Cyfrowe urządzenia mikrolusterkowe (DMD) mogą generować złożone wzory w czasie i przestrzeni, które służą do kontrolowania pobudliwości neuronalnej. Omówiono kwestie związane z projektowaniem, konstrukcją i eksploatacją systemów DMD. Taki system umożliwił wykazanie nieliniowej integracji w obrębie dystalnych punktów rozgałęzień dendrytycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wzorcowa fotostymulacja z wykorzystaniem cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej w obrębie punktów rozgałęzień
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Światło jest wszechstronnym i precyzyjnym narzędziem kontroli pobudliwości neuronalnej. Niedawne wprowadzenie efektorów światłoczułych, takich jak kanalorodopsyna i związane z klatkami (caged) neuroprzekaźniki, doprowadziło do wzrostu zainteresowania opracowaniem lepszych metod kontrolowania wzorców światła w przestrzeni i czasie, które byłyby użyteczne w eksperymentalnej neuronauce. Jedna z konwencjonalnych strategii, stosowana w mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, polega na ogniskowaniu światła w punkcie ograniczonym dyfrakcją, a następnie sekwencyjnym skanowaniu tego pojedynczego punktu w obszarze zainteresowania. Podejście to staje się problematyczne, gdy konieczna jest stymulacja dużych obszarów w krótkim oknie czasowym, co jest bardziej istotne w przypadku fotostymulacji niż obrazowania. Alternatywną strategią jest rzutowanie pełnego wzorca przestrzennego na cel przy użyciu cyfrowego urządzenia mikrolusterek (DMD). Podejście z wykorzystaniem DMD jest atrakcyjne, ponieważ komponenty sprzętowe są stosunkowo niedrogie i wspierane przez komercyjnych dostawców. Ponieważ taki system nie jest dostępny dla mikroskopów pionowych, omówimy kluczowe kwestie konstrukcji i eksploatacji takiego systemu DMD. Chociaż będziemy opisywać głównie konstrukcję systemu do fotolizy UV, przedstawione zostaną również modyfikacje pozwalające na zbudowanie znacznie prostszego systemu światła widzialnego do eksperymentów optogenetycznych. System fotolizy UV został wykorzystany do przeprowadzenia eksperymentów badających fundamentalne pytanie w neuronauce: w jaki sposób integrowane są przestrzennie rozłożone sygnały wejściowe w dystalnych punktach rozgałęzień dendrytycznych. Wyniki sugerują, że integracja w punktach rozgałęzień może być nieliniowa, a supraliniowość jest w dużej mierze zapośredniczona przez receptory NMDA.
Protokół
Ogólne uwagi dotyczące projektu
Jeśli długość fali fotostymulacji mieści się w zakresie widzialnym, jak ma to miejsce w eksperymentach optogenetycznych, układ systemu będzie znacznie prostszy niż w przypadku eksperymentów z fotolizą UV. Wystarczy zakupić moduł podwójnego portu kamery, który jest dostępny u wszystkich producentów mikroskopów. Płaszczyzna DMD może zostać umieszczona w płaszczyźnie obrazu sprzężonej z dowolnym z dwóch portów kamery. Jednak w fotolizie UV światło pochodzące z DMD musi zostać wprowadzone poprzez drogę epiluminacji (Ryc. 3A), ponieważ soczewka tubusowa obrazująca prowadząca do kamery w żadnym z dostępnych komercyjnie mikroskopów nie jest skorygowana dla długości fali UV. Aberracja sferyczna soczewki tubusowej przy 350 nm jest na tyle silna, że uniemożliwia skupienie światła w małym punkcie i uzyskanie wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. Problem ten nie występuje w mikroskopii konfokalnej, ponieważ soczewka tubusowa jest usuwana, gdy kolimowana wiązka laserowa jest wprowadzana wzdłuż tej samej osi optycznej. Problem oświetlenia UV można rozwiązać, wprowadzając światło przez drogę epifluorescencyjną, ponieważ soczewki tubusowe w tym torze są w stopniu częściowym skorygowane pod kątem aberracji sferycznej dla długości fali UV. Możemy rozwinąć opis optyki mikroskopów w takim zakresie, jakiego wymaga czasopismo. Społeczność naukowa zazwyczaj wykazuje duże zainteresowanie tym tematem, a źródeł, które wyjaśniają go w przystępny sposób, jest niewiele.
Aby zminimalizować modyfikacje mikroskopu oraz ze względu na ograniczenia przestrzenne w jednostce epifluorescencyjnej, DMD został umieszczony w nowo utworzonej sprzężonej płaszczyźnie obrazu, stworzonej za pomocą soczewki przekaźnikowej (wskaż położenie jednostki DMD w stosunku do mikroskopu). Zakupiono komercyjną soczewkę przekaźnikową z korekcją UV (Specialty Optics) (wskaż ją na schemacie i na mikroskopie).
Oświetlenie DMD
Po otrzymaniu sygnału wejściowego mikrolustro może przełączyć się między dodatnim a ujemnym pochyleniem o 12° względem płaszczyzny układu. Oś obrotu przebiega wzdłuż przeciwległych narożników każdego lustra (pod kątem 45° do krawędzi układu). Kierunek obrotu lustra jest wyznaczony przez złoty trójkąt znajdujący się w jednym z narożników na przedniej powierzchni układu. Kąt pochylenia mikrolustra determinuje ustawienie kąta nachylenia (pitch) i azymutu przychodzącej wiązki oświetlającej. Kąt nachylenia wiązki oświetlającej musi wynosić 24° względem osi prostopadłej do układu DMD, a azymut musi być prostopadły do osi obrotu lustra. Precyzyjne ustawienie wiązki jest kluczowe dla wydajnej pracy. W systemie prototypowym zaprojektowaliśmy wiele ręcznych regulacji pochylenia, które pozwoliły nam skorygować niedoskonałości konstrukcyjne i obróbcze. Skutkowało to systemem znacznie bardziej masywnym niż był to konieczny. Możliwe jest zastosowanie alternatywnego, bardziej kompaktowego układu doprowadzenia światła (pokazać alternatywną konstrukcję, jeśli zostanie uznana za przydatną).
Do eksperymentów z fotolizy wymagane jest źródło laserowe w celu wytworzenia wiązki o wysokim natężeniu światła i małej średnicy ogniska, co jest niezbędne do szybkiego uwalniania cząsteczek (uncaging). W przypadku eksperymentów optogenetycznych, w których nie jest wymagane światło o wysokim natężeniu i ostrym skupieniu, odpowiednie byłoby niespójne źródło światła. W opisanym tutaj eksperymencie z fotolizy zastosowano quasi-ciągły laser DPSS (diode pumped solid state) z potrojeniem częstotliwości na kryształku NdVO4 (1 W, 35 nm). (Szczegółową dyskusję na temat wyboru źródeł światła do fotolizy przedstawiono w odniesieniu 2). W opisanych tutaj badaniach wymagany jest laser o stosunkowo wysokiej mocy, ponieważ przy zastosowaniu systemu DMD tylko niewielka część mocy wyjściowej lasera dociera do preparatu. Ilość światła dostarczanego do preparatu jest proporcjonalna do stosunku liczby zwierciew w pozycji ON do luster w pozycji OFF w obszarze oświetlanym przez wiązkę lasera.
Jeśli wymagane jest zastosowanie laserowego źródła światła, najlepiej wprowadzić wiązkę lasera do światłowodu wielomodowego, aby można było go łatwo ustawić i zorientować wzdłuż odpowiedniej osi do oświetlenia DMD. Przesyłanie światła przez światłowód rozwiązuje drugi problem: jak wyeliminować wzory plamek (speckle), które są nieodłączną cechą oświetlenia koherentnego. Światłowód jest nawinięty na piezoelektryczny rozciągacz światłowodów (model 915, Canadian Instrumentation & Research, Ltd), który oscyluje z częstotliwością ~40 kHz. (wskazać to w układzie) Mikroskopijne rozciąganie światłowodu jest wystarczające, aby wielokrotnie przemieścić wzór plamek w ciągu milisekundowego czasu trwania każdego impulsu fotostymulacji, co skutecznie eliminuje efekt plamkowania. Wyjście światłowodu jest następnie kolimowane za pomocą obiektywu mikroskopu UV (Olympus DApo20UV). (wskazać to) Kalibracja rozdzielczości optycznej systemu przedstawiona jest na Rys. 3B. Efektywna rozdzielczość fizjologiczna, mierzona jako amplituda przepływu prądu w funkcji położenia punktu fotostymulacji, przedstawiona jest na Rys. 3C. Odpowiedzi prądowe na fotostymulację o różnych intensywnościach zilustrowano na Rys. 3D.
Obsługa systemu:
Współrejestracja pikseli CCD z lustrami DMD
Opracowano wewnętrzne oprogramowanie, które określa odpowiedniość poszczególnych luster DMD względem konkretnych pikseli obrazującej kamery CCD. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) w tym oprogramowaniu pozwala użytkownikowi przypisać lustra DMD odpowiadające obszarowi na obrazie CCD wskazanemu za pomocą myszy. W ten sposób miejsce fotostymulacji można oznaczyć, po prostu przesuwając kursor nad obraz wyświetlony na ekranie komputera i klikając wybrany obszar zainteresowania. (Na ekranie komputera zostanie wyświetlony obraz fluorescencyjny drzewa dendrytycznego. Student zaznaczy na obrazie na ekranie komputera kilka lokalizacji).
Programowanie wzorów dostarczania światła
Wzór zaznaczony przez operatora na ekranie komputera jest zapisywany jako seria oddzielnych obrazów. Następnie czas trwania impulsów laserowych dla każdego wzoru przestrzennego jest programowany w oprogramowaniu zintegrowanym z programem do akwizycji danych (pClamp). (zademonstruj to).
Synchronizacja impulsów laserowych z wzorami DMD
Program do akwizycji danych inicjuje i koordynuje czas działania elektroniki DMD, bramkowanie lasera oraz rejestrację sygnału elektrycznego z neuronu docelowego uzyskanego metodą patch-clamp (symuluj tę sekwencję na komputerze).
Dane eksperymentalne:
Nieliniowe sumowanie w punktach rozgałęzień dystalnych dendrytów
Integrację dendrytyczną z elektrodami tradycyjnie przeprowadzano poprzez zmienianie amplitudy stymulacji w poszczególnych punktach, zamiast rozszerzania obszaru stymulacji przy zachowaniu stałej intensywności. Kwestie związane z nasyceniem elektrogenezy oraz rekrutacją kanałów zależnych od lokalizacji mogą wpływać na wyniki i wnioski. Rozproszoną stymulację dendrytyczną można łatwo zaimplementować, wykorzystując system oparty na DMD (Ryc. 4A). Intensywność wejściową zmieniano poprzez zwiększanie liczby punktów fotostymulacji. Można zauważyć, że sumowanie przestrzenne może być nieliniowe w obrębie punktów rozgałęzień, stając się coraz bardziej supraliniowe wraz ze wzrostem amplitud wejściowych docierających do dwóch gałęzi potomnych. Supraliniowość jest w dużej mierze zapośredniczona przez receptory NMDA, a nie przez kanały sterowane napięciem (Ryc. 5)
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Zasada działania mikrolusterek w DMD. (Widok z boku) Siły elektrostatyczne skierowane na poszczególne lusterka powodują ich nachylenie w jednej z dwóch możliwych orientacji 12° od poziomu. W pozycji ON wiązka padająca jest kierowana wzdłuż osi optycznej prostopadle do chipa. W pozycji OFF wiązka padająca jest kierowana 48° poza osią. Światło, które pada na wąskie szczeliny między lustrami, jest kierowane 24° poza osią. (Widok z góry) nachylenie jest zorientowane 45° w odniesieniu do krawędzi luster i chipu.
Rysunek 2. Podstawowy układ współczesnego mikroskopu fluorescencyjnego. Kostka filtra jest umieszczona w „przestrzeni nieskończonej” pomiędzy obiektywem a soczewką tubusem. Istnieje tor obrazowania prowadzący do kamery oraz tor oświetlenia, który doprowadza światło do preparatu. Soczewki tubusowe dla tych dwóch dróg światła różnią się zazwyczaj konstrukcją i ogniskową. Soczewka tubusowa toru oświetlenia, w przeciwieństwie do toru obrazowania, jest zaprojektowana do pracy w spektrum UV.
Rycina 3. Układ systemu DMD opartego na promieniowaniu UV. Jeśli oświetlenie znajduje się w spektrum UV, musi ono zostać przeprowadzone przez soczewkę tubusową skorygowaną do UV. Soczewka tubusowa w torze obrazowania nie jest przystosowana do promieniowania UV. Niezbędny jest system przekaźnikowy w celu stworzenia łatwo dostępnej sprzężonej płaszczyzny obrazu. Różne sprzężone płaszczyzny obrazu w mikroskopie zostały zaznaczone czerwonymi liniami przerywanymi. Jasne wzory w jednej płaszczyźnie obrazu są rzutowane na inne płaszczyzny sprzężone. Podczas obrazowania wzór w płaszczyźnie próbki jest rzutowany na detektor/kamerę. W przypadku oświetlenia wzór generowany przez DMD jest rzutowany na próbkę.
Rysunek 4. Układ systemu projekcji DMD w świetle widzialnym. Jeśli światło oświetlające znajduje się w zakresie widzialnym, możliwe jest wprowadzenie wzoru świetlnego generowanego przez DMD do ścieżki obrazowania. Można to łatwo zrealizować za pomocą komercyjnych przystawek do podwójnego portu kamery oraz odpowiedniego lustra dichroicznego.
Rysunek 5. Rozdzielczość boczna systemu. (A) Rozdzielczość optyczna na celu fluorescencyjnym wynosi ok.2 μm(B) Efektywna rozdzielczość mierzona poprzez fotolizę klatkowanego glutaminianu w obrębie dendrytu wynosi ~5 μmZwiększona odległość wynika z połączenia dyfuzji glutaminianu oraz ograniczonej szerokości dendrytu. (C) Fotoliza może naśladować kinetykę zdarzeń synaptycznych. Rodzina odpowiedzi prądowych przy zakleszczonym potencjale wynika ze zmienności energii światła dostarczanej do dendrytu.
Rysunek 6. Nieliniowe sumowanie w punktach rozgałęzień dendrytycznych. (A) Rozproszone bodźce wejściowe są przykładane oddzielnie do dwóch gałęzi dendrytycznych. Ich odpowiednie odpowiedzi napięciowe przedstawiono poniżej. (B) Następnie bodźce są podawane jednocześnie. Zmierzona odpowiedź (ślad czerwony) różni się od sumy arytmetycznej dwóch poszczególnych odpowiedzi (ślad szary).
Rysunek 7. Sumowanie supralinearne jest zależne od receptorów NMDA. (A) APV, selektywny antagonista receptorów NMDA, blokuje sumowanie supralinearne. (B) Przedstawiono zależność intensywności bodźca oraz jej wrażliwość na antagonistę receptorów NMDA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zaleta podejścia do fotostymulacji opartej na DMD jest najbardziej widoczna w sytuacjach, gdy cel zajmuje stosunkowo duży obszar. Jeśli interesujący nas cel jest bardzo mały, na przykład składa się z kilku kolców dendrytycznych, lepszym podejściem będą prawdopodobnie sekwencyjne systemy skanowania konfokalnego i dwufotonowego. Jedną z istotnych słabości metody DMD jest nieefektywne wykorzystanie dostępnego światła. Większość dostępnego światła jest nieuchronnie kierowana na lustra w pozycji OFF i nie zostaje wykorzystana...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant RO1 z NIH oraz Merit Reviews z VA Research Service dla C.-M. T., a także indywidualny grant NRSA dla C.W.L.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nowoczesny pionowy mikroskop fluorescencyjny | |||
| Kamera CCD i oprogramowanie do akwizycji obrazu | |||
| Komputer i system interfejsu/akwizycji danych | |||
| Zestaw deweloperski DLP Discovery | |||
| Interfejs USB ALP3 | |||
| S2 + Optyka z LED | |||
| Podwójny moduł portów kamer | |||
| Laser NdVO4 z potrojeniem częstotliwości 355nm (~1 W) | DPSS Laser Inc. | ||
| Przesłona laserowa Model LS6 | Uniblitz | ||
| Wielomodowe światłowody i rozciągacz światłowodów Model# 915 | Canadian Instrument and Research, Ltd | światłowód wielomodowy z rdzeniem 100 um | |
| Wprowadzacz światłowodu wielomodowego | Oz Optics | ||
| Generator sygnałów | do 50 kHz | ||
| Kolimator wiązki | Olympus Corporation | DApo20UV340 | |
| Soczewka przekaźnikowa UV | Special Optics | #: 54-25-60-355 |
Bibliografia
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930-939 (2009).
- Tang, C. Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery. Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).
- Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated. Nature. 456, 826-827 (2008).
- Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. Holographic photolysis of caged neurotransmitters. Nature Methods. 5, 821-827 (2008).
- Hornbeck, L. J. Digital Light Processing and MEMs: An overview. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points
Posted by JoVE Editors on 3/24/2011. Citeable Link.
null
