do badania.

Rak dominujący i podporządkowany zazwyczaj wykazują odmienne reakcje na środowisko refleksyjne. Raki dominujące konsekwentnie spędzają więcej czasu po stronie refleksyjnej, podczas gdy raki podporządkowane i odizolowane nie wykazują takiej tendencji (May & Mercier, 2006, 2007). Raki dominujące częściej również wykazują zachowania polegające na zapieraniu się w narożniku i odwracaniu po stronie refleksyjnej niż po stronie nierefleksyjnej, czego zazwyczaj nie obserwuje się u osobników odizolowanych i podporządkowanych. Takie różnice między rakiem dominującym a podporządkowanym nie kształtują się jednak natychmiast, lecz rozwijają się w ciągu 3–14 dni okresu parowania (May & Mercier, 2007).

Wstępne dowody wskazują, że dominujące i podporządkowane rakowie reagują w różny sposób na bodźce wizualne dostarczane przez żywego raka (raka źródłowego) po 3 dniach kojarzenia (May et al., 2008). Rakowie dominujące spędzają więcej czasu po stronie akwarium, w której znajduje się rak źródłowy, i dłużej przebywają w kącie po tej stronie, natomiast u raków podporządkowanych nie obserwuje się takich różnic między obiema stronami.

Zachowanie	Opis
pokonywanie zakrętów	skierowane w stronę narożnika akwarium i pozostanie w tej pozycji przez co najmniej 5 s, przy czym końce obu szczypiec dotykają różnych ścianek (Rycina 4)
czołowanie	przylega do ściany na jednym z końców zbiornika przez co najmniej 5 s, przy czym końcówka co najmniej jednego chwytnika dotyka ściany końcowej (Rysunek 5)
toczenie	zmiana kierunku ścieżki spaceru z ruchu zgodnego z ruchem wskazówek zegara na przeciwny do ruchu wskazówek zegara lub i odwrotnie (Rycina 6)
krzyżowanie	opuszczenie obwodu akwarium i przejście co najmniej jednej długości ciała do dowolnej innej ściany (Rysunek 7)
chodzenie tyłem	chodzenie do tyłu na odległość co najmniej jednej długości ciała
mrożenie	nagłe ustanie wszelkich widocznych ruchów, w tym ruchów odnóży i czułków, przez co najmniej 5 s
stawanie dęba	stanie na czwartej i piątej parze odnóży krocznych przy jednoczesnym unoszeniu brzusznej strony klatki piersiowej w kierunku ściany i opieraniu co najmniej jednego odnóża krocznego o ścianę

Tabela 1. Zachowania wykazujące przez P. clarkii w środkowej komorze zbiornika testowego.

Rysunek 1. Schemat akwarium użytego w Metodzie I. Połowa akwarium jest wyłożona lustrami, natomiast druga połowa jest wyłożona nieodbijającym światła plastikiem.

Rycina 2. Schemat akwarium użytego w Metodzie II. Zbiornik ten składa się z obszaru centralnego, w którym umieszcza się badanego raka, oraz dwóch komór końcowych, oddzielonych nienaruszoną barierą z Pleksiglasu. W jednej komorze końcowej umieszcza się żywego raka, a w drugiej kostkę pełniącą funkcję kontrolną.

Rycina 3. Schemat akwarium testowego z linią środkową przedstawioną jako pionowa linia przerywana. Rak przechodzi z jednej strony na drugą, gdy coxae chelipedów przekraczają linię środkową.

Rycina 4. Schemat wskazujący pozycję raka podczas zapędzania się w kąt. Należy zauważyć, że końcówki obu szczypiec dotykają różnych ścian.

Rycina 5. Schemat wskazujący pozycję raka skierowanego w stronę ściany końcowej. Należy zauważyć, że obie chele dotykają tej samej ściany.

Rysunek 6. Schemat obrazujący skręcanie. Zmiana kierunku ruchu stanowi skręt. Skręty mogą następować w narożniku (np. z kierunku 1 do kierunku 2 oraz z kierunku 4 do kierunku 5) lub z boku (nie pokazano). Wjazd w narożnik i opuszczenie go w tym samym kierunku (np. z kierunku 1 do kierunku 3) nie jest skrętem.

Rycina 7. Schemat przedstawiający zachowanie podczas przekraczania. Przekraczanie następuje, gdy rak oddala się od jednej ściany i płynie w stronę drugiej ściany, zachowując odległość co najmniej jednej długości ciała od najbliższej ściany (strzałka).

Rysunek 8. Fotografia przedstawiająca zachowanie polegające na prostowaniu się. Rak wspiera się na dwóch ostatnich odnóżach chodnych i unosi ciało w stronę ścianki, nawiązując kontakt przynajmniej jedną odnóżą chodną.

Dyskusja

Obserwacja, że dominujące raki spędzają więcej czasu w środowisku z powierzchnią odbijającą, sugeruje, że rozpoznają one odbite lustrzane odbicie jako osobnika tego samego gatunku, a bodźce wzrokowe są wystarczające do wywołania zachowania zbliżeniowego. Podobne wyniki uzyskane z wykorzystaniem żywego raka zamiast odbicia lustrzanego potwierdzają taką interpretację. Raki podporządkowane i izolowane nie wykazują takiej preferencji wobec środowiska odbijającego, a raki podporządkowane nie zdają się preferować żywego raka n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jednokomorowy zbiornik testowy	Brock University Machine Shop
Zbiornik testowy z komorą końcową	Brock University Machine Shop
Kontener izolacyjny	Rubbermaid		30 cm x 17,5 cm x 13 cm, otwory w pokrywie umożliwiające dopływ powietrza i światła po zamknięciu
Komora walki			48 cm x 25 cm x 13 cm
Komora zakwaterowania społecznego			58 cm x 30 cm x 35 cm
mała plastikowa doniczka			pełniąca rolę schronienia
Aparat Coolpix 4500	Nikon Instruments
Wideomagnetowid T120	RCA
Komputer			Windows Movie Maker lub inne oprogramowanie do akwizycji wideo
Kamera internetowa	Logitech
glina modelarska	Sculptee		do wykonania kostki kontrolnej
czerwona farba lateksowa	FolkArt		do wykonania kostki kontrolnej
lakier wodny	FolkArt		do wykonania kostki kontrolnej