Artykuł metodologiczny

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

30 kwietnia 2023

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Dillard, P., et al. A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie sferoid z linii komórkowej raka jelita grubego

  1. Przemyć monowarstwy komórek HCT 116 (stabilnie transdukowane w celu ekspresji klastra różnicowania 19 (CD19) i białka zielonej fluorescencji (GFP)) roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; 5 ml dla kolby o długości 25 cm2 lub 10 ml dla kolby o średnicy 75 cm2). Dodać trypsynę (0,5 ml dla kolby o średnicy 25 cmlub 1 ml dla kolby o średnicy 75cm2) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  2. Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj enzym dysocjacji komórek za pomocą kompletnego podłoża Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycyna; 10 ml dla 25 cm2 lub 20 ml dla kolby 75 cm2).
  3. Odwirować zawiesinę komórek w ilości 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą 5 ml kompletnego podłoża RPM1 1640.
  4. Policz komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana na kompatybilnym liczniku komórek.
  5. Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w pożywce RPMI, aby uzyskać 5 x 103komórek/ml.
  6. Pokryj 96-dołkową okrągłą płytkę dolną 100 μl/basenik 100 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj dwukrotnie PBS i pozostaw płytkę do wyschnięcia.
  7. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i dozuj 200 μl/studzienkę do 96-dołkowych okrągłych płytek dennych pokrytych PLL za pomocą pipety wielokanałowej.
  8. Przenieść płytkę do automatycznego aparatu do obrazowania wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności).
  9. Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji, wybierz Zaplanuj przejęcie | Wystrzel Dodaj statek | Skanuj zgodnie z harmonogramem | Utwórz statek: nowy.
  10. Wybierz Typ skanowania: Sferoidalny. Wybierz interesujące Cię kanały: Faza + Jasne Pole (aby śledzić wzrost sferoid), Zielony (aby śledzić sygnał guza, czas akwizycji 300 ms) i Czerwony (aby śledzić apoptozę, czas akwizycji 400 ms).
    1. Wybierz żądane powiększenie: 10x.
    2. Wybierz model płyty i jej położenie w szufladzie. Wybierz położenie studni do zobrazowania. Wprowadź opis eksperymentu: nazwę, typ komórek, liczbę komórek.
  11. W ustawieniach analizy wybierz opcję Odłóż analizę na później. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowaniai ustaw Dodaj skany co do 4 godzin i Łącznie do 24 godzin. Ustaw żądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania).
  12. Sprawdzaj co 2 dni pod kątem wzrostu sferoid, logując się do oprogramowania do obrazowania.
    1. Wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany i kliknij dwukrotnie żądany eksperyment. Wybierz opcję Jasne pole w panelu kanałów obrazu, a następnie użyj narzędzia Zmierz cechy obrazu, aby zmierzyć średnicę sferoid. Sferoida potrzebuje 6 dni, aby osiągnąć pożądany rozmiar: 0,5 mm średnicy. Dodać 50 μl kompletnej pożywki RPMI na dołek w 4 dniu, aby ograniczyć efekt parowania pożywki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSIGMA-ALDRICHD8537-500MLNumer działki: RNBG7037
75 cm² obszar wzrostu kolbyFirma VWR430639Numer serii: 2218002
75 cm² obszar wzrostu kolbyFirma VWRTel. 734-2705Numer serii: 3718006
Trypsyna-EDTASIGM-ALDRICHT3924-100mlNumer serii: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mlTechnologia życiowa (Gibco)21875-091Numer serii: 1926384
GentamycynaTermo Fischer15750060Numer partii: 1904924A
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Termo Fischer15250061Numer serii: 1886513
96 talerz dołkowy, okrągłe dnoFirma VWR734-1797Numer serii: 33117036
X-VIVO 15 z gentamycyną L-Gln, czerwień fenolowa, 1 LBioNordikaBE02-060QNumer serii: 8MB036
Zbiornik na odczynnikiFirma VWRNumer katalogowy: 89094-672Numer partii: 89094-672
15 ml probówekFirma VWR734-1867Numer serii: 19317044
Surowica bydlęcaGibco (firma Gibco)10500064Numer serii: 08Q3066K
HCT 116 Linia raka jelita grubegoKontroler ATCC (Kontroler TZobacz materiał CCL-247-
Incucyte S3Nauki biologiczne w Essen
płodu

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rekhodowla linii kom rkowychp ytki o ultra niskiej adhezjiobrazowanie ywych kom rekliczenie w komorze countingowejwirowanie z osadzaniemobrazowanie w polu jasnymzautomatyzowany aparat obrazuj cykom rki raka jelita grubego

Powiązane artykuły