Artykuł metodologiczny

Nowoczesne urządzenie i metoda wzmacniania działania leku

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1998

⸱

20 sierpnia 2010

 , 
1College of Pharmacy, Division of Pharmacology and Toxicology, University of Texas at Austin

W tym artykule

Podsumowanie

Procedury operacyjnego samopodawania leków oraz uwarunkowanej preferencji miejsca (CPP) są szeroko stosowane w badaniach do modelowania różnych komponentów wzmocnienia narkotykowego, konsumpcji i uzależnienia u ludzi. W niniejszym raporcie połączyliśmy tradycyjne metody CPP i samopodawania jako nowatorskie podejście do badania wzmocnienia i uzależnienia od leków u szczurów.

Streszczenie

Zwierzęce modele wzmocnienia okazały się użyteczne w zrozumieniu neurobiologicznych mechanizmów leżących u podstaw uzależnienia od narkotyków. Procedury operacyjnego samopodawania leków oraz uwarunkowanej preferencji miejsca (CPP) są szeroko stosowane w badaniach na zwierzętach do modelowania różnych komponentów wzmocnienia, konsumpcji i uzależnienia od substancji u ludzi. W niniejszym badaniu zastosowaliśmy nowatorskie podejście do badania wzmocnienia narkotykowego u szczurów, łącząc tradycyjne metodologie CPP i samopodawania. Zbudowaliśmy aparat wykorzystujący dwie komory operacyjne Med Associate, bodźce sensoryczne oraz strefę neutralną wykonaną z pleksiglasu. Modyfikacje te pozwoliły naszym eksperymentom objąć motywacyjne aspekty przyjmowania narkotyków poprzez samopodawanie oraz ocenę siły uwarunkowania lekiem/bodźcem w teście CPP bez podawania substancji. W naszych eksperymentach szczury samopodawały kokainę (0,75 mg/kg/inj, i.v.) podczas czterech (np. „krótkoterminowych”) lub ośmiu (np. „długoterminowych”) sesji w dniach naprzemiennych w środowisku operacyjnym zawierającym charakterystyczne bodźce sensoryczne (np. węchowe i wzrokowe). W dniach naprzemiennych, w innym środowisku operacyjnym (z innymi bodźcami), do samoinfuzji dostępny był roztwór soli fizjologicznej (0,1 ml, i.v.). Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej sesji samopodawania/parowania z bodźcem przeprowadzono test CPP. Zgodnie z typowymi wynikami CPP, odnotowano istotną preferencję dla komory powiązanej z samopodawaniem kokainy. Dodatkowo, u zwierząt poddanych eksperymentowi długoterminowemu, stwierdzono istotną dodatnią korelację między wielkością CPP a liczbą reakcji dźwigni wzmocnionych kokainą. Podsumowując, ten aparat i podejście są efektywne pod względem czasu i kosztów, mogą być wykorzystane do badania szerokiego zakresu zagadnień związanych z nadużywaniem narkotyków i zapewniają większą elastyczność w projektowaniu eksperymentów niż same metody CPP lub samopodawania.

Protokół

*=najważniejsze kroki

  1. Dobrze oswojone samce szczurów linii Sprague-Dawley są trenowane do naciskania dźwigni w zamian za nagrodę pokarmową (pellety sacharozy 45 mg; Bio-Serv, Frenchtown, NJ).
  2. *Cewniki dożylne są konstruowane z kaniul ze stali nierdzewnej (Plastics One, VA) i rurek Silastic. Szczury poddawane są zabiegowi chirurgicznemu kaniulacji żyły szyjnej, aby umożliwić samopodawanie leku. Znieczulenie stanowiła mieszanina tlenu (0,8 l/min; Airgas Southwest, Corpus Christi, TX) i izofluranu (2,5-4%; AErrane, Baxter Healthcare, Deerfield, IL) podawana przez system dostarczania gazu (VetEquip, Inc, Pleasanton, CA). Po operacji drożność cewnika jest utrzymywana poprzez codzienne przemywanie 0,1 ml roztworu soli fizjologicznej 0,9%, heparyny i Timentinu (antybiotyku). Gentamycyna, antybiotyk stosowany miejscowo, jest nakładana na czepkę czaszki i nacięcie klatki piersiowej w celu zapobiegania infekcjom. Wszystkie procedury chirurgiczne były zgodne z wytycznymi dotyczącymi sterylnych operacji na zwierzętach. Materiały chirurgiczne zostały poddane autoklawowaniu, a instrumenty wysterylizowano w roztworze chemicznym i sterylizatorze koralacyjnym. Implantowane cewniki przemywano metanolem, wodą i powietrzem podczas przygotowania, a następnie kąpano w 70% roztworze etanolu w dniu operacji. Szczury przygotowano do zabiegu poprzez ogolenie głowy i obszaru klatki piersiowej, a następnie nałożenie roztworu betadyny. Po operacji szczury były monitorowane przez kilka godzin przed powrotem do kolonii zwierząt.
  3. Kokaina (NIDA Drug Inventory and Supply and Control Program; RTI International, Research Triangle Park, NC) użyta w tym eksperymencie została rozpuszczona w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej (0,9%) w odpowiednich stężeniach dawek zgodnie z wagą zwierząt. Roztwory kokainy były następnie filtrowane przez sterylne filtry strzykawkowe 0,2 µm przed codziennym użyciem.
  4. *Aparat składa się z dwóch operantowych komór z pojedynczą dźwignią (28 x 2 x 21 cm), wyposażonych w światła pokojowe i stymulujące oraz 3 zestawy fotokomórek (Med Associates, St. Albans, VT). Komory są połączone ze sobą zbudowanym z pleksiglasu korytarzem (21 x 25 x 25 cm). Korytarz składa się z dwóch czarnych ścian z białymi pasami i dwóch metalowych ścian, przezroczystej góry z pleksiglasu oraz białej podłogi z pleksiglasu. Dwie komory operantowe mają podłogi z prętów stalowych (4,8 mm) zamontowane nad wyjmowanymi metalowymi dnami klatek. Wewnątrz komór operantowych umieszczono bodźce sensoryczne, aby stworzyć unikalne, rozróżnialne środowiska. Bodźce wizualne stanowią biały lub czarny materiał filcowy przymocowany do przedniej i tylnej ściany oraz nad górą klatki. Bodźce zapachowe to aromaty na bazie olejków (róża lub cynamon) nasycające kulkę waty umieszczoną pod kratą podłogi komory.
  5. Procedura eksperymentalna trwa wiele dni, zaczynając od testów preferencji bazowej (2 dni), po których następują sesje samopodawania leku (8 lub 16 dni), a kończąc testem warunkowanej preferencji miejsca (CPP) (1 dzień).
  6. *Podczas procedur testowania preferencji bazowej i CPP zwierzęta mają dostęp do obu komór operantowych. Kamera wideo zamontowana nad aparatem rejestruje wejścia i wyjścia szczurów z każdej komory. Fotokomórki w komorach wykrywają przerwanie wiązki, co służy jako wskaźnik aktywności lokomotorycznej. Podczas sesji samopodawania leku zwierzęta są ograniczone do jednej komory operantowej, podczas gdy dane dotyczące reakcji na dźwignię i aktywności lokomotorycznej (np. przerwania wiązek fotokomórek) są rejestrowane za pomocą komputera Med Pentium 100 MHZ z oprogramowaniem Med-PC (Med Associates, Inc., St. Albans, Vermont).
  7. Pomiary preferencji bazowej są zbierane przez dwa kolejne dni. Na początek szczur jest umieszczany w centralnym korytarzu z dostępem do obu komór operantowych przez okres 20 min. Natychmiast po umieszczeniu w komorze jednocześnie aktywowane są kamera wideo, program Med-PC i stoper. Dane dotyczące preferencji bazowej są oceniane podczas przeglądania nagrań wideo.
  8. *Sesje samopodawania leku rozpoczynają się dzień po ostatnim teście bazowym. W komorze przed zwierzęciem umieszcza się bodźce sensoryczne (np. białe lub czarne okładziny ścienne oraz zapachy róży lub cynamonu) oraz panel blokujący dostęp do centralnego korytarza z pleksiglasu. Aby rozpocząć sesję, zwierzę jest umieszczane w komorze, a rurka z zamontowanej strzykawki z lekiem zostaje podłączona do wlotu cewnika zwierzęcia. Po zamknięciu drzwi komory operantowej uruchamiany jest program Med-PC i stoper, a dostęp do kokainy jest możliwy przez 1 godzinę. Każda reakcja na dźwignię skutkuje infuzją 0,1 ml kokainy (0,75 mg/kg/inj) lub roztworu soli fizjologicznej. Na koniec każdej sesji samopodawania szczur jest odłączany od rurki z lekiem, wyjmowany z komory i umieszczany w domowej klatce.
  9. Dzień po ostatniej sesji samopodawania zwierzęta poddawane są testowi warunkowanej preferencji miejsca (CPP). Procedura jest taka sama, jak opisano dla pomiarów bazowych (patrz pkt 7).
  10. *Ocena danych: Eksperymentator, nieznający przydziału zwierząt do grup, określa czas, jaki zwierzęta spędzają w każdym przedziale, oglądając nagranie wideo w celu oceny wejść i wyjść między przedziałami przez okres 15 min (rozpoczynając 5 min po umieszczeniu w aparacie). Tę samą procedurę stosuje się do wyznaczania wyników preferencji bazowej i testu CPP.
  11. *Analiza danych: Różnice między pomiarami bazowymi a wynikami CPP po warunkowaniu są wykorzystywane do określenia efektów warunkowania lekiem. Wyniki różnicowe oblicza się, odejmując czas spędzony w przedziale powiązanym z solą fizjologiczną od czasu spędzonego w przedziale powiązanym z lekiem podczas testu CPP: (Liczba sekund w przedziale powiązanym z lekiem) - (Liczba sekund w przedziale powiązanym z solą fizjologiczną). Analizy statystyczne zmian wyników różnicowych od sesji bazowej do testowej mogą być wykonane w celu określenia efektów warunkowania lekiem.

Wyniki CPP można również wyrazić jako procentową różnicę wyników CPP (%). W niniejszym badaniu procentową różnicę wyników CPP obliczono najpierw poprzez wyznaczenie procentu czasu spędzonego w każdej komorze operacyjnej według wzoru: (Czas w komorze z lekiem (lub solą fizjologiczną)/Całkowity czas w każdej komorze) * 10 = % uwarunkowanej preferencji miejsca (CPP). Procentowa różnica wyników została określona zgodnie ze wzorem: (% sparowany z lekiem) - (% sparowany z solą fizjologiczną) = procentowa różnica wyników CPP.

Wykres odpowiedzi na kokainę: reakcje na dźwignię w porównaniu z warunkową preferencją miejsca w eksperymentach krótkoterminowych i długoterminowych.
Rysunek 1. Zależność między przyjęciem kokainy a warunkową preferencją miejsca. Analizy korelacji Pearsona wykazały istotną dodatnią korelację między całkowitą liczbą reakcji dźwigni wzmocnionych kokainą a procentową różnicą w wyniku CPP u zwierząt, które samopodawały kokainę przez osiem sesji (np. grupa długoterminowa; p < 0,05), ale nie dla zwierząt w grupie krótkoterminowej (np. 4 sesje z kokainą). Puste romby reprezentują poszczególne punkty danych dla grupy kokainy długoterminowej (n=9), a wypełnione kółka reprezentują grupę kokainy krótkoterminowej (n=8). Linie dopasowania są przerywane dla danych długoterminowych i ciągłe dla danych krótkoterminowych.

Dyskusja

Procedury operacyjnego dożylnego samopodawania leków oraz warunkowania miejsca są wiarygodnymi i walidowanymi modelami do badania neurobiologicznych podstaw zależności od substancji i uzależnień 1 2 3. Obie metody są powszechnie stosowane w przedklinicznych badaniach nad nadużywaniem leków i pozwalają mierzyć właściwości wzmacniające nadużywane substancje 4. Jednak obie metody posiadają niedoskonałości, które zostają poprawione w nowym aparacie i metodzie przedstawionych w niniejszej pracy 5.

Jedną z dużych wad tradycyjnych procedur CPP jest niekontrolowany tryb podawania leku. Ten sposób przyjmowania substancji prowadzi do innych wyników behawioralnych i neurochemicznych niż samoadministracja 6 7 8 9 10 11 i nie jest zgodny z ludzkim doświadczeniem przyjmowania leków. Ponadto, w przeciwieństwie do procedur samoadministracji leków, paradygmaty CPP nie pozwalają na pomiar progresywnych zmian w motywacji do przyjmowania leku, odzwierciedlonych przez zwiększone spożycie substancji; co stanowi domniemany punkt zwrotny w przejściu od rekreacyjnego używania narkotyków do niekontrolowanego uzależnienia. Jednakże zachowanie podczas samoadministracji leków również posiada ograniczenia interpretacyjne. Na przykład wskaźniki odpowiedzi są często wykorzystywane do wnioskowania o wartości nagrody, ale mogą być bezpośrednio wpływane przez efekty motoryczne samoadministrowanego leku, niezależnie od jego efektów motywacyjnych. Dodatkowo, liczba odpowiedzi wzmocnionych lekiem może być również wpływana przez obecność lub brak bodźców związanych z infuzją leku 12.

Znane jest, że szczury chętnie przyjmują kokainę w drodze samopodania, co wywołuje silne uwarunkowane preferencje miejsca przy różnych dawkach i drogach podania 2 13 14. Wyniki niniejszego badania potwierdzają wcześniejsze doniesienia dotyczące modeli wzmocnienia narkotykowego. Ponadto w grupie z długoterminową, ale nie krótkoterminową ekspozycją na kokainę, stwierdzono istotną dodatnią korelację między liczbą nacisnięć dźwigni wzmocnionych kokainą a wynikami CPP. Wyniki te sugerują, że uwarunkowanie miejsca i samopodanie nie muszą być izomorficznymi miarami nagrody. Na przykład można przypuszczać, że CPP po krótkotrwałej ekspozycji na kokainę odzwierciedla ostre właściwości wzmacniające, typowe dla początkowego rekreacyjnego używania narkotyków. Z drugiej strony, u szczurów z dłuższym doświadczeniem w przyjmowaniu kokainy, wzrost spożycia kokainy w odpowiedzi na rosnący poziom wzmocnienia uwarunkowanego może wskazywać na postępujące zmiany w wrażliwości na lek lub nasilone efekty nagradzające narkotyku w określonych populacjach.

Opisana metoda znajduje zastosowanie wykraczające poza ocenę pozytywnych efektów wzmacniających działania leków. Na przykład, przy przedłużonej ekspozycji na lek mogą pojawić się efekty awersyjne, które nie występowały podczas początkowego stosowania (np. warunkowe awersje miejscowe, czyli CPA), a które można by wykryć przy użyciu tej techniki. Dodatkowe zastosowania obejmują możliwość przesiewowego wyznaczania subpopulacji najbardziej wrażliwych na uczenie asocjacyjne indukowane sygnałami kokainy, ocenę zmian w zachowaniach motywowanych kokainą zapośredniczonych przez doświadczenie oraz wykrywanie trwałych efektów warunkowania lekowego podczas abstynencji i/lub reinstalacji wywołanej sygnałem. Podsumowując, aparatura i podejście to są efektywne pod względem czasu i kosztów, mogą być wykorzystane do badania szerokiego spektrum zagadnień związanych z nadużywaniem leków oraz zapewniają większą elastyczność w projekcie eksperymentalnym niż same metody CPP lub samopodawania.

Oświadczenia

Produkcja wideo do tego artykułu była sponsorowana przez firmę Med Associate, która produkuje instrumenty wykorzystane w tym artykule.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Leah McAleer za wsparcie w przeprowadzeniu tego eksperymentu oraz pomoc przy prezentacji plakatowej podczas spotkania Society for Neuroscience w 2009 roku i przy produkcji tego filmu, wraz z Mohamedem Abdallą i Allison Ahrens. Dziękujemy również Rosie Maddox, Rachel Chavanie i Lindzie Ju za pomoc w gromadzeniu i analizie danych dla tego eksperymentu. Projekt był wspierany przez grant NIH/NIDA 3R01DA014640-05S1 (C.L.D), stypendium Jones Fellowship w The Waggoner Center for Alcohol and Addiction Research oraz grant szkoleniowy NIH/NIAA AA07471 (A.A.F). Cocaine HCl został hojnie udostępniony przez NIDA Drug Inventory and Supply and Control Program.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do testów warunkowania instrumentalnego (samopodawania leków) dla szczurafigure-materials-1 Med Associates, Inc.MED-08-CT-B1
Podczerwone źródło i detektor (fotokomórki)figure-materials-2 Med Associates, Inc.ENV-253SD ENV-253
Oprogramowanie Med PCfigure-materials-3 Med Associates, Inc.SOF-735
Jednoprędkościowa pompa strzykawkowąRazel Scientific InstrumentsModel R-E
Granulki sacharozy 45 mgBio-ServF042
Kaniula cewnikowaPlastics OneC313G-5UP
KokainaRTI International

Bibliografia

  1. Sanchis-Segura, C., Spanagel, R. Behavioural assessment of drug reinforcement and addictive features in rodents: an overview. Addict Biol. 11 (1), 2-2 (2006).
  2. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade. Addict Biol. 12 (3-4), 227-227 (2007).
  3. Koob, G. F. Psychopharmacology: the fourth generation of progress. Bloom, K. D. , Raven Press. New York. 759-759 (1995).
  4. Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: what does it add to our preclinical understanding of drug reward. Psychopharmacology (Berl). 153 (1), 31-31 (2000).
  5. Panlilio, L. V., Goldberg, S. R. Self-administration of drugs in animals and humans as a model and an investigative tool. Addiction. 102 (12), 1863-1863 (2007).
  6. Stefanski, R. Active versus passive cocaine administration: differences in the neuroadaptive changes in the brain dopaminergic system. Brain Res. 1157, 1-1 (2007).
  7. Miguens, M. Differential cocaine-induced modulation of glutamate and dopamine transporters after contingent and non-contingent administration. Neuropharmacology. 55 (5), 771-771 (2008).
  8. Palamarchouk, V., Smagin, G., Goeders, N. E. Self-administered and passive cocaine infusions produce different effects on corticosterone concentrations in the medial prefrontal cortex (MPC) of rats. Pharmacol Biochem Behav. 94 (1), 163-163 (2009).
  9. Ciano, P. D. i, Blaha, C. D., Phillips, A. G. Conditioned changes in dopamine oxidation currents in the nucleus accumbens of rats by stimuli paired with self-administration or yoked-administration of d-amphetamine. Eur J Neurosci. 10 (3), 1121-1121 (1998).
  10. Twining, R. C., Bolan, M., Grigson, P. S. Yoked delivery of cocaine is aversive and protects against the motivation for drug in rats. Behav Neurosci. 123 (4), 913-913 (2009).
  11. Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-221 (1990).
  12. Schindler, C. W., Panlilio, L. V., Goldberg, S. R. Second-order schedules of drug self-administration in animals. Psychopharmacology (Berl). 163 (3-4), 327-327 (2002).
  13. O'Dell, L. E., Khroyan, T. V., Neisewander, J. L. Dose-dependent characterization of the rewarding and stimulant properties of cocaine following intraperitoneal and intravenous administration in rats. Psychopharmacology (Berl). 123 (2), 144-144 (1996).
  14. Liu, Y., Roberts, D. C., Morgan, D. Sensitization of the reinforcing effects of self-administered cocaine in rats: effects of dose and intravenous injection speed. Eur J Neurosci. 22 (1), 195-195 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Warunkowa preferencja miejscasamopodawaniesamopodawanie kokainykomory operacyjnekanulacja do ylnaprogresywny schemat stosunkutest preferencji bazowejwyniki testu CPPpomiar aktywno ci lokomotorycznej

Powiązane artykuły