Produkcja transgenicznych Xenopus laevis poprzez integrację za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i transplantację jąder

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo prezentuje metodę generowania transgenicznych Xenopus laevis poprzez wprowadzanie transgenów do jąder plemników, a następnie transplantację jąder do niezapłodnionych komórek jajowych.

Streszczenie

Stabilna integracja sklonowanych produktów genów z genomem Xenopus jest niezbędna do kontroli czasu i miejsca ekspresji, ekspresji genów na późniejszych etapach rozwoju embrionalnego oraz do określenia, w jaki sposób enhancery i promotory regulują ekspresję genów w embrionie. Protokół zaprezentowany w niniejszym materiale może być wykorzystany do wydajnej produkcji transgenicznych embrionów Xenopus laevis. Ta metoda transgenezy składa się z trzech etapów: 1. Jądra plemników są izolowane z jąder dorosłych osobników X. laevis poprzez traktowanie lyzolecytyną, która zwiększa przepuszczalność błony plazmatycznej plemników. 2. Ekstrakt z komórek jajowych jest przygotowywany poprzez wirowanie z niską prędkością, dodanie wapnia w celu wprowadzenia ekstraktu w fazę interfazy cyklu komórkowego oraz wirowanie z wysoką prędkością w celu wyizolowania cytozolu interfazy. 3. Transplantacja jądra: jądra i ekstrakt są łączone z linearyzowanym plazmidowym DNA, który ma zostać wprowadzony jako transgen, oraz niewielką ilością enzymu restrykcyjnego. Podczas krótkiej reakcji ekstrakt z komórek jajowych częściowo dekondensuje chromatynę plemników, a enzym restrykcyjny generuje pęknięcia chromosomowe, które promują rekombinację transgenu w genomie. Przetraktowane jądra plemników są następnie transplantowane do niezapłodnionych komórek jajowych. Integracja transgenu zazwyczaj następuje przed pierwszym podziałem embrionalnym, dzięki czemu powstałe embriony nie są chimeryczne. Embriony te mogą być analizowane bez konieczności hodowli kolejnego pokolenia, co pozwala na wydajne i szybkie generowanie embrionów transgenicznych do analiz funkcji promotorów i genów. Dorosłe osobniki X. laevis uzyskane w wyniku tej procedury przekazują również transgen poprzez linię zarodkową i mogą być wykorzystywane do tworzenia linii zwierząt transgenicznych w wielu celach.

Protokół

Zmodyfikowane wersje tej metody transgenezy zostały początkowo opisane w ¹ oraz ².

A. Przygotowanie jąder plemników

Ta metoda przygotowania jąder komórkowych została zaadaptowana z pracy Murray ³, jednak pominięto inhibitory proteaz, ponieważ zakłócają one późniejszy rozwój jaj z przeszczepionymi jądrami plemnikowymi. Alikwoty są mrożone w temperaturze -80°C i mogą być wykorzystywane do transplantacji przez około 6 miesięcy.

Wszystkie roztwory należy przygotować i umieścić w lodzie przed rozpoczęciem procedury przygotowawczej.

1. Zanurzyć 1-2 dorosłe samce X. laevis w roztworze Tricaine na co najmniej 20 min w celu znieczulenia, a następnie przeprowadzić pithing i usunąć jądra.
2. Przetoczyć jądra na ręczniku papierowym, aby usunąć krew, naczynia krwionośne i ciało tłuszczowe, krótko przemyć je w 60-mm czalce Petriego zawierającej 1XMMR i usunąć wszelkie pozostałe fragmenty ciała tłuszczowego. Należy uważać, aby nie przebić jąder, ponieważ spowoduje to uwolnienie plemników.
3. Przenieść jądra do suchej 60-mm czalki Petriego i rozetrzeć pęsetą, aż do całkowitego zniknięcia widocznych grudek. Macerację należy przeprowadzić jak najdokładniej, aby uzyskać wysoką wydajność jąder komórkowych.
4. Dodać 2mL zimnego buforu do przygotowania jąder (NPB; 1X z roztworu roboczego) do maceratu i delikatnie wymieszać za pomocą pipety (metodą pipetowania w górę i w dół).
5. Przepuścić macerat przez około 4 warstwy gazy na lejku, zbierając go do probówki 15 mL (np. Falcon 2059). Przepłukać czalkę 8mL buforu NPB i przepuścić ten płukanie przez gazę do probówki. Używając rękawiczek, wycisnąć gazę, aby zebrać pozostałą ciecz do probówki.
6. Odwirować plemniki przy 300 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C w rotorze z uchwytami typu swing-out (np. 1480g w rotorze Sorvall HB-4 lub odpowiedniku) z odpowiednimi adapterami do probówek. Odlać nadsącz; dodać 8mL NPB do probówki i resuspender osad za pomocą pipety 10 mL. Ponownie odwirować zgodnie z powyższą procedurą i odlać nadsącz. W czasie wirowania doprowadzić 1mL NPB do temperatury pokojowej.
7. Resuspender osad w 1mL NPB o temperaturze pokojowej przy użyciu końcówki do pipety 1 mL, dodać 50μl świeżo przygotowanej lizolecytyny o stężeniu 10mg/mL, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
8. Dodać do probówki 10 mL zimnego 1XNPB+3%BSA, aby zatrzymać reakcję lizolecytyny, delikatnie wymieszać i odwirować przez 10 min przy 300 rpm w rotorze typu swing-out. Odlać nadsącz. Osad po traktowaniu lizolecytyną powinien wyglądać na nieco bardziej przezroczysty (mniej nieprzejrzyście biały) niż przed traktowaniem.
9. Odlać nadsącz i resuspender osad w 5 mL zimnego NPB+0,3%BSA, delikatnie wymieszać pipetą 10 mL i odwirować przez 10 min przy 30rpm zgodnie z powyższym opisem.
10. Odlać nadsącz i resuspender osad w 50μl buforu do przechowywania plemników, a następnie przenieść do probówki 1,5 mL. Jest to teraz zapas jąder komórkowych. Przechowywać w lodzie podczas sprawdzania wydajności jąder.
11. Aby sprawdzić wydajność jąder, do probówki Eppendorf 1,5mL wprowadzić 98 μl buforu do rozcieńczania plemników (SDB), 1 μl zapasu jąder oraz 1μl roztworu Hoechst w rozcieńczeniu 1:10. Zapas jąder należy bardzo dokładnie wymieszać za pomocą końcówki do pipety z przyciętym końcem (lub o dużym otworze) bezpośrednio przed pobraniem 1 μl. Bardzo dokładnie wymieszać rozcieńczony SDB/Hoechst/jądra i pozwolić niewielkiej ilości cieczy wpłynąć do komory ulepszonej komory Neubauera drogą kapilarną. Policzyć jądra w kwadracie komory pod mikroskopem złożonym. Z jednego samca powinno się uzyskać odczyty na poziomie co najmniej 10-20 (X10⁴ komórek/mL) dla tego rozcieńczenia 1:10, co odpowiada stężeniu zapasu nierozcieńczonego wynoszącemu 1-2X10⁵ komórek/μl. Jeśli zapas jest mniej skoncentrowany, należy pozostawić jądra w osadzie przez kilka godzin, usunąć część nadsączu i ponownie przeliczyć. Pozostawić jądra w temperaturze 4°C przez noc, aby umożliwić przeniknięcie glicerolu dla lepszej krio konserwacji; następnie dokładnie wymieszać zapas jąder końcówką do pipety o dużym otworze, przygotować aliquoty po 20μl i zamrozić w ciekłym azocie.

B. Przygotowanie ekstraktu do szybkiego wirowania

Metoda ta została zaadaptowana z pracy Murray³ i pozwala na otrzymanie wyciągu cytozolowego z fazy interfazy, który stymuluje pęcznienie oraz częściową dekondensację chromatyny dodanych jąder plemników. Wyciąg można zamrozić w małych alikwotach w temperaturze -80°C i rozmrozić przed użyciem.

1. Na 3-5 dni przed wstrzyknięciem HCG, przeprowadź stymulację 8-12 dorosłych samic X. laevis poprzez wstrzyknięcie 50 U PMSG do grzbietowego worka limfatycznego. Wieczorem przed przygotowaniem ekstraktu wstrzyknij każdej żabie 50 jednostek HCG i umieść po 2 żaby na pojemnik w 2 litrach 1XMMR. Ponieważ jedna żaba z lizującymi lub aktywującymi się jajami może zepsuć przygotowanie ekstraktu, zaleca się rozdzielanie żab na pary w celu owulacji.
2. Następnego ranka, przed rozpoczęciem procedury, przygotuj i schłodź wszystkie roztwory. Delikatnie, ręcznie usuń jaja z każdej żaby do dużych zlewków zawierających 1X MMR. Przesiej jaja z każdego pojemnika i odrzuć wszelkie partie jaj wykazujące oznaki marmurkowatości, lizy lub aktywacji (widocznej jako skurcz pigmentacji w hemisferze zwierzęcej). Zbierz nieuszkodzone jaja z równomierną pigmentacją. Dobre jaja można również zebrać z 1X MMR w pojemnikach z żabami. Całkowita objętość jaj od 8-12 samic powinna wynosić >10 mL.
3. Usuń galaretkę z jaj. W tym celu usuń jak najwięcej MMR, dodaj niewielką ilość roztworu cysteiny i zamieszaj jaja. Kilkakrotnie wymień roztwór cysteiny na świeży podczas usuwania galaretki. Usuwaj galaretkę z każdej partii jaj osobno i odrzucaj partie z uszkodzeniami lub aktywacją jaj. Połącz pozostałe jaja.
4. Przemyj jaja czterokrotnie w ~35 mL buforu do ekstraktu (XB), a następnie dwukrotnie w 25 mL CSF-XB z inhibitorami proteaz.
5. Aby upakować jaja: przenieś jaja do probówek Beckman ultraclear. Pozostaw jaja, aby osiadły. Usuń jak najwięcej CSF-XB. Odwirowuj jaja w rotorze Beckman SW 40 Ti (lub podobnym rotorze) przy 10 rpm (150g) przez ~60 s w temperaturze 4°C. Usuń nadmiar roztworu znad upakowanych jaj.
6. Aby rozbić jaja i uzyskać ekstrakt cytoplazmatyczny: odwirowuj jaja przy 10,0 rpm (16,0g) przez 10 min w temperaturze 4°C. Jaja powinny rozdzielić się na trzy warstwy: lipidową (górna), cytoplazmatyczną (środkowa) i żółtkową (dolna). Pobierz warstwę cytoplazmatyczną z każdej probówki za pomocą igły 18G, wprowadzając igłę przez probówkę u podstawy warstwy cytoplazmatycznej. Przenieś cytoplazmę do świeżej probówki ultraclear Beckman na lodzie.
7. Dodaj inhibitory proteaz do wyizolowanej cytoplazmy do stężenia końcowego 1X. Ponownie odwirowuj cytoplazmę przy 16,0g przez 10 min w temperaturze 4°C. Pobierz oczyszczoną cytoplazmę zgodnie z opisem powyżej. Należy spodziewać się uzyskania 0,75-1 mL cytoplazmy z jednej żaby.
8. Dodaj do próbki 1/20 objętości ekstraktu mieszaniny energetycznej (energy mix). Przenieś cytoplazmę do grubościennych probówek z poliwęglanu przeznaczonych do ultrawirowarki Beckman TL-10. Probówki mieszczą około 3 mL każda i powinny być wypełnione co najmniej w połowie.
9. Dodaj 1 M CaCl₂ do każdej probówki do stężenia końcowego 0,4 mM. Inkubuj probówki przez 15 min w temperaturze pokojowej. Inaktywuje to CSF i wprowadza ekstrakt w fazę interfazy.
10. Zrównoważ probówki i odwiruj je w ultrawirowarce Beckman TL-10 przy użyciu rotora TLA-10.3 przy 70,0 rpm (20,0 g) przez 1,5 h w temperaturze 4°C. Cytoplazma rozdzieli się na cztery warstwy, od góry dołu: lipidową, cytozolową, błonową/mitochondrialną oraz glikogenową/rybosomalną.
11. Pobierz warstwę cytozolową z każdej probówki (~1 mL, jeśli do probówki wprowadzono 2-3 mL), wprowadzając strzykawkę do górnej części probówki przez warstwę lipidową. Przenieś frakcję cytozolową do świeżych probówek i ponownie odwiruj próbki przy 70,0 rpm (20,00g) przez 20 min w temperaturze 4°C.
12. Podziel supernatant na aliquoty po 25 µl w probówkach 0,5 mL. Szybko zamroź aliquoty w ciekłym azocie i przechowuj w -80°C do momentu użycia. Aby sprawdzić skuteczność ekstraktu, można inkubować jądra plemników w ekstrakcie i barwić je barwnikiem Hoechst, aby sprawdzić, czy jądra widocznie pęcznieją (stają się grubsze i dłuższe) w ciągu 10 min od dodania w temperaturze pokojowej.

C. Reakcja transgenezy i transfer jąder

Ważne: Przed rozpoczęciem reakcji należy upewnić się, że wszystkie roztwory, sprzęt i żaby są przygotowane. Po rozpoczęciu należy kontynuować reakcję zgodnie z przybliżonym harmonogramem opisanym poniżej, ponieważ wiele komponentów nie pozostaje stabilnych przez czas >30 minut. Podczas gdy zapas jąder plemnikowych jest przechowywany w lodzie, reakcje transgenezy (zarówno rozcieńczone, jak i skoncentrowane) powinny być utrzymywane w temperaturze pokojowej.

1. Przygotowanie samic żab. Wieczorem przed transgeneracją wstrzyknąć kilku (3-5) dorosłym samicom żab 80 jednostek HCG do grzbietowego worka limfatycznego, aby uzyskać świeżo złożone jaja następnego dnia.
2. W dniu procedury transgeneracji przygotować lub doprowadzić do odpowiedniej temperatury roztwory niezbędne do transgeneracji:
   1. Świeżo przygotowana cysteina (2,5% w 1XMMR, pH8,0). Do użytku w danym dniu będzie potrzebne kilkaset mililitrów.
   2. 0,2XMMR+6% Ficoll do naczyń transplantacyjnych i regeneracji embrionów transgenicznych oraz 0,2XMMR+10μg/mL gentamycyny (bez Ficollu) do hodowli embrionów. Roztwory nie powinny być cieplejsze niż 18-21°C, a embriony transgeniczne powinny być hodowane przez wczesne podziały w temperaturach od 16 do 21°C, ponieważ wyższe temperatury niekorzystnie wpływają zarówno na częstotliwość transgeneracji, jak i na rozwój embrionalny.
   3. Rozmrozić i doprowadzić do temperatury pokojowej zamrożone alikwoty SDB (bufor do rozcieńczania plemników) na potrzeby dzisiejszych transplantacji, rozmrozić ekstrakt wysokoprzędkościowy (high speed extract) i umieścić na lodzie oraz przygotować roztwór 10mM MgCl₂.
   4. Przygotować naczynia z agarozą do iniekcji i napełnić je roztworem MMR/Ficoll, a następnie skonfigurować i uruchomić pompę infuzyjną, aby ustabilizować przepływ.
   5. Sprawdzić, czy samice żab składają jaja i czy są one wysokiej jakości. Optymalnie jaja powinny mieć twardą korę (zachowywać kształt po usunięciu galaretki).
3. Przygotowanie reakcji transgeneracji:
   1. Bardzo delikatnie (używając obciętego końcówki pipety) wymieszać zapas jąder komórkowych i połączyć w probówce Eppendorf 1,5mL:
      4μl jąder (~4-8X10⁵ jąder)
      2μl zlinearyzowanego plazmidu (10ng/μl)
      Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. W czasie inkubacji rozcieńczyć 0,5μl enzymu restrykcyjnego w 4,5μl H₂O i dodać 1μl rozcieńczonego enzymu do 18μl SDB, 2μl MgCl₂ oraz 2μl ekstraktu wysokoprzędkościowego. Dodać tę mieszaninę do reakcji jądra-plazmid. Inkubować przez kolejne 10 minut, aby jądra napęczniały.
   3. Podczas tej inkubacji wycisnąć jaja z 2-3 żab i usunąć galaretkę w roztworze cysteiny. Przemyć je dokładnie (5X) za pomocą 1XMMR i za pomocą pipety o szerokim wlocie przenieść 40-50 oczyszczonych jaj do każdego naczynia z dołkami agarozowymi zawierającymi 0,2X MMR +4% Ficoll. Zazwyczaj zajmuje to około 10 minut, więc po przygotowaniu naczyń z jajami reakcja jest zazwyczaj gotowa do rozcieńczenia.
   4. Około 15-20 minut po rozpoczęciu kroku a, delikatnie wymieszać reakcję (jądra/ekstrakt/DNA) obciętą końcówką i dodać około 5μl do 150 μl SDB w temperaturze pokojowej. Jądra w tej rozcieńczonej mieszaninie są stabilne przez około 1 h, podczas gdy w mieszaninie skoncentrowanej nie zachowują zdolności do transplantacji tak długo.
4. Napełnienie igły: Bardzo delikatnie wymieszać przygotowaną powyżej rozcieńczoną reakcję końcówką pipety o szerokim otworze, a następnie niezwłocznie napełnić igłę, ponieważ jądra będą szybko osiadać w probówce. Aby napełnić igłę od tyłu, nałożyć kawałek cienkiej rurki Tygon na koniec obciętej końcówki pipety 20μl. Wciągnąć roztwór do końcówki pipety, a następnie przyłączyć rurkę do igły i pozwolić roztworowi wpłynąć do igły grawitacyjnie lub delikatnie naciskając tłok pipety.
5. Podłączyć igłę do rurki pompy i rozpocząć transplantacje jąder. Iniekcje powinny być szybkie, płytkie i mniej więcej prostopadłe do błony plazmatycznej jaja, aby uniknąć uszkodzeń. Przy sugerowanej szybkości przepływu (10nl/sek), utrzymywać igłę w jajku przez ~0,5 sekundy. Należy ukończyć transplantacje w 1-2 naczyniach w ciągu 20-30 minut.

Po iniekcjach pozostaw szalki w temperaturze 16-20°C, aż embriony osiągną stadium 4-8 komórek. Oddziel embriony ulegające podziałom od tych, które się nie dzielą, przenosząc je (za pomocą szklanej pipety Pasteura o średnicy końcówki zbliżonej do średnicy jaja) do nowej dużej szalki z 0.2XMMR +4% Ficoll. Podziel dzielące się embriony na mniejsze grupy (10-15 embrionów na studzienkę płytki 6-dołkowej) i hoduj w 0.2XMMR (bez Ficoll) +100μg/mL gentamycyny przez wczesne etapy rozwoju. Embriony należy kontrolować podczas gastrulacji, niezwłocznie usuwając obumierające osobniki i wymieniając pożywkę w razie potrzeby.

Rozwiązywanie problemów:

1. Zablokowanie igły: przepływ roztworu z igły powinien być widoczny podczas transplantacji. Jeśli igła zostanie zablokowana przez widoczne cząstki stałe, należy wymienić igłę lub spróbować usunąć zanieczyszczenia, chwytając końcówkę pęsetą i przepychając roztwór przez igłę.
2. Brak jaj dzących się podzielić: należy sprawdzić, czy rozcieńczenia jąder plemników i objętość wstrzykiwania są odpowiednie oraz czy igła nie była zablokowana podczas transplantacji. Jeśli objętość wstrzykiwania jest zbyt wysoka, jaja również mogą nie ulec podziałowi, wykazując zamiast tego odbarwienie pigmentu lub uszkodzenia.
3. Wiele embrionów obumiera podczas gastrulacji. Istnieje kilka czynników, które mogą zwiększyć przeżywalność embrionów:
   1. należy zachować ostrożność przy obchodzeniu się z jądrami podczas przygotowania i reakcji enzymatycznej. Zdekondensowane jądra są kruche i muszą być transplantowane zgodnie z powyższym harmonogramem. Nie należy umieszczać ich na lodzie.
   2. Uszkodzenia chromosomowe jąder plemników powstałe podczas reakcji enzymatycznej i transferu jąder wpływają zarówno na częstotliwość transgenezy, jak i prawidłowy rozwój embrionów. Uszkodzenia chromosomowe jąder zwiększają wydajność transgenezy, ale negatywnie wpływają na przeżywalność i prawidłowy rozwój. Zmniejszenie ilości lub pominięcie enzymu restrykcyjnego podczas inkubacji enzymatycznej może zwiększyć odsetek prawidłowego rozwoju, ale może zmniejszyć częstotliwość transgenezy lub liczbę kopii plazmidu wprowadzonych do genomu embrionu.
   3. Jeśli embriony od późnej blastuli do gastruli wykazują oznaki odbarwienia lub śmierci komórkowej, możliwe jest również, że odczynnik użyty do transplantacji był toksyczny dla jaj. Ponadto, jeśli jaja nie mają zwartej kory, mogą ulec egzogastrulacji i nie wytworzyć prawidłowych embrionów pozagastrulacyjnych.
4. Liczba embrionów wykazujących ekspresję transgenu jest niska. Należy zwiększyć ilość enzymu restrykcyjnego.

Reprezentatywne wyniki dla zarodków transgenicznych

Zarodki transgeniczne uzyskane w wyniku transferu jąder należy hodować do czasu, aż widoczna będzie ekspresja z interesującego nas promotora. Na powyższej Rysunce 1 promotor aktyny mięśniowej steruje ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego w somytach tego transgenicznego kijanki.

Dyskusja

W przypadku każdego konstruktu transgenicznego poddanego badaniu, zazwyczaj transplantujemy jądra do 500-1000 jaj; przy takiej skali możemy generować dziennie embriony transgeniczne wykazujące ekspresję do 10 różnych konstruktów, w zależności od liczby samic indukowanych do składania jaj. Z tych transplantacji około jedna trzecia jaj ulega podziałom, a 60-80% tych dzielących się embrionów prawidłowo przechodzi przez gastrulację. W zależności od zastosowanych warunków reakcji, od 10-50% tych embrionów wykazuje ekspresję i...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A. Przygotowanie jąder plemników
Odczynniki:
1X MMR (2mM CaCl2)2, 5 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM KCl, 1 mM MgCl22, 100 mM NaCl). 0,1% metanosulfonianu trikainy (MS222, ester etylowy kwasu aminobenzoenowego, Sigma A-5040), 0,1% wodorowęglanu sodu. Rozpuścić w wodzie. 2X bufor do przygotowania jąder (Nuclear Preparation Butter, NPB). W dniu przygotowania jąder plemników sporządzić 30 ml 2X NPB z zamrożonych alikwotów roztworów stokowych: 500 mM sacharozy (stok 1,5 M), 30 mM HEPES (stok 1 M; miareczkować KOH do pH 7,7 przy stężeniu 15 mM), 1 mM trihydrochlorku spermidyny (Sigma S-2501; stok 10 mM), 0,4 mM tetrahydrochlorku sperminy (Sigma S-1141; stok 10 mM), 2 mM ditiotreitolu (Sigma D-0632; stok 100 mM), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0). Użyć roztworu 2X NPB do przygotowania: a. 30 ml 1X NPB, b. 10 ml 1X NPB + 3% BSA (frakcja V, Sigma A-7906), c. 5 ml 1X NPB + 0,3% BSA. Lizolecytyna: 100 μl z 10 mg/ml L-α-lizolecytyna, żółtko jaja (Calbiochem, 440154); rozpuścić w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem. Przechowywać zapas w formie stałej w temperaturze 20°C °C. Wyrzucić proszek zapasowy, jeśli stanie się lepki. Albumina surowicy bydlęcej (BSA): 10% (w/v) BSA (frakcja V, Sigma A-7906). Przygotować 5 ml w wodzie w dniu izolacji jąder plemników. Bufor do przechowywania plemników (1 ml): 1X NPB, 30% glicerolu, 0,3% BSA. Bufor do rozcieńczania plemników: 250 mM sacharozy, 75 mM KCl, 0,5 mM trihydrochlorku spermidyny, 0,2 mM tetrahydrochlorku sperminy. Doprowadzić do pH 7,3–7,5 i przechowywać w alikwotach 0,5–1 ml w temperaturze -20°C °C. H–chst nr 33342 (Sigma B-2261): roztwór stokowy 10 mg/ml w dH2O2O, przechowywać w naczyniu chroniącym przed światłem w temperaturze 20°C °C.
Sprzęt:
Rotor z koszyczkami wahadłowymi i wirówka gaza chirurgiczna narzędzia do sekcji (pincety i nożyczki) mikroskop fluorescencyjny lejek rękawiczki komora countingowa (hemocytometr) igły (26 G) ręczniki papierowe szalki Petriego (60 mm) pipety plastikowe (5 i 10 ml) końcówki do Pipetmana (1 ml i 200μl) Strzykawki (1 ml) probówki (14 ml; Falcon, 2059) probówki probówka do mikrocentryfugi (1,5 ml)
B. Przygotowanie ekstraktu metodą wirowania przy wysokich prędkościach
Odczynniki:
1X zmodyfikowany roztwór Ringera według Marca (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl22, 2 mM CaCl22, 5 mM HEPES, pH 7,5. Przygotować roztwór stokowy 10X i dostosować pH do 7,5 za pomocą NaOH. Zasób soli do 20-krotnego buforu do ekstraktu (XB): 2 M KCl, 20 mM MgCl22, 2 mM CaCl22, wysterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C °C. Bufor do ekstrakcji (XB; świeżo przygotowany i przechowywany w lodzie): 1X sole XB, 50 mM sacharozy, 10 mM HEPES (roztwór stokowy 1 M, miareczkowany KOH tak, aby pH wynosiło 7,7 po rozcieńczeniu do 15 mM; wysterylizować przez filtr i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C) °C). Przygotować około 100 ml. 2% (m/v) chlorowodorek L-cysteiny monohydrat: Sporządzić w 1X soli XB przed użyciem i miareczkować do pH 7,8 za pomocą NaOH. Przygotować około 300 ml. CSF-XB: 1X sole XB, 1 mM MgCl22 (oprócz MgCl2)2 obecne w soliach XB; stężenie końcowe 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7,7, 50 mM sacharozy, 5 mM EGTA, pH 7,7. Przygotować 50 ml. Inhibitory proteaz: Mieszanina leupeptyny, chymostatyny i pepstatyny, z których każda została rozpuszczona do stężenia końcowego 10 mg/ml w dimetylosulfoksydzie (DMSO). Przechowywać w małych alikwotach w temperaturze -20°C. °C. 1 M CaCl22. Mieszanina energetyczna: 150 mM fosforanu kreatyny, 20 mM ATP, 20 mM MgCl22. Gonadotropina surowicza klaczy w ciąży (PMSG): PMSG 100 U/ml (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Rozpuścić w wodzie i przechowywać w temperaturze -20°C °C. Gonadotropina kosmórkowa człowieka (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON)®, Intervet, Inc., 057176). Rozpuścić w wodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
Sprzęt:
Xenopus laevis samice Igły (o rozmiarze 18 i 26 G) pipeta Pasteura o szerokim otworze Strzykawki (1 ml) Probówki do mikrowirówki (0,5 ml) Probówki, z grubą ścianką z poliwęglanu (Beckman, 349622) Probówki, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultrawirówka i rotory (np. Beckman TL-100 z rotorami SW 40 Ti i TLA-100.3) Zlewki do zbierania jaj Wiadra lub pojemniki do przetrzymywania samic żab (np. plastikowe zlewki o pojemności 4 l z pokrywami z siatki).
C. Transplantacja jąder.
Odczynniki:
2,5% agarozy w 0,1XMMR (do przygotowania szalek do iniekcji) 2,5% cysteiny w 1XMMR, pH 8,0, przygotowanej w dniu użycia Ficoll 10 mg/ml gentamycyny (stok 1000X) wysokoobrotowy ekstrakt z jajeczek (patrz wyżej) 100 MgCl22 10X MMR (patrz wyżej) Enzym restrykcyjny (np. NotI z New England Biolabs) Bufor do rozcieńczania plemników (SDB; patrz wyżej) oraz jądra plemników (patrz wyżej) Ludzka gonadotropina kosmórkowa (HCG) jak wyżej olej mineralny (Sigma, M8410) Linearyzowany plazmid do wprowadzenia w formie transgenu: przygotować linearyzowany plazmid o stężeniu około 100 ng/μw sterylnym wodzie beznukleazowej (unikamy buforów zawierających Tris i EDTA, które są w pewnym stopniu toksyczne dla embrionów). Enzym restrykcyjny użyty do linearyzacji plazmidu d–nie musi być taki sam, jak ten użyty w reakcji transferu jąder. Zazwyczaj stosujemy NotI we wszystkich reakcjach, niezależnie od tego, za pomocą czego zlinearyzowano plazmid. Może być konieczna kalibracja rozcieńczenia enzymu użytego w reakcji, ponieważ zbyt duża ilość enzymu może wywołać niekorzystne skutki dla rozwoju po gastrulacji. Plazmid można oczyścić na kilka różnych sposobów: zazwyczaj stosujemy zestaw do oczyszczania PCR Qiagen Qiaquick zgodnie z instrukcjami producenta; oczyszczanie pojedynczego prążka z żelu nie jest konieczne. Jeśli plazmid jest oczyszczany za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i wytrącania etanolem, należy upewnić się, że usunięto wszelkie ślady substancji organicznych i etanolu.
Sprzęt:
Szalki agarowe do mikroiniekcji: W plastikowej szalce Petriego o średnicy 60 mm należy umieścić małą łódeczkę wagową o wymiarach 35 mm x 35 mm na roztopionym 2,5% agarozie w wodzie 0,1XMMR, aby utworzyć wgłębienie z dnem pokrytym agarozą, które zostanie wypełnione jajami. Po stwardnieniu agarozy całość należy owinąć folią Parafilm i przechowywać w temperaturze 4°C. °w temperaturze 4°C do momentu użycia. Przygotuj z wyprzedzeniem 2–3 szalki dla każdej planowanej reakcji transgenicznej.
Pompa infuzyjna: Używamy jednostronnej pompy infuzyjnej ze strzykawką firmy Harvard Apparatus, wyposażonej w strzykawkę z igłą o pojemności 3 ml wypełnioną olejem mineralnym (Sigma M-8410). Należy stępić końcówkę igły strzykawki (aby zapobiec przebiciu rurki) i przymocować cienką rurkę tygonową. Pompę należy ustawić na przepływ ok. 10 nl/s; zakłada się przy tym, że czas przebywania igły w każdym jajeczku nie przekroczy 1 s. Przed rozpoczęciem transgenezy w danym dniu pompę należy uruchomić na kilka minut, aby upewnić się, że tłok strzykawki przylega do pistońu, a z rurki wypływa stały, dodatni strumień oleju.
Igły do transferu jąder. Przy użyciu wyciągarki do mikropipet należy przygotować igły z długimi, skośnymi końcówkami. Należy je przyciąć pęsetą pod mikroskopem stereotypowym wyposażonym w mikrometr okularowy, aby uzyskać otwór o średnicy ok. 80 mikronów o skośnym przekroju.
Pozostałe wyposażenie: Xenopus laevis samice, stereomikroskop, inkubator, mikromanipulator, wyciągacz igieł do mikroiniekcji (np. model P-87, Sutter), igły strzykawkowe (rozmiar 26 G), szklane igły do mikroiniekcji, mikrometr okularowy do kalibrowanego przycinania końcówek igieł do mikroiniekcji do 80 μmμśrednica m, szalki Petriego, łódeczki wagowe 35 mm, dreny Tygon (średnica wewnętrzna = 1/32 cala, średnica zewnętrzna = 3/32 cala)