Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki wykształciły zaawansowany aparat molekularny, taki jak białka motorowe kinezyny i filamenty mikrotubul, aby wspierać aktywny wewnątrzkomórkowy transport ładunku. Podczas gdy domena ogona kinezyn wiąże się z różnymi ładunkami, domeny głowy kinezyn wykorzystują energię chemiczną zmagazynowaną w cząsteczkach ATP do przemieszczania się wzdłuż sieci mikrotubul. Długie, sztywne mikrotubule służą jako szlaki dla transportu wewnątrzkomórkowego na duże odległości.
Silniki i filamenty te mogą być również wykorzystywane w mikrofabrykowanych środowiskach syntetycznych jako komponenty wahadłowych transporterów molekularnych 1. W często stosowanym projekcie silniki kinezynowe są zakotwiczone do powierzchni toru za pomocą swoich ogonów, a funkcjonalizowane mikrotubule służą jako elementy przenoszące ładunek, które są napędzane przez te silniki. Transportery te mogą być ładowane ładunkiem poprzez wykorzystanie silnego i selektywnego wiązania między biotyną a streptawidyną. Kluczowe komponenty (biotynilowana tubulina, streptawidyna i biotynilowany ładunek) są dostępne w sprzedaży.
Opierając się na klasycznym teście ruchliwości w układzie odwróconym 2, w niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano konstrukcję wahadeł molekularnych. Białka motorowe kinezyny są adsorbowane na powierzchni uprzednio pokrytej kazeiną; mikrotubule są polimeryzowane z tubuliny biotynilowanej, przytwierdzane do kinezyny, a następnie pokrywane streptawidyną znakowaną rodaminą. Stężenie ATP utrzymuje się na poziomie poniżej nasycenia, aby uzyskać prędkość ślizgania mikrotubul optymalną dla ładowania ładunku 3. Na koniec, jako ładunek, dodaje się biotynilowane nanosfery znakowane fluoresceiną. Nanosfery przyłączają się do mikrotubul w wyniku kolizji między ślizgającymi się mikrotubulami a nanosferami przylegającymi do powierzchni.
Protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby załadować różne ładunki, takie jak biotynilowane DNA4, kropki kwantowe 5 lub szeroką gamę antygenów za pomocą biotynilowanych przeciwciał 4-6.
Protokół
1.) Bufory i odczynniki
Roztwory te należy przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w alikwotach o dogodnej objętości. Alikwot powinien zawierać ilość roztworu wystarczającą do przeprowadzenia typowego eksperymentu, a do każdego testu motywności należy użyć świeżej porcji. Warunki przechowywania oraz typowe objętości alikwotów zostały również opisane w poniższych protokołach.
1. Bufor BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA w dejonizowanej wodzie destylowanej (dd), pH skorygowane do 6,9 za pomocą KOH)
- Przygotować 100 mL roztworu zapasu 0,5 M EGTA w wodzie destylowanej (dd water). Dostosować pH do 7,0 przy użyciu 2 M roztworu NaOH.
- Przygotować 100 mL roztworu zapasu 1 M MgCl2 w wodzie destylowanej (dd water). Roztwór poddać autoklawowaniu.
- Dodać 24,2 g PIPES i 3,1 g granulek KOH do około 800 mL wody destylowanej (dd water) i mieszać do rozpuszczenia. Dostosować pH do 6,9 przy użyciu 1 M roztworu KOH. Dodać 2 mL roztworu zapasu 0,5 M EGTA oraz 1 mL roztworu zapasu 1 M MgCl2. Dopełnić objętość do 1000 mL wodą destylowaną (dd water).
- Rozdzielić do probówek typu Falcon o pojemności 50 mL i zamrozić w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Probówka z BRB80 aktualnie używana może być przechowywana w temperaturze 4°C lub w temperaturze pokojowej.
2. Chlorek magnezu, MgCl2 (100 mM w wodzie dd)
- Rozcieńczyć w wodzie dd do uzyskania stężenia końcowego 100 mM.
- Rozdzielić na alikwoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
3. Guanozyno-5'-trifosforan, sól sodowa, GTP (25 mM w wodzie dd, pH skorygowane do 7 za pomocą NaOH)
- Odważyć i rozpuścić w wodzie dd, a następnie dostosować pH do 7 za pomocą 2 M roztworu NaOH.
- Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję UV przy 260 nm. (Należy przyjąć współczynnik ekstynkcji 11.7 x 103 M−1cm−1).
- Rozdzielić na alikwoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrowirówki o pojemności 0.5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
4. Dimetylosulfoksyd, DMSO
- Rozdzielić na alikwoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
5. Taxol (1 mM w DMSO)
- Odważyć i rozpuścić w DMSO pod wyciągiem, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM.
- Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
6. D-(+)-glukoza (2 M w wodzie dd)
- Odważyć i rozpuścić w wodzie dd, aby uzyskać stężenie końcowe 2 M.
- Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
7. Oksydaza glukozowa, (2 mg/mL w BRB80)
- Rozpuścić w BRB80, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mg/mL.
- Rozdzielić na alykwoy (objętość 20 μL) do probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
8. Ditiotreitol, DTT (1 M w wodzie dd)
- Rozpuścić w wodzie dd pod dygestorium, aby uzyskać stężenie końcowe 1 M.
- Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
9. Katalaza, (0.8 mg/mL w BRB80)
- Rozpuścić w buforze BRB80 w co najmniej dwóch etapach, aby uzyskać stężenie końcowe 0.8 mg/mL. Określić stężenie na każdym etapie, mierząc absorbancję UV przy 276 nm i 406 nm (należy zastosować współczynnik ekstynkcji 3.1 x 105 M-1 cm-1 przy 276 nm oraz 2.2 x 105 M-1 cm-1 przy 406 nm oraz równanie A=cL).
- Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
10. Adenozynotrifosforan, ATP (100 mM w 100mM MgCl2)
- Przygotować roztwór zapasowy 100 mM MgCl2 w wodzie dd. Odważyć suchy proszek i rozpuścić go w tym roztworze zapasowym, aby uzyskać stężenie końcowe 100mM.
- Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję UV przy 260 nm. (Przyjąć współczynnik ekstynkcji 15.4 x 103 M−1cm−1).
- Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20°C do późniejszego użycia.
11. Roztwór kazeiny (20 mg/mL kazeiny w BRB80)
- Do probówki typu Falcon o pojemności 50 mL dodać około 3 g kazeiny do 30 mL wody dd. Mieszać w vortexie przez około 1 godzinę, aż roztwór uzyska gęstą konsystencję.
- Wirować przy około 15000 g przez 30 minut. Odfiltrować nadsącz przez filtry strzykawkowe 0,5 μm i 0,2 μm.
- Wyznaczyć stężenie nadsączu, mierząc absorbancję UV przy 280 nm (przyjąć współczynnik ekstynkcji 0,67 mL mg-1 cm-1). Rozcieńczyć roztwór do stężenia 20 mg/mL w buforze BRB80.
- Rozdzielić na alykwoaty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
2.) Roztwory wzorcowe
Należy je przygotować w dniu przeprowadzenia eksperymentu i zutylizować po jego zakończeniu. Przygotować po 1 mL każdego z nich.
1. BRB80CS0.5
- Rozcieńczyć roztwór kazeiny w buforze BRB80 do stężenia końcowego 0,5 mg/mL i przechowywać w lodzie. Roztwór ten wprowadza się do komory przepływowej przed kinezyną, co pomaga zachować aktywność kinezyny po adsorpcji na powierzchni.
2. BRB80CA
- Przygotować kazeinę w stężeniu 0,2 mg/mL oraz ATP w stężeniu 1 mM w buforze BRB80 i przechowywać na lodzie. Kinezynę należy dodatkowo rozcieńczyć w tym roztworze przed wprowadzeniem do celi przepływowej.
3. BRB80T
- Rozcieńczyć roztwór taxolu w buforze BRB80 do stężenia końcowego 10 μM i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór ten służy do stabilizacji mikrotubul.
4. BRB80CT
- Przygotować 10 μM taxolu i 0,2 mg/mL kazeiny w buforze BRB80 i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwory te służą do dalszego przygotowania roztworów antifade oraz mikrotubul.
5. BRB80AF
- Przygotować 20 mM D-glukozy, 20 μg/mL oksydazy glukozowej, 8 μg/mL katalazy, 10 mM DTT oraz 20 μM ATP w buforze BRB80CT i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór ten służy do rozcieńczania streptawidyny i nanokulek oraz do „wypłukania” nadmiaru streptawidyny z komory przepływowej. Prędkość kinezyny można kontrolować poprzez regulację stężenia ATP w tym roztworze.
3.) Przygotowanie kinezyny
- Wyrazić konstrukt kinezyny składający się z pełnowymiarowej kinezyny typu dzikiego Drosophila melanogaster (łańcuch ciężki) oraz His-tagu na końcu C w Escherichia coli, a następnie oczyścić go przy użyciu kolumny Ni-NTA zgodnie z opisem w 6. >
- Przygotować alikwoty (po 10 μL każda) w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia. Stężenie aktywnej kinezyny w tych alikwotach wynosi około 200 nM.7
- W typowym eksperymencie rozcieńczyć roztwór kinezyny 20-krotnie w buforze BRB80CA. Oznaczyć roztwór jako KIN20 i przechowywać w lodzie.
4.) Przygotowanie mikrotubul
- W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL przygotować 25 μL roztworu wzrostowego: 4 mM MgCl2, 1 mM GTP i 5% DMSO (v/v) w buforze BRB80.
- Dodać 6,25 μL tego roztworu do 20 μg liofilizowanej tubuliny biotynilowanej.
- Wymieszać w wortexie, a następnie inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 30 minut w celu polimeryzacji. Rozcieńczyć 100-krotnie w BRB80T i delikatnie wymieszać w wortexie. Oznaczyć roztwór jako MT100 i przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 10-krotne rozcieńczenie MT100 w BRB80AF. Oznaczyć roztwór jako MT1000.
5.) Roztwór streptawidyny i nanokulek
Przygotować streptawidynę znakowaną AlexaFluor568 w stężeniu 100 nM w buforze BRB80AF. Oznaczyć ją jako STV100 i przechowywać w lodzie. W podobny sposób rozcieńczyć nanokulki 5000-krotnie w roztworze BRB80AF. Oznaczyć je jako NS5000 i przechowywać w lodzie.
6.) Konstrukcja komory przepływowej
Zbuduj komorę przepływową, używając dwóch szkiełek podstawkowych oddzielonych taśmą dwustronną. Komora ta ma około 2 cm długości, 1 cm szerokości i 100 μm wysokości, a jej objętość wynosi około 20 μL. Roztwory wprowadza się do komory przepływowej z jednej strony za pomocą pipety i odprowadza z drugiej strony przy użyciu papieru filtracyjnego.
7.) Montaż odwróconego układu testowego
Powierzchnię szklaną pokrywa się najpierw kazeiną, co pozwala kinezynie zachować funkcjonalność po adsorpcji. Po adsorpcji kinezyny wprowadza się mikrotubule, które są wiązane przez kinezynę. Następnie mikrotubule pokrywa się fluorescencyjną streptawidyną. Po wypłukaniu nadmiaru streptawidyny wprowadza się biotinylowane polistyrenowe nanokule fluoresceiny (średnica 40 nm). Zaadsorbowane na powierzchni stacjonarne nanokule zderzają się z poruszającymi się mikrotubulami i zostają na nich osadzone (Rycina 1).
Kolejność przepływu roztworów oraz czas oczekiwania przed wprowadzeniem następnego roztworu są wymienione poniżej.
- BRB80CS0.5, 5 minut
- KIN20, 5 minut
- MT1000, 5 minut
- STV100, 5 minut
- BRB80AF, 3x
- NS5000
8.) Mikroskopia
Kalcę przepływową zamocuj na stoliku mikroskopu natychmiast po wprowadzeniu nanokulek. W tym eksperymencie wykorzystano mikroskop fluorescencyjny Eclipse TE2000-U (Nikon, Melville, NY) wyposażony w obiektyw olejowy 100X (N.A. 1.45), lampę X-cite 120 (EXFO, Ontario, Canada) oraz kamerę iXon EMCCD (ANDOR, South Windsor, CT). Do obrazowania nanokulek i mikrotubul na dolnej powierzchni cel przepływowych odpowiednio użyto kostki filtrów FITC (#48001) i kostki filtrów TRITC (#48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT). Czas ekspozycji wynosił 0.2s, natomiast czas między ekspozycjami wynosił 2 s.
Rycina 1. Schematyczny rysunek czółenek molekularnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji protokół ten był z sukcesem stosowany przez różne grupy badawcze do przygotowywania testów motylości opartych na układzie kinezyna-mikrotubule. 10 mM DTT w końcowym roztworze do testu motylości można zastąpić 0,5% β-merkaptoetanolem. Nie należy używać standardowych roztworów (BRB80AF, KIN20 i MT1000), które zostały przygotowane ponad 2 godziny wcześniej. Jakichkolwiek roztworów zawierających taksol, a zwłaszcza mikrotubule, nie wolno umieszczać na lodzie. Nadmierna ekspozycja komor...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy ogromnie wdzięczni Jonathonowi Howardowi, którego zespół opracował podstawowy protokół analizy motyli ślizgowych, który został następnie przez nas zaadaptowany. Wyrażamy wdzięczność za wsparcie finansowe z grantu NSF DMR0645023.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Adenozyno-5’-trifosforan (ATP) | Invitrogen | A1049 | |
| Biotynilowana tubulina | Cytoskeleton, Inc. | T333 | |
| Kazeina | Sigma-Aldrich | C-0376 | |
| Katalaza | Sigma-Aldrich | C-9322 | |
| D-(+)-Glukoza | Sigma-Aldrich | G-7528 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | |
| Ditiontreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | |
| Glikol etylenowy-bis(2-amino–etyloeter)-N,N,N′,N′-kwas tetraoctowy (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Biotynilowane mikrosfery FluoSpheres, 40 nm, fluorescencja żółto-zielona (505/515) | Invitrogen | F-8766 | |
| Oksydaza glukozowa | Sigma-Aldrich | G-7016 | |
| Guanozyno-5’-trifosforan (GTP) | Roche Group | 106399 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Paklitaksel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | |
| Kwas 1,4-piperazynodietanosulfonowy, kwas piperazyno-1,4-bis(2-etanosulfonowy), kwas piperazyno-N,N′-bis(2-etanosulfonowy) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Wodorotlenek potasu (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | |
| Koniugat streptawidyny z Alexa Fluor 568 | Invitrogen | S11226 |
Bibliografia
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
