Ten protokół jest fragmentem z Zhao et al, In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Danio Zebrafish, J. Vis. Exp.(2019).
Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z amerykańskim Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie protokoły na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCLA.
1. Indukcja znieczulenia
- Przygotuj znieczulenie zanurzeniowe w celu kontroli bólu i unieruchomienia ryb, aby uniknąć artefaktów ruchu podczas pozyskiwania danych EKG. Większość laboratoriów stosuje trikainę zanurzeniową (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu, MS-222).
- Aby przygotować 0,4% roztwór podstawowy tricainy, połącz następujące elementy w zakręcanej butelce z ciemnego szkła: 400 mg proszku trikainy, 98 ml podwójnie destylowanej wody i 2 ml 1 M Tris (pH 9). Dostosuj do pH 7,0 za pomocą 1 N NaOH lub 1 N HCl w zależności od potrzeb.
- Aby przygotować końcowy roztwór zanurzeniowy tricaine, określ minimalne stężenie, które jest odpowiednie dla wieku, wielkości, stanu metabolicznego danio pręgowanego, szczepu, modelu choroby, celów naukowych i czasu trwania zabiegu.
- Przeprowadzić badanie zależności od stężenia trikainy, zwiększając lub zmniejszając stężenie w stosunku do zalecanego stężenia 168 mg/l (lub 0,0168%)9, jeśli to konieczne, aby osiągnąć 4. poziom znieczulenia w ciągu 3 minut przy jak najmniejszej toksyczności krążeniowo-oddechowej. Na przykład w tym badaniu zanurzenie danio pręgowanego AB typu dzikiego w wieku 12-18 miesięcy w 0,02-0,04% roztworze tricainy wywoła 4. poziom znieczulenia w ciągu 3 minut
UWAGA: Na 4 poziomie znieczulenia równowaga i napięcie mięśniowe są całkowicie utracone, a szybkość ruchów operkularnych jest zmniejszona.
- W razie potrzeby należy skonsultować się z lekarzem weterynarii w Komitecie ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Stosowania (IACUC) w celu uzyskania dodatkowych wskazówek dotyczących stosowności wyboru środka znieczulającego (środków znieczulających) i drogi podawania.
- Zanurz dorosłego danio pręgowanego w naczyniu zawierającym roztwór trikainy o najniższym z góry określonym i zatwierdzonym przez IACUC stężeniu (np. 0,02-0,04% w tym badaniu), aby wywołać poziom 4 znieczulenia w ciągu 3 minut (ryc. 1).
- W przypadku protokołu EKG dotyczącego przeżycia sesja zapisu EKG powinna być jak najkrótsza (poniżej 10 minut). W przypadku krótkich sesji zapisu EKG trwających krócej niż 15 minut nie jest konieczne podtrzymywanie znieczulenia.
- W przypadku długich, wielogodzinnych sesji zapisu EKG należy użyć długo działającego domięśniowego paralityka i doustnego systemu perfuzyjnego, aby zapewnić wystarczające nawodnienie i dotlenienie.
2. Umieszczenie elektrody EKG
- Gdy danio pręgowany utrzyma 4 poziom znieczulenia przez 3 sekundy, użyj pary kleszczy, aby natychmiast przenieść rybę na wilgotną szczelinę gąbki z brzuszną powierzchnią skierowaną do góry w celu umieszczenia elektrod oprowadzających EKG (ryc. 2).
- Delikatnie włóż trzy elektrody odprowadzające EKG do mięśni ryby na głębokość około 1 mm, aby ustanowić dwubiegunowy przewód w płaszczyźnie czołowej, który jest równoległy do lewej ogonowo-prawej orientacji czaszkowej głównej osi serca.
- Umieść dodatnią (czerwoną) elektrodę w brzusznej linii środkowej na poziomie bulbus arteriosus, tj. 1-2 mm powyżej wyimaginowanej linii łączącej dwie dolne krawędzie wieczków (ryc. 2A).
- Ustawić ujemną (czarną) elektrodę doogonowo i 0,5-1,0 mm w lewo w lewo od elektrody dodatniej, w odległości większej niż maksymalna długość wierzchołkowo-podstawna dorosłej komory zebry (rysunek 2A).
- Ustawić elektrodę odniesienia (zieloną) doogonowo, w pobliżu okolicy odbytu.
UWAGA: Ponieważ główna oś serca różni się nieco w zależności od ryby, aby zmaksymalizować amplitudy fal R i T, dostosuj pozycje prowadzenia, dokonując tylko niewielkich, systematycznych zmian metodą prób i błędów. Na przykład zmieniaj jedną elektrodę (dodatnią lub ujemną) zamiast obu elektrod na raz i wykonuj stopniowe zmiany w jednym określonym kierunku przed zmianą na inny, zamiast dokonywać nieregularnych zmian w losowych kierunkach.
3. Zapis EKG
- Otwórz program do akwizycji danych EKG. Wybierz żądane ustawienie z menu rozwijanych dla zakresu, dolnoprzepustowego i górnoprzepustowego. Na przykład, następujące ustawienie w systemie rejestracji EKG in vivo użytym w tym eksperymencie daje stały, zadowalający stosunek sygnału do szumu dla normalnego dorosłego danio pręgowanego: zakres "2 mV", dolnoprzepustowy "120 Hz" i górnoprzepustowy "0,03 s".
- Naciśnij Start, aby rozpocząć ciągły zapis EKG bez przerw przy częstotliwości próbkowania 1 kHz.
- Aby zoptymalizować pozycjonowanie przewodów w celu uzyskania maksymalnego stosunku sygnału do szumu, naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać zapis EKG i ponownieview zapis EKG wkrótce po pierwszej próbie nagrania dla każdego serca. Aby zdiagnozować, że EKG dorosłego danio pręgowanego jest prawidłowe, upewnij się, że spełnione są wszystkie następujące cztery kryteria walidacyjne (ryc. 3):
- Kryterium 1: Upewnij się, że wszystkie krzywe EKG (P, QRS i T) są wyraźne i łatwo widoczne.
- Kryterium 2: Upewnij się, że fala P jest dodatnia.
- Kryterium 3: Upewnij się, że netto kompleks QRS jest dodatni (tj. amplituda fali R jest większa niż suma amplitud fal Q i S).
- Kryterium 4: Upewnij się, że fala T jest dodatnia.
- Jeśli spodziewane jest prawidłowe EKG, zmień położenie elektrod (najpierw wypróbuj elektrodę ujemną), jeśli to konieczne, aż zostaną spełnione wszystkie cztery kryteria walidacji.
- Jeśli spodziewany jest normalny załamek T, ale załamek T jest zbyt mały, zmień położenie elektrod, aby zmaksymalizować amplitudę fali T.
- Wznów zapis EKG po zoptymalizowaniu pozycjonowania elektrody. Zapisz przemiatanie EKG do późniejszej analizy.
4. Rekonwalescencja po znieczuleniu
- Pod koniec sesji zapisu EKG ostrożnie wyjmij elektrody, nie raniąc ryby. Przenieść rybę do świeżej, natlenionej wody dla ryb wolnej od tricainy.
- Aby ułatwić powrót do zdrowia po znieczuleniu, energicznie spryskuj skrzela wodą za pomocą pipety Pasteura, aż ryba wznowi regularne ruchy skrzeli lub pływanie.
- Monitoruj rybę pod kątem pełnego wyzdrowienia po znieczuleniu (zwykle 1-2 min), na co wskazuje zdolność ryby do pływania w pozycji wyprostowanej przez co najmniej 5 sekund.
