Wzorzysta fotostymulacja za pomocą cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej między punktami rozgałęzień

Podsumowanie

Cyfrowe urządzenia mikrolustrzane (DMD) mogą generować złożone wzorce w czasie i przestrzeni, za pomocą których można kontrolować pobudliwość neuronów. Omówiono zagadnienia związane z projektowaniem, budową i eksploatacją systemów DMD. Taki system umożliwił zademonstrowanie nieliniowej integracji między dystalnymi punktami rozgałęzień dendrytycznych.

Streszczenie

Światło jest wszechstronnym i precyzyjnym sposobem kontrolowania pobudliwości neuronów. Niedawne wprowadzenie efektorów światłoczułych, takich jak rodopsyna kanałowa i neuroprzekaźniki w klatkach, doprowadziło do zainteresowania opracowaniem lepszych sposobów kontrolowania wzorców światła w przestrzeni i czasie, które są przydatne w neurobiologii eksperymentalnej. Jedną z konwencjonalnych strategii, stosowaną w mikroskopii konfokalnej i 2-fotonowej, jest skupienie światła na punkcie ograniczonym dyfrakcją, a następnie sekwencyjne skanowanie tego pojedynczego punktu w obszarze zainteresowania. Takie podejście staje się problematyczne, jeśli duże obszary muszą być stymulowane w krótkim czasie, co jest problemem bardziej odpowiednim do fotostymulacji niż do obrazowania. Alternatywną strategią jest rzutowanie pełnego wzoru przestrzennego na cel za pomocą cyfrowego urządzenia z mikrolustrem (DMD). Podejście DMD jest atrakcyjne, ponieważ komponenty sprzętowe są stosunkowo niedrogie i są wspierane przez interesy komercyjne. Ponieważ taki system nie jest dostępny dla mikroskopów pionowych, omówimy krytyczne kwestie związane z budową i eksploatacją takiego systemu DMD. Mimo, że będziemy opisywać przede wszystkim budowę systemu do fotolizy UV, to nie zabraknie również modyfikacji do budowy znacznie prostszego systemu światła widzialnego do eksperymentów optogenetycznych. System fotolizy UV został wykorzystany do przeprowadzenia eksperymentów w celu zbadania fundamentalnego pytania w neurobiologii, w jaki sposób przestrzennie rozmieszczone dane wejściowe są zintegrowane w dystalnych punktach rozgałęzień dendrytycznych. Wyniki sugerują, że integracja może być nieliniowa w różnych punktach rozgałęzień, a supraliniowość jest w dużej mierze pośredniczona przez receptory NMDA.

Protokół

Ogólne uwagi projektowe

Jeśli długość fali fotostymulacji mieści się w zakresie widzialnym, na przykład w eksperymentach optogenetycznych, układ systemu będzie znacznie prostszy niż w przypadku eksperymentów z fotolizą UV. Wystarczy zakupić moduł z dwoma portami kamery, który jest dostępny we wszystkich firmach produkujących mikroskopy. Płaszczyzna DMD może być umieszczona na sprzężonej płaszczyźnie obrazu jednego z dwóch portów kamery. Ale w fotolizie UV światło pochodzące z DMD musi być doprowadzone przez ścieżkę epi-oświetlenia (rys. 3A), ponieważ soczewka rurki obrazowej prowadząca do kamery nie jest korygowana pod kątem długości fali UV w żadnym z dostępnych na rynku mikroskopów. Aberracja sferyczna soczewki tuby obrazowej przy długości fali 350 nm jest na tyle poważna, że uniemożliwia skupienie światła w ciasnym miejscu i uzyskanie wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. Ten problem nie występuje w mikroskopii konfokalnej, ponieważ soczewka rurki jest usuwana, gdy skolimowana wiązka laserowa jest wprowadzana wzdłuż tej samej osi optycznej. Problem oświetlenia UV można rozwiązać, wprowadzając światło przez ścieżkę epifluorescencyjną, ponieważ wszystkie soczewki tubusu są częściowo skorygowane pod kątem aberracji sferycznej przy długości fali UV. Możemy rozszerzyć optykę mikroskopów w dowolnym stopniu, w jakim czasopismo sobie tego życzy. Społeczność naukowa na ogół szybko interesuje się tym tematem i nie ma wielu źródeł, które dobrze go uczą.

W celu zminimalizowania modyfikacji mikroskopu i ze względu na ograniczenia przestrzenne w jednostce epi-fluorescencji, DMD jest umieszczany na nowo utworzonej sprzężonej płaszczyźnie obrazu utworzonej przez soczewkę przekaźnikową (zwróć uwagę na położenie jednostki DMD w stosunku do mikroskopu). Zakupiono komercyjną soczewkę przekaźnikową z korekcją UV (Specialty Optics) (wskaż to na schemacie i na mikroskopie).

Oświetlenie DMD

Po otrzymaniu binarnego wejścia, mikrolustro może przełączać się między dodatnim a ujemnym nachyleniem 12° w stosunku do płaszczyzny chipa. Oś obrotu przebiega wzdłuż ukośnych rogów każdego lustra (45° do boków chipa). Orientacja obrotu lustra jest oznaczona złotym trójkątem w jednym rogu na przedniej powierzchni chipa. Kąt nachylenia mikrolustra decyduje o ustawieniu wysokości i azyzmusu wpadającej wiązki świetlnej. Skok wiązki świetlnej musi wynosić 24° od prostopadłej osi układu DMD, a azyzmus musi być prostopadły do osi obrotu lustra. Precyzyjne wyrównanie wiązki ma kluczowe znaczenie dla wydajnej pracy. W prototypowym systemie zaprojektowaliśmy wiele ręcznych regulacji nachylenia, które pozwoliły nam skorygować niedoskonałości konstrukcyjne i obróbcze. W rezultacie system jest znacznie bardziej nieporęczny niż jest to konieczne. Możliwy jest alternatywny, bardziej kompaktowy układ wprowadzania światła (pokaż alternatywny projekt, jeśli zostanie uznany za użyteczny).

Do eksperymentów fotolizy wymagane jest źródło lasera, które generuje skupioną wiązkę o wysokim natężeniu światła, niezbędną do szybkiego rozpakowania. W przypadku eksperymentów optogenetycznych, w których nie jest wymagane ostro skupione światło o dużym natężeniu, wystarczające byłoby niespójne źródło światła. W opisanym tu eksperymencie fotolizy zastosowaliśmy quasi-ciągły laser półprzewodnikowy pompowany diodą (DPSS) o potrojonej częstotliwości NdVO4 (1 W, 355 nm). (Szczegółowe omówienie wyboru źródeł światła do fotolizy znajduje się w odnośniku 2). W opisanych tutaj eksperymentach wymagany jest laser o stosunkowo dużej mocy, ponieważ tylko niewielka część mocy lasera jest faktycznie dostarczana do próbki podczas korzystania z systemu DMD. Ilość światła dostarczanego do próbki jest proporcjonalna do stosunku liczby lusterek ON/OFF w obszarze oświetlonym wiązką laserową.

Jeśli wymagane jest laserowe źródło światła, najlepiej jest uruchomić wyjście lasera do światłowodu wielomodowego, aby można go było łatwo ustawić i ustawić wzdłuż właściwej osi do oświetlenia DMD. Przepuszczanie światła przez światłowód rozwiązuje drugi problem, jak wyeliminować wzory plamek nieodłącznie związane z oświetleniem koherentnym. Włókno jest nawinięte wokół piezoelektrycznego naciągu światłowodowego (model 915, Canadian Instrumentation & Research, Ltd), który oscyluje z częstotliwością ~40 kHz. (wskaż je w zestawieniu) Mikroskopijne rozciągnięcie włókna jest wystarczające, aby wielokrotnie przesunąć wzór plamki w ciągu milisekund trwania każdego impulsu fotostymulacji, skutecznie eliminując w ten sposób efekt plamkowania. Wyjście światłowodu jest następnie kolimowane za pomocą obiektywu mikroskopu UV (Olympus DApo20UV). (zwróć na to uwagę) Kalibrację rozdzielczości optycznej układu przedstawiono na rys. 3B. Efektywną rozdzielczość fizjologiczną mierzoną amplitudą przepływu prądu w funkcji położenia miejsca fotostymulacji przedstawiono na rys. 3C. Obecne reakcje na fotostymulację o różnym natężeniu zilustrowano w Fig. 3D.

Działanie systemu:

Jednoczesna rejestracja pikseli CCD z mirrorami DMD

Napisano wewnętrzne oprogramowanie, które określa zgodność poszczególnych luster DMD z określonymi pikselami kamery CCD do obrazowania. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) w tym oprogramowaniu pozwala użytkownikowi przypisać lustra DMD, które odpowiadają regionowi na obrazie CCD oznaczonym myszą. W ten sposób miejsce stymulacji fotograficznej można oznaczyć, po prostu przesuwając kursor nad obrazem wyświetlanym na ekranie komputera i klikając oznaczony obszar zainteresowania. (Na ekranie komputera zostanie wyświetlony fluorescencyjny obraz altany dendrytycznej. Uczeń zaznacza kilka miejsc na obrazie na ekranie komputera.)

Programowanie wzorców dostarczania światła

Wzór zaznaczony na ekranie komputera przez operatora jest przechowywany jako seria oddzielnych obrazów. Czas impulsów laserowych dla każdego wzorca przestrzennego jest następnie programowany w oprogramowaniu, które jest zintegrowane z programem do akwizycji danych (pClamp). (zademonstruj to).

Koordynacja impulsów laserowych do wzorców DMD

Program do akwizycji danych inicjuje i koordynuje synchronizację elektroniki DMD, bramkowanie lasera oraz akwizycję sygnału elektrycznego z neuronu docelowego. (zasymuluj tę sekwencję na komputerze)

Dane eksperymentalne:

Nieliniowe sumowanie w dystalnych punktach rozgałęzień dendrytycznych

Integracja dendrytyczna z elektrodami tradycyjnie odbywała się poprzez różnicowanie amplitudy stymulacji w dyskretnych miejscach, a nie rozszerzanie obszaru stymulacji przy zachowaniu stałej intensywności. Kwestie związane z nasyceniem elektrogenezy i rekrutacją kanałów zależnych od lokalizacji mogą mieć wpływ na wynik i wnioski. Rozproszona stymulacja dendrytyczna może być łatwo zrealizowana za pomocą systemu opartego na DMD (ryc. 4A). Intensywność danych wejściowych zmieniano poprzez zwiększanie liczby punktów fotostymulacji. Widzimy, że sumowanie przestrzenne może być nieliniowe w punktach rozgałęzień, stając się coraz bardziej supraliniowe wraz ze wzrostem amplitud wejściowych docierających do dwóch gałęzi potomnych. Supraliniowość jest w dużej mierze pośredniczona przez receptory NMDA, a nie przez kanały bramkowane napięciem (ryc. 5)

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Działanie mikroluster w DMD. (Widok z boku) Siły elektrostatyczne skierowane na poszczególne zwierciadła powodują przechylenie lustra w jednej z dwóch możliwych orientacji 12° od poziomu. W pozycji ON wiązka padająca jest kierowana wzdłuż osi optycznej prostopadłej do chipa. W pozycji OFF wiązka padająca jest skierowana pod kątem 48° poza osią. Światło, które pada na cienkie szczeliny między lustrami, jest skierowane pod kątem 24° poza osią. (Widok z góry) nachylenie jest zorientowane pod kątem 45° w stosunku do boków lusterek i chipa.

Rysunek 2. Podstawowy układ nowoczesnego mikroskopu fluorescencyjnego. Kostka filtra jest umieszczona w "przestrzeni nieskończoności" między obiektywem a soczewką tubusu. Istnieje ścieżka obrazowania, która prowadzi do kamery i istnieje ścieżka oświetlenia, która doprowadza światło do próbki. Soczewki tubusu dla tych dwóch ścieżek światła różnią się zazwyczaj konstrukcją i ogniskową. Soczewka tubusu oświetlającego, ale nie obrazowego, jest przeznaczona do pracy w widmie UV.

Rysunek 3. Układ dla systemu DMD opartego na promieniowaniu UV. Jeśli oświetlenie mieści się w widmie UV, należy je przepuścić przez soczewkę tubusu, która jest skorygowana pod kątem UV. Soczewka tubusu w ścieżce obrazowania nie jest przystosowana do promieniowania UV. Do stworzenia łatwo dostępnej sprzężonej płaszczyzny obrazu potrzebny jest system przekaźnikowy. Różne sprzężone płaszczyzny obrazu w mikroskopie są oznaczone przerywanymi czerwonymi liniami. Jasne wzory na jednej płaszczyźnie obrazu są rzutowane na inne płaszczyzny sprzężone. Podczas obrazowania wzór w płaszczyźnie próbki jest rzutowany na detektor/kamerę. W celu oświetlenia wzór generowany przez DMD jest rzutowany na próbkę.

Rysunek 4. Układ systemu projekcyjnego DMD w świetle widzialnym. Jeśli światło świetlne znajduje się w zakresie widzialnym, możliwe jest przeprowadzenie wzoru światła generowanego przez DMD przez ścieżkę światła obrazowania. Można to łatwo zrealizować za pomocą komercyjnych przystawek z dwoma portami kamery i odpowiedniego lustra dichroicznego.

Rysunek 5. Rozdzielczość poprzeczna systemu. (A) Rozdzielczość optyczna na tarczy fluorescencyjnej wynosi ~2 μm. (B) Efektywna rozdzielczość mierzona przez fotolizę glutaminianu w klatce przez dendryt wynosi ~5 μm. Zwiększona odległość wynika z połączenia dyfuzji glutaminianu i skończonej szerokości dendrytu. (C) Fotoliza może naśladować kinetykę zdarzeń synaptycznych. Rodzina odpowiedzi prądowych z napięciem jest spowodowana zmianami energii świetlnej dostarczanej do dendrytu.

Rysunek 6. Nieliniowe sumowanie w punktach rozgałęzień dendrytycznych. (A) Rozproszone dane wejściowe są stosowane oddzielnie do dwóch gałęzi dendrytycznych. Ich odpowiednie odpowiedzi napięciowe są pokazane poniżej. (B) Bodźce są wtedy podawane równocześnie. Zmierzona odpowiedź (czerwony ślad) różni się od sumy arytmetycznej dwóch indywidualnych odpowiedzi (szary ślad).

Rysunek 7. Sumowanie supraliniowe jest zależne od receptora NMDA. (A) APV, selektywny antagonista receptora NMDA, blokuje sumowanie supraliniowe. (B) Wykreślono zależność intensywności bodźca i jego wrażliwość na antagonistę receptora NMDA.

Dyskusja

Zaleta podejścia fotostymulacji opartego na DMD jest najbardziej widoczna w sytuacjach, gdy cel zajmuje stosunkowo duży obszar. Jeśli obiekt zainteresowania jest bardzo mały, taki jak kilka kolców dendrytycznych, lepszym podejściem będą prawdopodobnie sekwencyjne skanowanie konfokalne i systemy 2-fotonowe. Jedną z istotnych słabości podejścia DMD jest nieefektywne wykorzystanie dostępnego światła. Większość dostępnego światła jest siłą rzeczy kierowana do lusterek OFF i nie jest używana.

Syst...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nowoczesny pionowy mikroskop
Kamera CCD i oprogramowanie do
Komputer i system
danych DLP Discovery Developer Kit
ALP3 Interfejs
S2 + Optyka z diodą LED
Podwójny port
Częstotliwość 355 nm potrojony laser NdVO4 (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Migawka laserowa Model LS6	Uniblitz
Światłowód wielomodowy i napinacze światłowodowe Model # 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um rdzeń wielomodowy światłowód
Wyrzutnia światłowodów wielomodowych	Oz Optyka
Generator			do 50 kHz
Kolimator wiązki	Olympus Corporation	DApo20UV340
Soczewka przekaźnika UV	Optyka specjalna	#: 54-25-60-355