Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

1. Generowanie sferoid z linii komórkowej raka jelita grubego

1. Przemyć monowarstwy komórek HCT 116 (stabilnie transdukowane w celu ekspresji klastra różnicowania 19 (CD19) i białka zielonej fluorescencji (GFP)) roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; 5 ml dla kolby o długości 25 cm² lub 10 ml dla kolby o średnicy 75 cm²). Dodać trypsynę (0,5 ml dla kolby o średnicy 25 cm^lub 1 ml dla kolby o średnicy 75^cm2) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
2. Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj enzym dysocjacji komórek za pomocą kompletnego podłoża Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycyna; 10 ml dla 25 cm² lub 20 ml dla kolby 75 cm²).
3. Odwirować zawiesinę komórek w ilości 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą 5 ml kompletnego podłoża RPM1 1640.
4. Policz komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana na kompatybilnym liczniku komórek.
5. Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w pożywce RPMI, aby uzyskać 5 x 10³komórek/ml.
6. Pokryj 96-dołkową okrągłą płytkę dolną 100 μl/basenik 100 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj dwukrotnie PBS i pozostaw płytkę do wyschnięcia.
7. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i dozuj 200 μl/studzienkę do 96-dołkowych okrągłych płytek dennych pokrytych PLL za pomocą pipety wielokanałowej.
8. Przenieść płytkę do automatycznego aparatu do obrazowania wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO₂ , 95% wilgotności).
9. Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji, wybierz Zaplanuj przejęcie | Wystrzel Dodaj statek | Skanuj zgodnie z harmonogramem | Utwórz statek: nowy.
10. Wybierz Typ skanowania: Sferoidalny. Wybierz interesujące Cię kanały: Faza + Jasne Pole (aby śledzić wzrost sferoid), Zielony (aby śledzić sygnał guza, czas akwizycji 300 ms) i Czerwony (aby śledzić apoptozę, czas akwizycji 400 ms).
    1. Wybierz żądane powiększenie: 10x.
    2. Wybierz model płyty i jej położenie w szufladzie. Wybierz położenie studni do zobrazowania. Wprowadź opis eksperymentu: nazwę, typ komórek, liczbę komórek.
11. W ustawieniach analizy wybierz opcję Odłóż analizę na później. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowaniai ustaw Dodaj skany co do 4 godzin i Łącznie do 24 godzin. Ustaw żądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania).
12. Sprawdzaj co 2 dni pod kątem wzrostu sferoid, logując się do oprogramowania do obrazowania.
    1. Wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany i kliknij dwukrotnie żądany eksperyment. Wybierz opcję Jasne pole w panelu kanałów obrazu, a następnie użyj narzędzia Zmierz cechy obrazu, aby zmierzyć średnicę sferoid. Sferoida potrzebuje 6 dni, aby osiągnąć pożądany rozmiar: 0,5 mm średnicy. Dodać 50 μl kompletnej pożywki RPMI na dołek w 4 dniu, aby ograniczyć efekt parowania pożywki.