Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Podsumowanie

Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.

Streszczenie

Komórki wykształciły zaawansowany aparat molekularny, taki jak białka motorowe kinezyny i filamenty mikrotubul, aby wspierać aktywny wewnątrzkomórkowy transport ładunku. Podczas gdy domena ogona kinezyn wiąże się z różnymi ładunkami, domeny głowy kinezyn wykorzystują energię chemiczną zmagazynowaną w cząsteczkach ATP do przemieszczania się wzdłuż sieci mikrotubul. Długie, sztywne mikrotubule służą jako szlaki dla transportu wewnątrzkomórkowego na duże odległości.

Silniki i filamenty te mogą być również wykorzystywane w mikrofabrykowanych środowiskach syntetycznych jako komponenty wahadłowych transporterów molekularnych ¹. W często stosowanym projekcie silniki kinezynowe są zakotwiczone do powierzchni toru za pomocą swoich ogonów, a funkcjonalizowane mikrotubule służą jako elementy przenoszące ładunek, które są napędzane przez te silniki. Transportery te mogą być ładowane ładunkiem poprzez wykorzystanie silnego i selektywnego wiązania między biotyną a streptawidyną. Kluczowe komponenty (biotynilowana tubulina, streptawidyna i biotynilowany ładunek) są dostępne w sprzedaży.

Opierając się na klasycznym teście ruchliwości w układzie odwróconym ², w niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano konstrukcję wahadeł molekularnych. Białka motorowe kinezyny są adsorbowane na powierzchni uprzednio pokrytej kazeiną; mikrotubule są polimeryzowane z tubuliny biotynilowanej, przytwierdzane do kinezyny, a następnie pokrywane streptawidyną znakowaną rodaminą. Stężenie ATP utrzymuje się na poziomie poniżej nasycenia, aby uzyskać prędkość ślizgania mikrotubul optymalną dla ładowania ładunku ³. Na koniec, jako ładunek, dodaje się biotynilowane nanosfery znakowane fluoresceiną. Nanosfery przyłączają się do mikrotubul w wyniku kolizji między ślizgającymi się mikrotubulami a nanosferami przylegającymi do powierzchni.

Protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby załadować różne ładunki, takie jak biotynilowane DNA⁴, kropki kwantowe ⁵ lub szeroką gamę antygenów za pomocą biotynilowanych przeciwciał ^4-6.

Protokół

1.) Bufor i odczynniki

Roztwory te należy przygotować wcześniej i przechowywać w alikwotach o odpowiedniej wielkości. Alikwot powinien zawierać ilość roztworu wystarczającą do przeprowadzenia typowego eksperymentu, a do każdego testu motywności należy użyć nowej porcji. Warunki przechowywania oraz typowe wielkości alikwotów są opisane w poniższych protokołach.

1. bufor BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA w dejonizowanej wodzie destylowanej (dd), pH skorygowane do 6,9 za pomocą KOH)

• Przygotować 100 mL roztworu zapasowego 0,5 M EGTA w wodzie dd. Dostosować pH do 7,0, używając 2 M roztworu NaOH.
• Przygotować 100 mL roztworu zapasowego 1 M MgCl₂ w wodzie dd. Roztwór poddać autoklawowaniu.
• Dodać 24,2 g PIPES oraz 3,1 g granulek KOH do około 800 mL wody dd i mieszać do rozpuszczenia. Dostosować pH do 6,9, używając 1 M roztworu KOH. Dodać 2 mL roztworu zapasowego 0,5 M EGTA oraz 1 mL roztworu zapasowego 1 M MgCl₂. Dopełnić objętość do 1000 mL wodą dd.
• Rozdzielić na alikwoty do probówek typu Falcon o pojemności 50 mL i zamrozić w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Probówkę z BRB80 aktualnie używaną można przechowywać w temperaturze 4°C lub w temperaturze pokojowej.

2. Chlorek magnezu, MgCl₂ (100 mM w wodzie dd)

• Rozcieńczyć w wodzie dd, aby uzyskać stężenie końcowe 100 mM.
• Rozdzielić na aliquoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

3. Guanozyno-5'-trifosforan, sól sodowa, GTP (25 mM w wodzie dd, pH skorygowane do 7 za pomocą NaOH)

• Odważyć i rozpuścić w wodzie dd, a następnie skorygować pH do 7 za pomocą 2 M roztworu NaOH.
• Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję UV przy 260 nm (używając współczynnika ekstynkcji 11,7 x 103 M⁻¹cm⁻¹).
• Rozdzielić na aliquoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

4. Dimetylosulfoksyd, DMSO

• Rozdzielić na aliquoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

5. Taxol (1 mM w DMSO)

• Odważyć i rozpuścić w DMSO pod wyciągiem tak, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM.
• Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

6. D-(+)-glukoza (2 M w wodzie dd)

• Odważyć i rozpuścić w wodzie dd, aby uzyskać stężenie końcowe 2 M.
• Rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL (objętość 20 μL) i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

7. Oksydaza glukozowa, (2 mg/mL w BRB80)

• Rozpuścić w buforze BRB80, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/mL.
• Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

8. Ditiotreitol, DTT (1 M w wodzie dd)

• Rozpuścić w wodzie dd pod wyciągiem, aby uzyskać stężenie końcowe 1 M.
• Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

9. Katalaza, (0.8 mg/mL w BRB80)

• Rozpuścić w buforze BRB80 w co najmniej dwóch etapach, aby uzyskać końcowe stężenie 0,8 mg/mL. Wyznaczyć stężenie na każdym etapie, mierząc absorbancję UV przy 276 nm i 406 nm (przyjąć współczynnik ekstynkcji 3,1 x 10⁵ M^-1 cm^-1 dla 276 nm oraz 2,2 x 10⁵ M^-1 cm^-1 dla 406 nm i równanie A=cL).
• Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

10. Adenozyno-5'-trifosforan, ATP (100 mM w 100mM MgCl₂)

• Przygotować roztwór stokowy 100 mM MgCl₂ w wodzie dd. Odważyć suchy proszek i rozpuścić w tym roztworze stokowym, aby uzyskać stężenie końcowe 100mM.
• Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję UV przy 260 nm (należy przyjąć współczynnik ekstynkcji 15.4 x 10³ M⁻¹cm⁻¹).
• Rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL w ilościach po 20 μL i przechowywać w temperaturze -20°C do późniejszego użycia.

11. Roztwór kazeiny (20 mg/mL kazeiny w BRB80)

• Do probówki typu falcon o pojemności 50 mL dodać około 3 g kazeiny do 30 mL wody destylowanej (dd water). Mieszać na wortexie przez około 1 godzinę, aż roztwór uzyska gęstą konsystencję.
• Wirować przy około 15000 g przez 30 minut. Przefiltrować nadfiltr przez filtry strzykawkowe o porach 0,5 μm i 0,2 μm.
• Oznaczyć stężenie nadfiltru, mierząc absorbancję UV przy 280 nm (przyjąć współczynnik ekstynkcji 0,67 mL mg^-1 cm^-1). Rozcieńczyć roztwór do stężenia 20 mg/mL w buforze BRB80.
• Podzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłego użycia.

2.) Roztwory standardowe

Należy przygotować je w dniu przeprowadzenia eksperymentu i zutylizować po jego zakończeniu. Przygotuj po 1 mL każdego z nich.

1. BRB80CS0.5

• Rozcieńczyć roztwór kazeiny w buforze BRB80 do stężenia końcowego 0,5 mg/mL i przechowywać w lodzie. Roztwór ten jest wprowadzany do komory przepływowej przed kinezyną i pomaga zachować aktywność kinezyny po adsorpcji na powierzchni.

2. BRB80CA

• Przygotować kazeinę w stężeniu 0,2 mg/mL oraz ATP w stężeniu 1 mM w buforze BRB80 i przechowywać na lodzie. Kinezynę należy dodatkowo rozcieńczyć w tym roztworze przed wprowadzeniem do komory przepływowej.

3. BRB80T

• Rozcień roztwór taxolu w BRB80 do stężenia końcowego 10 μM i przechowuj w temperaturze pokojowej. Roztwór ten służy do stabilizacji mikrotubul.

4. BRB80CT

• Przygotować 10 μM taxolu oraz 0,2 mg/mL kazeiny w buforze BRB80 i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwory te służą do dalszego przygotowania roztworów antyfade oraz mikrotubul.

5. BRB80AF

• Przygotować 20 mM D-glukozy, 20 μg/mL oksydazy glukozowej, 8 μg/mL katalazy, 10 mM DTT oraz 20 μM ATP w buforze BRB80CT i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór ten służy do rozcieńczania streptawidyny i nanokulek oraz do „wypłukiwania” nadmiaru streptawidyny z komory przepływowej. Prędkość kinesyny można kontrolować poprzez dostosowanie stężenia ATP w tym roztworze.

3.) Przygotowanie kinezyny

• Wyrazić konstrukt kinezyny składający się z pełnowymiarowej kinezyny typu dzikiego z Drosophila melanogaster (ciężki łańcuch) oraz His-tagu na C-końcu w Escherichia coli i oczyścić go przy użyciu kolumny Ni-NTA zgodnie z opisem w ⁶.
• Przygotować alikwoty (po 10 μL każda) w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia. Stężenie aktywnej kinezyny w tych alikwotach wynosi około 200 nM.⁷
• W typowym doświadczeniu rozcieńczyć roztwór kinezyny 20-krotnie w BRB80CA. Oznaczyć roztwór jako KIN20 i przechowywać w lodzie.

4.) Przygotowanie mikrotubul

• W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL przygotować 25 μL roztworu wzrostowego: 4 mM MgCl₂, 1 mM GTP oraz 5% DMSO (v/v) w buforze BRB80.
• Dodać 6,25 μL tego roztworu do 20 μg liofilizowanej tubuliny biotynilowanej.
• Wymieszać w wstrząsarze typu vortex, a następnie inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 30 minut w celu polimeryzacji. Rozcieńczyć 100-krotnie w BRB80T i delikatnie wymieszać w vortexie. Oznaczyć roztwór jako MT100 i przechowywać w temperaturze pokojowej.
• Przygotować 10-krotne rozcieńczenie MT100 w BRB80AF. Oznaczyć roztwór jako MT1000.

5.) Roztwór streptawidyny i nanosfer

Przygotować streptawidynę znakowaną AlexaFluor568 w stężeniu 100 nM w BRB80AF. Oznaczyć ją jako STV100 i przechowywać w lodzie. analogicznie rozcieńczyć nanokule 5000-krotnie w roztworze BRB80AF. Oznaczyć je jako NS5000 i przechowywać w lodzie.

6.) Konstrukcja komory przepływowej

Zbuduj komorę przepływową, wykorzystując dwa szkiełka nakrywkowe oddzielone taśmą dwustronną. Komora przepływowa ta ma około 2 cm długości, 1 cm szerokości i 100 μm wysokości, a jej objętość wynosi około 20 μL. Roztwory wprowadza się do komory przepływowej z jednej strony za pomocą pipety, a z drugiej odprowadza za pomocą papieru filtracyjnego.

7.) Montaż odwróconego układu do testu

Powierzchnię szklaną pokrywa się najpierw kazeiną, co pozwala kinezynie zachować funkcjonalność po adsorpcji. Po adsorpcji kinezyny wprowadza się mikrotubule, które są wiązane przez kinezynę. Następnie mikrotubule pokrywa się fluorescencyjną streptawidyną. Po wypłukaniu nadmiaru streptawidyny wprowadza się biotynilowane nanokule polistyrenowe z fluoresceiną (o średnicy 40 nm). Zaadsorbowane na powierzchni stacjonarne nanokule zderzają się z ruchomymi mikrotubulami i zostają na nich osadzone (Rycina 1).

Kolejność przepływu roztworów oraz czas oczekiwania przed wprowadzeniem kolejnego roztworu zostały wymienione poniżej.

• BRB80CS0.5, 5 minut
• KIN20, 5 minut
• MT1000, 5 minut
• STV100, 5 minut
• BRB80AF, 3x
• NS5000

8.) Mikroskopia

Zaraz po wprowadzeniu nanokulek zamocuj komorę przepływową na stoliku mikroskopu. W tym doświadczeniu wykorzystano mikroskop fluorescencyjny Eclipse TE2000-U (Nikon, Melville, NY) wyposażony w obiektyw olejowy 100X (N.A. 1.45), lampę X-cite 120 (EXFO, Ontario, Kanada) oraz kamerę iXon EMCCD (ANDOR, South Windsor, CT). Do obrazowania nanokulek oraz mikrotubul na dolnej powierzchni komór przepływowych odpowiednio użyto kostki filtru FITC (#48001) i kostki filtru TRITC (#48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT). Czas ekspozycji wynosił 0,2 s, natomiast odstęp między ekspozycjami wynosił 2 s.

Rysunek 1. Schematyczny rysunek cząsteczkowych promów.

Dyskusja

Po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji protokół ten był z sukcesem stosowany przez różne grupy badawcze do przygotowywania testów motylości opartych na układzie kinezyna-mikrotubule. 10 mM DTT w końcowym roztworze do testu motylości można zastąpić 0,5% β-merkaptoetanolem. Nie należy używać standardowych roztworów (BRB80AF, KIN20 i MT1000), które zostały przygotowane ponad 2 godziny wcześniej. Jakichkolwiek roztworów zawierających taksol, a zwłaszcza mikrotubule, nie wolno umieszczać na lodzie. Nadmierna ekspozycja komor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenozyno-5’-trifosforan (ATP)	Invitrogen	A1049
Biotynilowana tubulina	Cytoskeleton, Inc.	T333
Kazeina	Sigma-Aldrich	C-0376
Katalaza	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Ditiontreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Glikol etylenowy-bis(2-amino–etyloeter)-N,N,N′,N′-kwas tetraoctowy (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
Biotynilowane mikrosfery FluoSpheres, 40 nm, fluorescencja żółto-zielona (505/515)	Invitrogen	F-8766
Oksydaza glukozowa	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanozyno-5’-trifosforan (GTP)	Roche Group	106399
Chlorek magnezu (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paklitaksel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
Kwas 1,4-piperazynodietanosulfonowy, kwas piperazyno-1,4-bis(2-etanosulfonowy), kwas piperazyno-N,N′-bis(2-etanosulfonowy) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Wodorotlenek potasu (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Koniugat streptawidyny z Alexa Fluor 568	Invitrogen	S11226